一种免疫细胞冻存稳定剂、冻存液及冻存方法

摘要

本发明公开了一种免疫细胞冻存稳定剂、冻存液及冻存方法，该免疫细胞冻存稳定剂，按照质量百分比计算，包括甘氨酸2~10%、明胶0.1~2%、甘露醇5~10%、乳糖0.1~5%、人血白蛋白10~20%、右旋糖苷1~10%，余量为基础细胞培养液。冻存稳定剂可以有效保护细胞表型，能够显著性的提高免疫细胞在冻存条件下的活性，从而保持了细胞复苏后的生理功能和生物学功能；且稳定剂采用无血清培养液，无引入外源性动物蛋白，降低了动物源污染的可能性，也避免了细胞复苏后回输患者时出现的不良反应和毒副作用。

说明书

技术领域

本发明涉及人源细胞冻存技术领域，尤其涉及一种免疫细胞冻存稳定剂、冻存液及冻存方法。

背景技术

免疫细胞治疗技术，是近几年来临床肿瘤治疗新兴技术，也被视为最有前景的技术之一。免疫细胞治疗是通过体外培养、增殖、激活，回输体内即可诱导自体抗病毒免疫应答，人体抗病毒免疫一旦被激活就会源源不断产生抗病毒的物质杀灭病毒。

免疫细胞治疗又称为自体细胞免疫治疗，目前主要包括三种免疫细胞的疗法——DC、CIK、DC-CIK细胞疗法。具体方法是:通过提取患者体内不成熟的免疫细胞（采血），在实验室中进行活化培养使其具有高效识别和细胞的能力后，再回输患者体内。

由此，免疫细胞冻存也就成了免疫治疗不可或缺的重要环节。细胞冻存是将细胞放在低温环境，减缓细胞代谢，以达到长期储存的一种技术。其原理是将细胞置于-196℃液氮中超低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将细胞特性保存起来，在需要的时候通过复苏细胞即可使用。

目前，细胞冻存主要是采取-196℃液氮超低温条件下保存，细胞在超低温条件下，代谢功能停滞，细胞可长时间保存，当需要用细胞时，取出冻存的细胞在37℃水浴中快速解冻，即可恢复细胞的活性及功能。但是现有的免疫细胞冻存方法中，只解决了免疫细胞和肿瘤细胞的冻存，而免疫细胞冻存方法还未能很好地解决。由于免疫细胞的细胞结构和细胞特性，用以往的细胞冻存液及冻存方法冻存免疫细胞时，免疫细胞易受到冰晶损伤，复苏后细胞活率低，细胞增殖数量不足，细胞易老化，效率低下，冻存质量不高、细胞复苏后活性差以及成活率不高等问题。

发明内容

基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种对细胞生物学活性、细胞形态结构、细胞成活率等起到稳定性保护的免疫细胞冻存稳定剂、冻存液及冻存方法。

本发明的技术方案一如下：

一种免疫细胞冻存稳定剂，按照质量百分比计算，包括甘氨酸2~10%、明胶0.1~2%、甘露醇5~10%、乳糖0.1~5%、人血白蛋白10~20%、右旋糖苷1~10%，余量为基础细胞培养液。

一实施例中，所述免疫细胞冻存稳定剂，按照质量百分比计算，包括甘氨酸5%、明胶1% 、甘露醇7%、乳糖3%、人血白蛋白14%、右旋糖苷6%，余量为基础细胞培养液。

一实施例中，所述免疫细胞冻存稳定剂，所述基础细胞培养液为CORNING无血清培养液、KBM581的无血清培养液或RPMI-1640无血清培养液。

本发明提供的技术方案之二如下：

一种免疫细胞冻存液，包括免疫细胞冻存营养剂、保护剂以及上述免疫细胞冻存稳定剂。

一实施例，所述免疫细胞冻存液中，所述营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为60~90%、5~30%、1~15%。

