pH敏感性三嵌段聚合物、还原敏感性交联聚合物囊泡及其制备和应用

摘要

本发明属于物理化学领域，具体提供一种pH敏感性三嵌段聚合物、还原敏感性交联聚合物囊泡及其制备和应用。所述具有pH敏感性的三嵌段聚合物，其结构为PEI

说明书

技术领域

本发明属于物理化学领域，具体涉及合成的pH敏感性三嵌段聚合物和制备及其在交联聚合物囊泡中的应用。

背景技术

聚合物囊泡是由两亲性嵌段共聚物形成的一种中空纳米粒子，其核心结构包含膜间疏水链段和暴露于囊泡内外亲水环境的亲水段

面对复杂的人体内环境和肿瘤微环境，单一刺激响应型药物递送系统很难满足实际应用的需求。单一刺激无法保证药物释放的有效性和精准性，且很难避免多药耐药性。因此开发多重刺激响应型药物递送系统具有很大的意义，它通过对不同刺激的逐一响应来克服连续的生理/病理障碍，并保障药物释放的时间、位点和剂量。本发明基于以上情况，设计合成了具有pH敏感性的三嵌段聚合物，通过薄膜水化法得到聚合物囊泡后进行交联、负载，最终得到具有pH/还原双重敏感性的交联聚合物囊泡。该囊泡用以药物载体，在pH和还原物质的双重刺激下，实现释放目标分子的目的。

参考文献：

1.Antonietti,M.；

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有pH敏感性的三嵌段聚合物。

本发明的进一步目的在于提供一种具有pH/温度敏感性的聚合物囊泡。

本发明的更进一步目的在于提供所述pH/温度敏感性的聚合物囊泡在制备靶向药物上的用途。

本发明者设计了一种具有pH敏感性的三嵌段聚合物，其结构为PEI

本发明提供的这种具有pH敏感性的三嵌段聚合物具有两亲性，两端为亲水性支化PEI，中间是pH敏感的PDPA。

本发明还提供了所述具有pH敏感性的三嵌段聚合物的制备方法。

本发明的三嵌段聚合物，其由如下方法制得：

1)在Schlenk瓶中，将单体DPA、链转移剂双(羧甲基)三硫代碳酸酯、引发剂AIBN以n:1～2:0.1～0.2的摩尔比(优选n:1:0.1)溶于1,4-二氧六环中，进行RAFT聚合，体系在60-70℃下反应10-12h，得到HOOC-PDPA

2)将步骤1)中所述HOOC-PDPA

3)将步骤2)中所得HOOC-PDPA

上述投料摩尔比:HOOC-PDPA

本发明还提供一种具有pH敏感性的聚合物囊泡，由所述具有pH敏感性的三嵌段聚合物通过薄膜水化法自组装所得。

上述具有pH敏感性的聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：

1)将权利要求1所述的聚合物PEI

2)将步骤1)所得聚合物薄膜和PBS缓冲液(pH＝7.4，1mM)在50℃水浴中提前预热，然后将PBS缓冲液倒入含膜的圆底烧瓶中，超声水化，使聚合物自组装形成聚合物囊泡。

本发明还提供一种具有pH/还原双重敏感性的交联聚合物囊泡，其由所述具有pH敏感性的聚合物囊泡与交联剂二硫代二异丁醛加成得到。

本发明还提供一种所述一种具有pH/还原双重敏感性的交联聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：

1)将权利要求3所述具有pH敏感性的聚合物囊泡溶液在氮气氛下磁力搅拌20～30分钟，排尽体系中的空气；

2)加入交联剂二硫代二异丁醛，摩尔比囊泡：交联剂＝1：20～30，25～30℃搅拌反应24～48h，得到交联聚合物囊泡。

本发明所述具有pH/还原双重敏感性的交联聚合物囊泡，所述交联聚合物囊泡为负载了目标分子的囊泡，其制备方法如下：

1)将权利要求1所述的聚合物PEI

2)将步骤1)所得聚合物薄膜和溶解有目标分子PBS缓冲液(pH＝7.4，1mM)在50℃水浴中提前预热，然后将含有目标分子的PBS缓冲液倒入含膜的圆底烧瓶中，超声水化，使聚合物自组装形成负载了目标分子的聚合物囊泡；

3)将步骤2)所得负载了目标分子的聚合物囊泡在氮气氛下磁力搅拌30分钟，排尽体系中的空气；然后加入交联剂二硫代二异丁醛，30℃搅拌反应48h，得到负载了目标分子的交联聚合物囊泡；摩尔比聚合物囊泡：交联剂＝1：20～30。

