博落回提取物作为JNK-MAPK信号通路抑制剂及其应用

摘要

本发明涉及博落回提取物作为JNK‑MAPK信号通路抑制剂及其应用，博落回提取物具有JNK抑制作用，可通过抑制JNK‑MAPK信号通路而下调促炎因子TNF‑α、IFN‑γ的mRNA和蛋白的表达，缓解炎症反应，减少炎症造成的损伤。博落回提取物可应用于制备防治仔猪肠炎相关药物。本发明的有益效果为，1)本发明首次证实了博落回提取物抑制了IPEC‑J2细胞JNK‑MAPK信号通路。2)本发明包括利用抑制JNK‑MAPK信号通路降低促炎介质表达的原理方法生产制造相关抗炎药品。3)本发明为后期开展与JNK‑MAPK信号通路相关的抗炎因子、抗炎对象进行更深层次的研究奠定了坚实的理论基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物、医药技术领域，尤其是涉及一种基于博落回提取物作为JNK-MAPK信号通路抑制剂、应用技术领域。

背景技术

组织损伤和微生物入侵等可引起机体炎症，炎症反应是机体免疫系统对外界刺激的防御性反应，是许多病理生理过程的重要组成部分。炎症反应通常是自限性的，并在促炎信号和抗炎信号之间保持平衡。充分的炎症反应可以让机体远离严重的组织损伤，但长期升高的炎症介质水平可导致机体信号通路受损，促进病原体入侵和疾病的发生，过度的炎症对宿主有潜在的危险。为了维持免疫稳态，控制炎症反应对宿主避免组织损伤至关重要。

肠道上皮细胞可以吸收水分和营养物质，并作为抵抗微生物的第一道屏障，还可以诱导和调节免疫反应。来源于空肠的非瘤猪肠上皮细胞系(Porcine intestinalepithelial cell line J2，IPEC-J2)与原始组织有很强的相似性，适用于初步研究，是一种被广泛接受的肠道体外模型。脂多糖(LPS)是一种内毒素，由革兰氏阴性菌产生，能够通过激活多种信号通路来诱导免疫紊乱，研究人员经常使用它来诱导炎症反应。

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK)是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。MAPK信号通路被认为是与调节炎症介质相关的真核细胞信号传输网络的一部分，是调节炎症反应的经典信号通路。MAPKs蛋白(包括ERK、JNK和p38蛋白激酶)被激活后作用于各自的底物，产生炎症因子，调节炎症反应。细胞因子在调节炎症反应中起着至关重要的作用。促炎细胞因子如TNF-α、IFN-γ是重要的炎症反应介质，可提高内皮细胞通透性，加速细胞凋亡，引发炎症级联反应，导致器官功能障碍，直接或间接地参与一系列病理过程，在先天性免疫反应中发挥重要作用。

博落回(Macleaya cordata)是一种世界范围内广泛使用的药用植物，其药用历史有1000多年。博落回的主要活性成分为生物碱。目前，已从博落回中鉴定或分离出超过147种生物碱，包括血根碱(Sanguinarine，SA)、白屈菜红碱(Chelerythrine，CHE)、原阿片碱(Protopine，PRO)、别隐品碱(Allocryptopine，ALL)、小檗碱(Berberine，BER)等，根据化学结构，它们大多属于异喹啉类生物碱。长久以来大量的研究发现博落回提取物(Macleayacordata extract，MCE)及其有效成分具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、杀虫、保护肝脏、提高免疫力等多种作用功效。虽然MCE已被证实具有抗炎活性，但MCE抗炎活性的作用机制尚不完全清楚。目前对MCE或其活性成分抗炎机制的研究报道较少，并且研究的内容多数集中在NF-κB信号通路，对MAPK信号通路的研究报告相对更少，对博落回提取物通过抑制JNK-MAPK信号通路进行仔猪肠炎防治方面的研究尚未见报道。

发明内容

为了研究MCE作为JNK-MAPK信号通路抑制剂在制备防治仔猪肠炎药物方面的应用，本研究利用LPS诱导的IPEC-J2细胞作为炎症模型，研究MCE的抗炎活性及其对JNK-MAPK信号通路的抑制作用。本发明提供一种博落回提取物作为JNK-MAPK信号通路抑制剂及其应用。此外，本发明还提供一种具有抗炎活性的JNK-MAPK通路抑制剂潜在物质的体外筛选方法。