在一实施例中，所述营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为70%、25%、5%。

又一实施例中，所述营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为60%、30%、10%。

一实施例，所述免疫细胞冻存液中，所述营养剂包括细胞培养基及15~20w/w%人血白蛋白；所述细胞培养液为CORNING无血清培养液、KBM581无血清培养液或RPMI-1640无血清培养液，所述人血白蛋白的浓度为15~35g/l。

一实施例，所述免疫细胞冻存液中，所述细胞培养液中还包含有50%~60%的α-MEM基础培养基。

一实施例，所述免疫细胞冻存液中，所述保护剂包括DMSO、磺基水杨酸、乙酰胺中的至少一种；优选地，所述保护剂为DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺混合物，且磺基水杨酸与乙酰胺的质量比为1~3:1~5。

本发明提供的技术方案之三如下：

一种使用上述冻存液进行细胞冻存方法，包括以下步骤：

常温下，用冻存液重悬免疫细胞形成悬浮液后分装冻存管中；

将所述冻存管置于2~8℃下预冷10~15小时，最后转入液氮中长期冻存。

一实施例，所述免疫细胞冻存液冻存方法中，所述冻存液重悬免疫细胞形成悬浮液时，免疫细胞的密度控制在1~2×10

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、免疫细胞冻存稳定剂，可以有效保护细胞表型，能够显著性的提高免疫细胞在冻存条件下的活性，从而保持了细胞复苏后的生理功能和生物学功能；

2、稳定剂及营养剂均采用无血清培养液，且无引入外源性动物蛋白，降低了动物污染的可能性，也避免了细胞复苏后回输患者时出现的不良反应和毒副作用。

冻存液中的保护剂，可以避免免疫细胞受到冰晶损伤，提高复苏后细胞活率及细胞扩增数量；细胞冻存复苏后活率高达97%以上，而细胞复苏培养30天后，细胞扩增倍数高达289倍；

4、常温下冻存液重悬免疫细胞后，只需在2~8℃下预冷10~15小时，即可转入液氮中长期冻存，减少了-20℃和/或-80℃中间程序降温环节，降低了冻存成本，提升了冻存效率；

5、稳定剂及营养剂均采用无血清培养液，且无引入外源性动物蛋白，降低了动物污染的可能性，也避免了细胞复苏后回输患者时出现的不良反应和毒副作用。

附图说明

图1为CIK细胞未冻存前与实施例1、实施例2、实施例3、对比例1中CIK细胞冻存30天后再培养18天的细胞培养增殖曲线图；

图2为NK细胞未冻存前与实施例4、实施例5、实施例6、对比例2中NK细胞冻存30天后再培养18天后的细胞培养增殖曲线图；

图3为CIK细胞实施例1、实施例2、实施例3、对比例1中CIK细胞冻存30天后细胞复苏活率曲线图；

图4为NK细胞实施例4、实施例5、实施例6、对比例2中NK细胞冻存30天后细胞复苏活率曲线图；

图5、6、7、8、9分别为CIK细胞未冻存前与实施例1、实施例2、实施例3、对比例1中CIK细胞冻存30天后再培养7天CD3+CD56+表型检测流式图；

图10、11、12、13、14分别为NK细胞未冻存前与实施例4、实施例5、实施例6、对比例2中NK细胞冻存30天后再培养7天CD3-CD56+表型检测流式图；

图15为CIK细胞未冻存前与实施例1、实施例2、实施例3、对比例1中CIK细胞冻存30天后再培养7天后对K562的杀伤率。

图16为NK细胞未冻存前与实施例4、实施例5、实施例6、对比例2中CIK细胞冻存30天后再培养7天后对K562的杀伤率。

具体实施方式

本发明中，免疫细胞可以是DC、CIK、DC-CIK、NK、NKT等任一种。

针对上述免疫细胞，本发明提供了相应的免疫细胞冻存稳定剂，按照质量百分比计算，稳定剂包括甘氨酸2~10%、明胶0.1~2%、甘露醇5~10%、乳糖0.1~5%、人血白蛋白10~20%、右旋糖苷1~10%，余量为基础细胞培养液；优选地，甘氨酸4~8%、明胶1~2%、甘露醇6~8%、乳糖1~3%、人血白蛋白12~16%、右旋糖苷3~8%，余量为基础细胞培养液。