本发明还提供一种所述具有pH/还原双重敏感性的交联聚合物囊泡在制备靶向药物上的用途。

本发明提供pH/温度敏感性的交联聚合物囊泡，由分子结构为PEI

本发明的pH/温度敏感性的交联聚合物囊泡，所用交联剂为二硫代二异丁醛。

本发明还提供了具有pH/温度敏感性的交联聚合物囊泡的制备方法，包括如下具体步骤：

1)将聚合物PEI

2)将步骤1)所得聚合物薄膜和10mL PBS缓冲液(pH＝7.4，1mM)在50℃水浴中提前预热，然后将PBS缓冲液倒入含膜的圆底烧瓶中，超声水化，使聚合物自组装形成聚合物囊泡

3)将步骤2)所得的聚合物囊泡溶液在氮气氛下磁力搅拌30分钟，排尽体系中的空气。

4)加入交联剂二硫代二异丁醛，30℃搅拌反应48h，得到交联聚合物囊泡。

本发明设计合成了一种具有pH敏感性的三嵌段聚合物。所述聚合物具有两亲性，两端为亲水性支化PEI，中间是pH敏感的PDPA。PEI的分子量为1800，PDPA的聚合度可为50、100、150。

将具有pH敏感性的三嵌段聚合物自组装后通过二硫代二异丁醛交联得到交联聚合物囊泡作为药物载体具有一定的pH、还原敏感性，可以实现高时空控制的释药。

从图1的透射电子显微镜图可见交联聚合物囊泡的粒径在200nm左右。

本发明的交联聚合物囊泡使用二硫代二异丁醛作为交联剂，从而带有可以被还原性试剂选择性分解的二硫键。从图5可以看出，只调节pH至5.0,药物释放量仅增加至40％左右，中性环境下加入GSH，药物释放量也只能增加至50％，只有同时改变环境pH和加入GSH，才能使释药量明显增加，达到80％。由此可见，PDPA疏水膜和PEI交联层构建了阻挡药物释放的两道屏障，对于药物具有双重锁定效果。从图6可以看出，当包载物为大分子蛋白时，其双锁效果更加明显。在不含GSH的酸性环境下的释放量仅为7％，在中性环境下加入GSH的释放量也只有19％，远低于包载阿霉素时的40％和50％。而当同时改变环境pH和加入GSH时，蛋白释放量明显增加，达到68％。

由于癌细胞中GSH浓度是正常细胞的4倍，在正常细胞中不会被分解的二硫键可以在癌细胞中得到有效分解，从而破坏交联结构，从而达到释药的目的。

因此，本发明还提供交联聚合物囊泡在制备靶向药物上的用途。

本发明提供的双重敏感性的交联聚合物囊泡在药物释放方面具有优良表现。

本发明有益的技术效果：

本发明所制备的聚合物囊泡可以包裹不同类型的目标物(小分子和大分子)，而且载药量相对于聚合物胶束具有较大的提升。此外，交联的聚合物囊泡具有“双重锁定”功能：PDPA疏水层和PEI交联层构成了阻止蛋白释放的两道屏障，大大降低了目标分子的泄漏量，其中蛋白泄漏量低于5％。