本发明采用如下技术方案实现。

一种信号通路抑制剂，本发明所述的信号通路抑制剂为基于博落回提取物作为JNK-MAPK信号通路抑制剂。

本发明所述的博落回提取物来源于罂粟科植物博落回，从博落回的地上部分干燥之后提取制备而成。

本发明所述的信号通路抑制剂的应用为，制造抗炎药物。

本发明的应用包括制造通过抑制JNK-MAPK信号通路从而降低促炎介质表达的药物。

本发明的应用包括制造抑制促炎介质释放而发挥抗炎作用的药物。

本发明所述的应用所针对的促炎介质为TNF-α、IFN-γ。

本发明所述的应用所针对的炎症为由LPS诱导产生的仔猪肠道炎症。

体外筛选具有抗炎活性的JNK-MAPK通路抑制剂潜在物质的方法，包括步骤：

(1)试验分组为对照组，炎症模型组，试验组；对照组即正常条件下培养的细胞组；炎症模型组即通过用LPS刺激细胞，引起促炎症因子升高等炎症反应的细胞组；试验组即分别向炎症细胞模型中加入不同浓度的待检测物质的细胞组；

(2)分别检测各组样本中炎性因子表达水平和JNK-MAPK蛋白磷酸化水平；如果与炎症模型组的样本相比，加入了待检测的物质的样本中促炎因子表达水平降低，则该物质是具有抗炎活性的潜在物质；如果加入了待检测的物质的样本中JNK-MAPK蛋白的磷酸化水平也降低，则是潜在的具有抗炎活性的JNK-MAPK信号通路抑制剂。

本发明的有益效果为，1)本发明首次证实了博落回提取物抑制了IPEC-J2细胞JNK-MAPK信号通路。2)本发明包括利用抑制JNK-MAPK信号通路降低促炎介质表达的原理方法生产制造相关抗炎药品。3)本发明为后期开展与JNK-MAPK信号通路相关的抗炎因子、抗炎对象进行更深层次的研究奠定了坚实的理论基础。

下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1不同浓度MCE对IPEC-J2细胞活力的影响；其中，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或字母完全相同表示差异不显著(P>0.05)。

图2不同浓度MCE对LPS处理IPEC-J2细胞TNF-α分泌量的影响；其中，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或字母完全相同表示差异不显著(P>0.05)。

图3不同浓度MCE对LPS处理IPEC-J2细胞IFN-γ分泌量的影响；其中，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或字母完全相同表示差异不显著(P>0.05)。

图4不同浓度MCE对LPS处理IPEC-J2细胞TNF-αmRNA表达的影响；其中，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或字母完全相同表示差异不显著(P>0.05)。

图5不同浓度MCE对LPS处理IPEC-J2细胞IFN-γmRNA表达的影响；其中，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或字母完全相同表示差异不显著(P>0.05)。

图6不同浓度MCE对LPS处理IPEC-J2细胞JNK蛋白磷酸化的影响；其中，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或字母完全相同表示差异不显著(P>0.05)。

图7不同浓度MCE对LPS处理IPEC-J2细胞JNK蛋白表达的影响。

图8特异性抑制剂抑制JNK-MAPK信号通路后MCE对LPS诱导的IPEC-J2细胞TNF-α、IFN-γmRNA表达的影响；其中，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或字母完全相同表示差异不显著(P>0.05)。

具体实施方式

一种信号通路抑制剂，本发明所述的信号通路抑制剂为基于博落回提取物作为JNK-MAPK信号通路抑制剂。

本发明所述的博落回提取物来源于罂粟科植物博落回，从博落回的地上部分干燥之后提取制备而成。

本发明所述的信号通路抑制剂的应用为，制造抗炎药物。

本发明的应用包括制造通过抑制JNK-MAPK信号通路从而降低促炎介质表达的药物。

本发明的应用包括制造抑制促炎介质释放而发挥抗炎作用的药物。

本发明所述的应用所针对的促炎介质为TNF-α、IFN-γ。

本发明所述的应用所针对的炎症为由LPS诱导产生的仔猪肠道炎症。

体外筛选具有抗炎活性的JNK-MAPK通路抑制剂潜在物质的方法，包括步骤：

(1)试验分组为对照组，炎症模型组，试验组；对照组即正常条件下培养的细胞组；炎症模型组即通过用LPS刺激细胞，引起促炎症因子升高等炎症反应的细胞组；试验组即分别向炎症细胞模型中加入不同浓度的待检测物质的细胞组；