一实施例中，所述免疫细胞冻存稳定剂，按照质量百分比计算，包括甘氨酸5%、明胶1%、甘露醇7%、乳糖3%、人血白蛋白14%、右旋糖苷6%，余量为基础细胞培养液；或者，免疫细胞冻存稳定剂，按照质量百分比计算，包括甘氨酸2%、明胶2%、甘露醇5%、乳糖0.1%、人血白蛋白20%、右旋糖苷1%，余量为基础细胞培养液；或者，免疫细胞冻存稳定剂，按照质量百分比计算，包括甘氨酸10%、明胶0.1% 、甘露醇10%、乳糖5%、人血白蛋白10%、右旋糖苷10%，余量为基础细胞培养液。

一实施例中，所述免疫细胞冻存稳定剂，所述基础细胞培养液为Corning无血清培养液、KBM581的无血清培养液或RPMI-1640无血清培养液。

上述稳定剂可以用于配制免疫细胞冻存液，该冻存液中还包括免疫细胞冻存营养剂及保护剂；其中，营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为60~90%、5~30%、1~15%；优选地，所述营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为65~80%、10~28%、2~12%；或者，营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为70%、25%、5%；或营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为60%、30%、10%；或者，营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为70%、20%、10%；或者，营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为65%、25%、10%；或者，营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为80%、10%、10%；或者，营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为75%、20%、5%；或者，营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为90%、5%、5%等。

其中，营养剂包括无血清培养液及15~20w/w%人血白蛋白（人血白蛋白在加入培养液中前的初始液浓度为15~20w/w%）；优选地，所述细胞培养液为CORNING无血清培养液、KBM581无血清培养液或RPMI-1640无血清培养液，所述培养液中所述人血白蛋白的添加量为15~35g/l；或者，细胞培养液中，人血白蛋白的添加量为20g/l；或者，细胞培养液中，人血白蛋白的添加量为35g/l；或者，细胞培养液中，人血白蛋白的添加量为15g/l。

一实施例中，细胞培养液中还包含有50%~60%的α-MEM基础培养基；优选地，所述细胞培养液中包含有54%的α-MEM基础培养基；或者，所述细胞培养液中包含有50%的α-MEM基础培养基；或者，所述细胞培养液中包含有60%的α-MEM基础培养基等。

保护剂则包括DMSO、磺基水杨酸、乙酰胺中的至少一种；优选地，所述保护剂为DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺混合物，且磺基水杨酸与乙酰胺的质量比为1~3:1~5；或者，所述保护剂为DMSO、磺基水杨酸、乙酰胺中的任一种；或者，保护剂为DMSO与磺基水杨酸按照1:1组合的混合物；或者，保护剂为DMSO与乙酰胺照1:2组合的混合物；或者，保护剂为磺基水杨酸与乙酰胺照1:5组合的混合物；或者，保护剂为DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺按照1:1:5组合的混合物；或者，保护剂为DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺按照1:3:1组合的混合物；或者，所述保护剂为DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺按照1:1:1组合的混合物；或者，所述保护剂为DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺按照1:2:2组合的混合物；或者，所述保护剂为DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺按照1:3:5组合的混合物等。

冻存液中，稳定剂用于有效保护细胞表型，能够显著性的提高免疫细胞在冻存条件下的活性，从而保持了细胞复苏后的生理功能和生物学功能；营养剂采用无血清培养液，可以降低免疫细胞对动物病源污染的可能性，安全可靠；保护剂则可以避免免疫细胞受到冰晶损伤，提高复苏后细胞活率及细胞扩增数量。