本发明所引入的交联剂可以在温和温度环境下实现对聚合物囊泡的交联，不仅解决了一般聚合物囊泡稳定性较差的问题，还不会对所包裹的蛋白质的功能造成影响。

本发明通过聚合物囊泡包封的方式，将自身难以穿越细胞膜的大分子蛋白BSA成功运送至HepG2细胞内部，转染率高达88％。

附图说明

图1是聚合物囊泡的透射电子显微镜(TEM)图。

图2是HOOC-PDPA

图3是PEI

图4是载阿霉素交联聚合物囊泡在37℃下的药物释放图。

图5是载牛血清蛋白交联聚合物囊泡在37℃下的药物释放图。

图6是游离的牛血清蛋白和载牛血清蛋白交联聚合物囊泡在37℃下的HepG2细胞转染率图。

具体实施方式

以下用实施例对本发明作更详细的描述。这些实施例仅仅是对本发明最佳实施方式的描述，并不对本发明的范围有任何限制。

1、术语说明

DPA:N,N-二异氨基甲基丙烯酸乙酯；

PEI:聚乙烯亚胺；

AIBN:偶氮二异丁腈；

NHS:N-羟基琥珀酰亚胺；

DCC:二环己基碳二亚胺；

DOX：阿霉素；

BSA:牛血清蛋白；

GSH:谷胱甘肽；

DTT:二硫苏糖醇；

PBS:磷酸盐缓冲液

DBRD:二硫代二异丁醛。

2、试剂说明

DPA:百灵威科技有限公司，纯度99％；

DOX：百灵威科技有限公司，纯度98％；

AIBN:百灵威科技有限公司，纯度99％；

PEI:上海麦克林生化科技有限公司，纯度99％；

NHS:上海麦克林生化科技有限公司，纯度98％；

DCC:上海麦克林生化科技有限公司，纯度99％；

GSH:上海麦克林生化科技有限公司，纯度98％；

BSA:上海晶岱生物科技有限公司，纯度＞98％

DBRD:北京伊诺凯科技有限公司,纯度90％

无水乙醚：上海泰坦科技股份有限公司，纯度≥99％；

无水甲醇：上海泰坦科技股份有限公司，纯度≥99％

1,4-二氧六环：上海麦克林生化科技有限公司，纯度99％。

3、仪器说明

ZetasizerNano S型动态光散射(DLS，英国马尔文公司)；

紫外可见分光光度计(UV 1601PC，日本岛津公司)；

pH计(PHS-3D，上海精密科学仪器有限公司)；

真空干燥器(DZG-602，上海森信实验仪器有限公司)；

透射电子显微镜(JEM-1400，日本JEOL公司)；

旋转蒸发仪(N-1001，上海爱朗仪器有限公司)；

高频数控超声波(昆山市超声仪器有限公司)；

磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)。

实施例1

三嵌段聚合物PEI

1)在Schlenk瓶中，将单体DPA、链转移剂双(羧甲基)三硫代碳酸酯、引发剂AIBN以50:1:0.1的摩尔比溶于1,4-二氧六环中，进行RAFT聚合，体系在70℃下反应10h，得到HOOC-PDPA

2)将步骤1)中所述HOOC-PDPA

3)将1g步骤2)中所得HOOC-PDPA

1)将10mg聚合物PEI

2)将步骤1)所得聚合物薄膜和10mL PBS缓冲液(pH＝7.4，1mM，含0.4mg·mL

3)将步骤2)所得的载药聚合物囊泡溶液在氮气氛下磁力搅拌30分钟，排尽体系中的空气。

4)加入5μL交联剂二硫代二异丁醛，30℃搅拌反应48h，得到载药交联聚合物囊泡。

实施例2

三嵌段聚合物PEI

1)在Schlenk瓶中，将单体DPA、链转移剂双(羧甲基)三硫代碳酸酯、引发剂AIBN以100:1:0.1的摩尔比溶于1,4-二氧六环中，进行RAFT聚合，体系在70℃下反应10h，得到HOOC-PDPA

2)将步骤1)中所述HOOC-PDPA

3)将2g步骤2)中所得HOOC-PDPA

1)将3mg聚合物PEI

2)将步骤1)所得聚合物薄膜和10mL PBS缓冲液(pH＝7.4，1mM，含0.18mg·mL

3)将步骤2)所得的载蛋白聚合物囊泡溶液在氮气氛下磁力搅拌30分钟，排尽体系中的空气。

4)加入1.5μL交联剂二硫代二异丁醛，30℃搅拌反应48h，得到载蛋白交联聚合物囊泡。

实施例3

交联聚合物囊泡释药

1.处理透析袋：剪一段10-20cm的截留分子量为3000的透析袋，用纯水煮沸后冷却备用。

2.释药：分别取1mL载DOX的交聚合物囊泡溶液加入3个3600透析袋中，然后分别放入装有25mLpH 7.4PBS缓冲液、pH 5.0PBS缓冲液、含有10mM GSH的pH 7.4PBS缓冲液、含有10mM GSH的pH 5.0PBS缓冲液的离心管中。放置入37℃，转速150rpm的摇床。每隔1小时取样测量其紫外吸光度，测完后样液倒回离心管。

从图1的透射电子显微镜图可见聚合物囊泡的粒径在200nm左右。

结合图2和图3分析，图3中在化学位移2.5-3之间出现了支化PEI上亚甲基氢和端位甲基氢的峰，证明了三嵌段聚合物PEI

下表是聚合物囊泡交联前后的粒径和电位变化。

从上表可知，囊泡粒径从交联前的235.9nm减小至222.9nm，这主要是因交联形成了共价键，使得聚合物之间变得更紧密所致。电位数据则显示出聚合物囊泡带有正电荷27.1mV，其来源主要是PEI所携带的仲胺和伯胺，而交联反应会消耗这些仲胺和伯胺，导致交联后电位的降低至18.9mV。粒径和电位的改变都证明了交联反应的发生。

从图4可见，环境温度为37℃时，载药交联聚合物囊泡在不同条件下的释药情况。pH 7.4且不含GSH时，药物泄漏量为26％，只调节pH至5.0时,药物释放量仅增加至40％左右，而在中性环境下加入GSH，药物释放量也只能增加至50％，只有同时改变环境pH和加入GSH，才能使释药量明显增加，达到80％。

从图4可见，环境温度为37℃时，载蛋白交联聚合物囊泡在不同条件下的释药情况。pH 7.4且不含GSH时，药物泄漏量仅为3％，在不含GSH的酸性环境下的释放量仅为7％，在中性环境下加入GSH的释放量也只有19％。而当同时改变环境pH和加入GSH时，蛋白释放量明显增加，达到68％。

从图6可见，游离的蛋白并不能自主的进入HepG2细胞内，其转染率仅为0.013％，而通过聚合物囊泡的包裹，大大提高了其进入细胞的能力，相同浓度下的转染率达到88％。