(2)分别检测各组样本中炎性因子表达水平和JNK-MAPK蛋白磷酸化水平；如果与炎症模型组的样本相比，加入了待检测的物质的样本中促炎因子表达水平降低，则该物质是具有抗炎活性的潜在物质；如果加入了待检测的物质的样本中JNK-MAPK蛋白的磷酸化水平也降低，则是潜在的具有抗炎活性的JNK-MAPK信号通路抑制剂。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：MCE对IPEC-J2细胞增殖的影响

(1)实验材料

实验细胞株：猪小肠上皮细胞IPEC-J2，购自北京北纳创联生物技术研究院。

MCE：由本试验团队从博落回干燥之后的地上部分提取，经高效液相色谱法测定，其中的血根碱与白屈菜红碱含量分别为45％和19％；EDTA、Tris-HCl、PBS、DMEM、MTT、DMSO、BSA、RIPA、青霉素和链霉素(P/S)和胰蛋白酶溶液，购自Solarbio；胎牛血清(FBS)购自Gibco；实验仪器：多功能全波长酶标仪(美国BioTek，Synergy HT)，二氧化碳培养箱(Thermo SCIENTIFIC，3311)。

(2)实验方法

细胞培养基由DMEM、10％胎牛血清和1％抗生素组成，细胞在37℃含5％CO

统计与数据分析：所有试验数据用Excel 2007软件进行初步整理后，采用SPSS19.0软件的One-WayANOVA进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，差异显著时用Duncan法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

(3)实验结果

由图1可知，1μg/mL的LPS处理IPEC-J2细胞的细胞活力与对照组无显著差异(P>0.05)。50ng/mL、100ng/mL、150ng/mLMCE对IPEC-J2细胞活力与对照组、LPS组也无显著差异(P>0.05)。由此可见LPS处理、MCE对细胞增殖无显著性影响，不会对细胞造成严重损害。

实施例2：MCE对LPS处理的IPEC-J2细胞培养上清液中炎性因子含量的影响

(1)实验材料

实验细胞株：猪小肠上皮细胞IPEC-J2，购自北京北纳创联生物技术研究院。

MCE：由本试验团队从博落回干燥之后的地上部分提取，经高效液相色谱法测定，其中的血根碱与白屈菜红碱含量分别为45％和19％。；EDTA、Tris-HCl、PBS、DMEM、MTT、DMSO、BSA、RIPA、青霉素和链霉素(P/S)和胰蛋白酶溶液，购自Solarbio；胎牛血清(FBS)购自Gibco；TNF-α、IFN-γELISA试剂盒，购自酶免实业有限公司；

检测实验仪器：多功能全波长酶标仪(美国BioTek，Synergy HT)，二氧化碳培养箱(Thermo SCIENTIFIC，3311)。

(2)实验方法

将IPEC-J2细胞按每孔1×10

收集细胞培养液上清，上清中的TNF-α、IFN-γ测定步骤参照酶联免疫吸附试验试剂盒的操作说明进行。

统计与数据分析：所有试验数据用Excel 2007软件进行初步整理后，采用SPSS19.0软件的One-WayANOVA进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，差异显著时用Duncan法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

(3)实验结果

由图2，3可知，1μg/mL的LPS处理IPEC-J2细胞后，细胞培养液上清中的TNF-α、IFN-γ含量极显著上升(P<0.01)；与LPS组相比，50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL MCE极显著降低了TNF-α、IFN-γ含量(P<0.01)。随着MCE浓度升高，促炎因子TNF-α、IFN-γ含量逐渐降低，呈现浓度依赖关系。结果说明MCE可以降低由LPS引起的IPEC-J2细胞培养上清液中的炎性因子的表达。

