SNAD工艺运行过程中微生物群落结构变化的检测方法

摘要

本发明公开了一种SNAD工艺运行过程中微生物群落结构变化的检测方法，检测方法包括以下步骤：分别在SNAD工艺运行过程中的接种污泥期、亚硝化稳定期、SNAD启动初期、SNAD稳定初期、SNAD稳定期和SNAD稳定后期各取样1次，得到六个泥样；将六个泥样静置10‑15min，去除上清液，离心至少1次，用于去除腐殖质，将离心所得固体提取总细菌DNA，得到六个DNA溶液；进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，获得DGGE条带图谱，得到SNAD工艺运行过程中微生物群落结构变化。本发明的检测方法可以快速高效检测并了解实验周期中各个节点上菌群结构的动态变化。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体来说涉及一种SNAD工艺运行过程中微生物群落结构变化的检测方法。

背景技术

传统生物脱氮工艺处理城市生活污水存在占地面积大、能耗高、外加碳源不足等，既增加了运行费用又增加了运行管理难度。近几年随着微生物学及脱氮工艺运行的深入研究，出现了一些高效低耗的新型生物脱氮工艺，其中厌氧氨氧化技术以其占地空间小、运行费用低等优点受到了广泛的关注。CANNON(completely autotrophic ammoniumremoval over nitrite)工艺可以通过AOB和anammox菌在一个反应器中的相互合作实现总氮的去除，主要用于高氨氮废水处理。最近的研究表明，CANNON工艺也可以在低温 低氨氮废水中实现。高浓度有机物对厌氧氨氧化的生长有一定的抑制作用，但是当有机 物浓度较低时，亚硝化菌、厌氧氨氧化菌、反硝化菌可以在一个反应器中共存。为此， SNAD工艺以SBR反应器为平台，将亚硝化、厌氧氨氧化、反硝化过程相结合，最终形 成同步亚硝化、厌氧氨氧化和反硝化耦合脱氮。

2009年杨凤林等人基于CANON工艺的理论基础，提出了同步亚硝化-厌氧氨氧化-反硝化(SNAD)的概念。SNAD工艺是指在一个反应器中，同时完成亚硝化、厌氧氨氧 化和反硝化的过程，通过控制反应条件，协调亚硝化菌、厌氧氨氧化菌和反硝化菌共同 行使功能，从而达到同时脱氮的目的。

由于传统的培养技术在研究环境工程微生物的多样性和动力学等方面存在着严重的 局限性，使得现在对于污水处理工艺中微生物与处理效果关系性的研究仍处于“黑盒子” 阶段，而近年发展起来的分子生物学技术很好地解决了这一问题。PCR技术应用在污水处理中具有很好的特异性和灵敏性，所以处理操作上相对传统生物防治技术而言更加简便，当然该技术也有一定的局限，在污水检测前要进行重复性酶促，获得DNA扩增，必 要时还要利用到一些修正或联合性衍生技术，保证污水微生物检测的准确性。同时，成 功的PCR实验离不开精准的实验设计和操作流程，PCR实验实施需要经过优化以确保所 有反应参数均设置精确，从而获得准确的结果。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、高效的SNAD工艺运行过程中微生物群落结构变化的检测方法，该检测方法从SNAD工艺启动、调试到基 本进入稳定运行全过程检测微生物群落结构变化，其直接从SNAD工艺运行全过程颗粒 污泥中提取总DNA，然后采用PCR-DGGE技术检测其中的微生物菌群的组成。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。

一种SNAD工艺运行过程中微生物群落结构变化的检测方法，包括以下步骤：

1)分别在SNAD工艺运行过程中的接种污泥期、亚硝化稳定期、SNAD启动初期、SNAD稳定初期、SNAD稳定期和SNAD稳定后期各取样1次，得到六个泥样；

在所述步骤1)中，所述接种污泥期的取样时间为SNAD工艺运行的第1天，所述 亚硝化稳定期的取样时间为SNAD工艺运行的第24-26天，所述SNAD启动初期的取样 时间为SNAD工艺运行的第39-41天，所述SNAD稳定初期的取样时间为SNAD工艺运 行的第49-51天，所述SNAD稳定期的取样时间为SNAD工艺运行的第59-61天，所述 SNAD稳定后期的取样时间为SNAD工艺运行的第73-75天。