实施例3：MCE对LPS处理的IPEC-J2细胞炎性因子mRNA表达及JNK蛋白磷酸化水平的影响

(1)实验材料

实验细胞株：猪小肠上皮细胞IPEC-J2，购自北京北纳创联生物技术研究院。

MCE：由本试验团队从博落回干燥之后的地上部分提取，经高效液相色谱法测定，其中的血根碱与白屈菜红碱含量分别为45％和19％。；

β-actin(#MA5-15739)，购自Invitrogen；p-JNK(#9251)，JNK(#9252)购自CellSignaling Technology；增强型化学发光(ECL)检测试剂，购自Biosharp；EDTA、Tris-HCl、PBS、DMEM、DMSO、BSA、RIPA、青霉素和链霉素(P/S)和胰蛋白酶溶液，购自Solarbio；胎牛血清(FBS)购自Gibco；PVDF膜，购自Merck Millipore；细胞总RNA提取试剂盒，购自TaKaRa；RNA反转录试剂盒，购自PrimeScript

检测实验仪器：二氧化碳培养箱(Thermo SCIENTIFIC，3311)，电泳仪、电泳槽、转膜仪(Bio-Rad，Mini-PROTEAN Tetra)，全波长分光光度计(Thermo SCIENTIFIC，NanoDrop1000)，荧光PCR仪(Applied Biosystems，StepOnePlus)。

(2)实验方法

细胞按实施例2进行处理，吸弃培养基，收集细胞。

按照细胞总RNA提取试剂盒的操作步骤提取细胞总RNA，检测其浓度。

按照RNA反转录试剂盒操作步骤进行反转录，用于后续荧光定量PCR试验。

荧光定量PCR试验步骤如下：

参照NCBI普通猪的相关基因序列，利用Primer 5.0软件进行引物设计，并用Primer-Blast确认引物的特异性，由擎科生物科技有限公司合成引物。实时荧光定量PCR引物信息见表1。

表1RT-PCR引物信息

Table 1Information ofprimers sued for RT-PCR

按表2冰上配制反应混合液。

表2反应体系C组成

Table 2Composition ofreaction system C

反应条件：使用Appliedbiosystems StepOnePlus PCR仪，进行Real Time PCR，反应程序设置为，预变性：95℃，30S；PCR反应：95℃，4S，60℃，30S(40个循环)；溶解曲线：95℃，15S，60℃，1min，95℃，15S。

蛋白提取

将细胞培养基弃去，用4℃预冷的PBS洗涤细胞三次后，将六孔板倒置于滤纸上，将水控干。按RIPA：PMSF＝100：1的比例混合后，每孔加入400μL细胞裂解液，在冰上放置30min，让其充分裂解。用预先高压准备的刮子及EP管并做好标记，将细胞刮入1.5mL的EP管中，离心机4℃，12000r，12min。将离心后的上清转移至新的1.5mL EP管中标记，并进行蛋白含量的测定。

蛋白含量的测定及样品制备

取20μL，5mg/mLBSA蛋白标准品溶液用PBS溶液稀释至100μL，终浓度为1mg/mL。以终浓度为0μg/mL、25μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、750μg/mL、1000μg/mL、1500μg/mL、2000μg/mL做标准测定溶液。将适当体积的提取蛋白加入微孔板中，并用PBS补足20μL。加入BCA工作液(A液：B液按照体积比50：1混合)，37℃放置30min。562nm波长测定吸光值，并记录。以A562为纵坐标，BSA含量为横坐标，绘制标准曲线，计算提取样品的蛋白浓度，按照100μg上样量，计算所需样品的体积。制备Western blot样品，5μL配制好的5×载样液+计算好的样品量，混匀并瞬时离心。将混匀的样品放置95℃，10min，制备好的样品直接电泳或冻于-80℃。

Western Blot检测

①SDS-PAGE电泳：用洗洁精清洗玻璃板，用自来水冲洗后，在用UP水冲洗干净，放架子上晾干。将玻璃板对齐夹紧后灌胶，注意底部平整防止漏胶。按表3配制10％的分离胶、5％浓缩胶。灌胶时注意梳孔到分离胶留出距离0.5-1cm。灌入分离胶后加1mL水液封，30-45min后，胶与水之间出现一条折线分离胶已凝，倒出水，用滤纸将剩余水分吸干，灌入浓缩胶并插入梳子。将SDS凝胶放入电泳槽，倒入已经配制好的电泳液(5×电泳液100mL+900mLUP水)，缓慢拔出梳子，将制备好的蛋白样品按顺序加入梳孔，并加入6μL蛋白Marker。设定电泳程序：首先电压为50V，时间30min，当样品跑入分离胶后，电压改为120V，时间1h。当溴酚蓝载样液到距离胶板底部1-2cm时，停止电泳。

表310％分离胶和5％浓缩胶的配制

Table 3Preparation of 10％separation glue and 5％concentrate glue

②转膜：根据蛋白Marker和待测蛋白的分子量，对待测蛋白的位置进行初步判定，适当扩宽并切下凝胶。裁出与同凝胶大小相等的PVDF膜，放入甲醇中激活5min备用；按黑面，海绵，3层滤纸、蛋白胶，三层滤纸，海绵、白面顺序做成三明治样，操作期间避免在凝胶和PVDF膜中间出现气泡。将夹好的三明治放置在转膜盒中，到入预冷转膜液(10×转膜液80mL+720mL UP水+200mL甲醇)。再将整个装置放入冰盒中，避免温度过高；100V，350mA，60min转膜；结束后拿出PVDF膜，标记正反面，再用封闭液封闭，37℃下摇床摇1h。

③抗体孵育：封闭1h后，倒掉盒中封闭液，用UP水冲洗泡沫，将盒倒置，把水控干(防止一抗被稀释)，将配制好的一抗倒入盒中，4℃冰箱摇床过夜。回收一抗，用TBST洗膜三次，每次10min，倒入相应二抗37℃下摇床摇1h。回收二抗，TBST洗膜三次，每次10min。

④曝光：配制好显色液，一张膜1mL的量，现配现用。A液：B液＝1：1(试剂盒4℃保存)，将膜取出，置于吸水纸上吸干，将其置于仪器中，加入显色液，正反面都要与显色液充分接触，注意不要有气泡，进行曝光处理，保存并标注图片。

统计与数据分析：基因相对表达分析采用

(3)实验结果

由图4，5可知，LPS极显著提高了IPEC-J2细胞的TNF-α、IFN-γ的mRNA表达(P<0.01)；与LPS组相比，50ng/mL、100ng/mL、150ng/mLMCE极显著降低了TNF-α、IFN-γ的mRNA表达(P<0.01)，且呈现一定的浓度依赖关系；不同浓度MCE对IPEC-J2细胞TNF-α、IFN-γ的mRNA表达的影响结果与对IPEC-J2细胞培养液上清中TNF-α、IFN-γ含量的影响结果一致。

由图6可知，LPS极显著提高了IPEC-J2细胞的P-JNK/JNK值(P<0.01)；与LPS组相比，50ng/mL、100ng/mL、150ng/mLMCE极显著降低了P-JNK/JNK值(P<0.01)。随着MCE浓度升高，P-JNK/JNK值下降，且呈现的浓度依赖关系。

结果证明MCE下调了由LPS引起的IPEC-J2细胞中炎性因子TNF-α、IFN-γ的mRNA表达，发挥了抗炎作用。当JNK蛋白的磷酸化会受到抑制时，JNK-MAPK信号通路也会受到抑制，通常通过Western Blot检测JNK蛋白的磷酸化情况来表征药物对信号通路的拮抗作用。本试验结果发现，MCE降低了JNK蛋白的磷酸化水平，从而抑制了JNK-MAPK信号通路的激活。

实施例4：特异性抑制剂阻断JNK-MAPK信号通路后MCE对LPS诱导的IPEC-J2细胞胞炎性因子mRNA表达的影响

(1)实验材料，同实施例3；

(2)实验方法

将IPEC-J2细胞按每孔1×10

收集细胞后，提取细胞总RNA提取、反转录、荧光定量PCR试验具体步骤、统计与数据分析同实施例3。

(3)实验结果

由图8可知，与MCE组相比，分别添加JNK抑制剂SP600125后，IPEC-J2细胞的TNF-α、IFN-γ的mRNA表达均极显著下降(P<0.01)，证明JNK信号通路参与了下调炎性因子TNF-α、IFN-γ的表达。

综合实施例3、4两部分的结果证明，MCE可以通过特异性抑制JNK-MAPK信号通路下调炎症因子TNF-α、IFN-γ的表达，从而发挥抗炎作用。

以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

<110>云南农业大学

<120>博落回提取物作为JNK-MAPK信号通路抑制剂及其应用

<160> 6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ACATCAAGAAGGTGGTGAAG

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ATTGTCGTACCAGGAAATGAG

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

TTCCAGCTGGCCCCTTGAGC

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GAGGGCATTGGCATACCCAC

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

GAGCCAAATTGTCTCCTTCTAC

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

CGAAGTCATTCAGTTTCCCAG