2)将步骤1)所得六个泥样静置10-15min，去除上清液，离心至少1次，用于去除 腐殖质，将离心所得固体提取总细菌DNA，得到六个DNA溶液；

在所述步骤2)中，所述离心的时间为5-6min，所述离心的转速为15000-16000rpm。

在所述步骤2)中，所述离心的次数为4～5次。

在所述步骤2)中，所述离心的温度为4-5℃。

3)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中，引物为

F341-GC(5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和EU500(5'-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3')，PCR扩增采用降落式 扩增程序，具体反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃ 延伸1min，共进行20个循环，每个循环降低0.5℃；94℃变性1min，55℃退火1min， 72℃延伸1min，共进行3个循环；72℃延伸10min；

在所述步骤3)中，PCR反应体系为：将5体积份数的10×PCR buffer、4体积份数 的dNTP、1体积份数的F341-GC、1体积份数的EU500、0.5体积份数的Taq DNA聚合 酶和2体积份数的DNA溶液混合，加重蒸水至50体积份数。

4)对PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，获得DGGE条带图谱，得到 SNAD工艺运行过程中微生物群落结构变化。

本发明采用PCR-DGGE分子生物学技术建立了SNAD工艺运行过程中的微生物菌群的检测方法，本发明的检测方法可以快速高效检测并了解实验周期中各个节点上菌群结构的动态变化，并有针对性的对目标序列进行分析，避免了传统培养技术不能分离鉴定 的局限性，能在短时间内得出实验结果，大大减少工作量和工作实践，实验结果真实可 信。

研究SNAD反应器中微生物区系组成、微生物群落结构的演替，找出正常运行时的优 势菌种及微生物群落的变化，能为SNAD颗粒污泥工艺的运行提供重要的理论指导。

附图说明

图1为DNA溶液的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为Marker；

图2为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，0为空白对照；

图3为PCR扩增产物的DGGE电泳图；

图4为总细菌电泳条带相似性比较；

图5为切胶回收后PCR扩增产物的凝胶电泳检测，其中，M为GM331 Marker，0 为阴性对照；

图6为基于16S rDNA序列的污泥中主要菌群的系统发育树；

图7为取样生活污水所在SBR反应器的氮素去除特性；

图8为取样生活污水所在SBR反应器的COD去除特性。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

下述实施例中的药品购买源：上海生工生物工程技术有限公司。

下述实施例中的所涉及仪器的型号和厂家：

超净工作台(VS-1300L-U)，恒温生化培养箱(SHP-250型，上海)，全自动灭菌 锅(MLS-3750型)，超纯水仪(century，Milli-Q)，高速离心机(1-14ED，SIGAMA)， PCR仪(MyiQReal-time，Bio-Rad)，水浴恒温振荡器(DSHZ-300A，江苏)，水平电 泳槽(DYCP-31DN，北京市六一仪器厂)，凝胶成像系统(Gel DocTM XR+，Bio-Rad)， 分析天平(AUY220岛津)，-20℃低温冰箱(海尔)，紫外仪(WB-9403B，北京市六 一仪器厂)。

实施例1

一种SNAD工艺运行过程中微生物群落结构变化的检测方法，包括以下步骤：

1)分别在SNAD工艺运行过程中的接种污泥期、亚硝化稳定期、SNAD启动初期、SNAD稳定初期、SNAD稳定期和SNAD稳定后期各取样1次，得到六个泥样，分别依 次编号为1-6，其中，接种污泥期的取样时间为SNAD工艺运行的第1天，亚硝化稳定 期的取样时间为SNAD工艺运行的第25天，SNAD启动初期的取样时间为SNAD工艺 运行的第40天，SNAD稳定初期的取样时间为SNAD工艺运行的第50天，SNAD稳定 期的取样时间为SNAD工艺运行的第60天，SNAD稳定后期的取样时间为SNAD工艺 运行的第74天。

2)腐殖质是已死的生物体在土壤中经微生物分解而形成的有机物质，为了更好的去 除污泥中的腐殖质，采集1g泥样，在离心管中静沉10min后舍去上清液，用超纯水补充至40mL处，再于4℃以15000rpm离心分离5min，弃上清液，如此重复离心5次，采用 Ezup柱式基因组DNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司)将离心所得固体 提取总细菌DNA，得到六个DNA溶液，每个DNA溶液取5μL用1.2％琼脂糖凝胶检测， 琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，由图可知样品的DNA片段大小为23kb左右，且纯度和 亮度均较好，说明DNA提取较为成功，为下步进行PCR提供较好的模板。

其中，提取总细菌DNA的方法为：称取200mg的离心所得固体，加入400μL 65℃ 预热的Buffer SCL，震荡混匀，置于65℃水浴5min；12000rpm室温离心3min。吸取上 清液至一个干净的1.5mL的离心管中；加入等体积Buffer SP，颠倒混匀，冰浴10min； 12000rpm室温离心3min。吸取上清液至一个干净的1.5mL的离心管中；加入200μL氯 仿，充分混匀，12000rpm离心5min。吸取上层水相至一个干净的1.5mL的离心管中； 加入1.5倍体积(900μL)的Buffer SB，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中， 室温静置2min。12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入 700μL Wash Solution，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中， 加入300μL WashSolution，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集 管中，12000rpm离心2min；取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，在吸附膜中 央加入75μL TE Buffer，静置3min，12000rpm离心2min，得到的DNA溶液置于-20℃保 存或直接用于后续试验。

3)每个DNA溶液取0.3g进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR扩增产物用1.2％ 的琼脂糖凝胶电泳检测，其琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，由图可知扩增片段大小在 240bp左右，证实为扩增的目的条带，且条带单一无非特异性扩增。其中，引物为对大多 数细菌16SrDNA基因V3区具有特异性的 F341-GC(5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGG AGGCAGCAG-3')和EU500(5'-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3')，PCR扩增采用降落式 扩增程序，具体反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃ 延伸1min，共进行20个循环，每个循环降低0.5℃；94℃变性1min，55℃退火1min， 72℃延伸1min，共进行3个循环；72℃延伸10min；

PCR反应体系为：将5μL的10×PCR buffer、4μL的dNTP(dNTP中dATP、dTTP、 dCTP和dGTP的浓度各2.5mmolL

4)采用Bio-Rad DCodeTM DGGE系统对PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，获得DGGE条带图谱，DGGE电泳图如图3所示，得到SNAD工艺运行过程 中微生物群落结构变化。

对PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳的方法为：用梯度混合装置制备8％的聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺凝胶的变性范围为35％-55％(100％的变性剂为7mol·L

为了解总细菌群落结构在SNAD工艺培养驯化过程中的动态变化情况，对DGGE条带图谱中各时期总细菌种群的相似性进行了分析，见图4。由相似性的顺序分布图可以看出，各泳道与泳道6的相似性数值基本符合培养驯化的过程，说明污泥培养驯化是一个 逐步有序的过程，微生物逐渐演变进入正常运行的状态。

用灭菌刀片切取DGGE胶上主要的独立16S rDNA条带并置于1.5mL离心管中，加 入50μL已灭菌的超纯水，将离心管于4℃下静置过夜，取2μL的浸出液作为模板，进行 PCR扩增。切胶回收后PCR扩增所用引物为：F357：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 和R518：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’，扩增产物片段长约200bp。PCR反应程序为： 94℃下预变性5min；然后30个循环：94℃1min，55℃1min，72℃1min；最后在72℃ 下延伸8min。切胶回收后PCR扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测如图5所示。

将DGGE图谱的条带切胶回收后所得DNA的PCR产物进行克隆，克隆子送交生物 技术公司进行测序，23个DNA样品有10个样品(条带L1、L2、L3、L4、L6、L7、L9、 L14、L16和L22)测序成功，将测序所得基因序列输入到NCBI网站，利用BLAST程 序与数据库中已有的序列进行比对分析，同时用MEGA4软件构建进化树，算法为邻位 相接法(neighbor-joining-analysis)，所得进化树见图6。

对总细菌的部分优势菌种进行切胶回收克隆测序和系统发育树分析，优势菌群主要 有β-变形菌(β-Proteobacteria)、γ-变形菌(γ-Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、 拟杆菌(Bacteroidetes)和未培养菌(Uncultured bacterium)。微生物分布较为广泛，主 要优势菌种分布于不同的纲，已经检测出的菌种中β-变形菌略多并保持着较为稳定的优 势地位，而随着反应器的运行，厚壁菌、γ-变形菌和拟杆菌等次级种群得到强化，成为 新的优势群落，为提高SNAD颗粒污泥培养驯化效率和优化运行参数提供了一定的理论 依据。

对比例1

对比例1的步骤1)～3)与实施例1中检测方法的步骤1)～3)基本相同，唯一不同之处仅在于对比例1中步骤3)中的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min， 65℃退火1min，72℃延伸1min，共进行25个循环；72℃延伸10min。

使用1.2％琼脂糖凝胶对对比例1的PCR扩增产物在Bio-Rad水平电泳仪中进行电泳 检测，PCR扩增产物跑胶无条带。

上述实施例和对比例步骤1)中取样的为生活污水，生活污水的水质指标如表1所示。 泥样取自于厌氧氨氧化固定床反应器下部的厌氧氨氧化颗粒污泥。

表1

生活污水SNAD颗粒污泥工艺启动驯化过程中NH

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下， 任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落 入本发明的保护范围。