上述冻存液可应用于免疫细胞冻存，冻存工艺包括以下步骤：

S1、常温下，用冻存液重悬免疫细胞形成悬浮液后分装冻存管中；

S2、将所述冻存管置于4℃下预冷12小时，随后将冻存管置于-20℃~冻存30分钟；再转入-80℃下冻存冷4小时，最后转入液氮中长期冻存。

免疫细胞冻存时，冻存液重悬免疫细胞形成悬浮液时，免疫细胞的密度控制在1~2×10

下面结合附图，分别以免疫细胞CIK和NK为例，对本发明作进一步详细说明。下列各实施例中，人血白蛋白均采用15~20w/w%人血白蛋白。

一、冻存液配制及细胞冻存与复苏

（一）、CIK免疫细胞为例说明

实施例1

1、配制1000g冻存液，且营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为70%、25%、5%，即营养剂、保护剂以及稳定剂的质量分别为700g、250g、50g。

具体配置工艺如下

1.1、配置冻存稳定剂50g

按照质量百分比计算，甘氨酸5%、明胶1% 、甘露醇7%、乳糖3%、人血白蛋白14%、右旋糖苷6%，余量为基础细胞培养液；称取甘氨酸2.5g、明胶0.5g、甘露醇3.5g、乳糖1.5g、人血白蛋白7g、右旋糖苷3g、CORNING无血清培养液32g，混合均匀配置成细胞冻存稳定剂；

1.2、配置冻存保护剂250g

DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺按照1:2:2比例，称取DMSO 50g、磺基水杨酸100g及乙酰胺100g，混合均匀，得到保护剂；

1.3、配置冻存营养剂750g

称取无血清CORNING培养液750g，培养液中含有浓度为54%的α-MEM基础培养基以及浓度为20g/l的人血白蛋白。

1.4、配置冻存液

将上述步骤1.1、1.2、1.3配置的稳定剂、保护剂、营养剂混合，制得冻存液。

2、CIK免疫细胞冻存

2.1、量取步骤1中配置的冻存液100ml，加入CIK免疫细胞并控制细胞密度为1.5×10

2.2、将冻存管置于4℃下预冷4小时，随后将冻存管置于-20℃~冻存30分钟；再转入-80℃下冻存冷4小时，然后转入液氮中长期冻存。

3、CIK免疫细胞复苏

从液氮中取出冻存管，置于40℃的温度下复苏2分钟CIK免疫细胞，备用后续培养。

实施例2

1、配制1000g冻存液，且营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为60%、30%、10%，即营养剂、保护剂以及稳定剂的质量分别为600g、300g、100g。

具体配置工艺如下

1.1、配置冻存稳定剂100g

按照质量百分比计算，甘氨酸2%、明胶2% 、甘露醇5%、乳糖0.1%、人血白蛋白20%、右旋糖苷1%，余量为基础细胞培养液；称取甘氨酸2g、明胶2g、甘露醇5g、乳糖0.1g、人血白蛋白20g、右旋糖苷1g、KBM581的无血清培养液69.9g，混合均匀配置成细胞冻存稳定剂；

1.2、配置冻存保护剂300g

DMSO及磺基水杨酸按照1:3比例，称取DMSO 75g、磺基水杨酸225g，混合均匀，得到保护剂；

1.3、配置冻存营养剂600g

称取KBM581的无血清培养液600g，培养液中含有浓度为60%的α-MEM基础培养基以及浓度为35g/l的人血白蛋白。

1.4、配置冻存液

将上述步骤1.1、1.2、1.3配置的稳定剂、保护剂、营养剂混合，制得冻存液。

2、CIK免疫细胞冻存

2.1、量取步骤1中配置的冻存液100ml，加入CIK免疫细胞并控制细胞密度为2×10

2.2、将冻存管置于4℃下预冷4小时，随后将冻存管置于-20℃~冻存30分钟；再转入-80℃下冻存冷4小时，然后转入液氮中长期冻存。

3、CIK免疫细胞复苏

从液氮中取出冻存管，置于37℃的温度下复苏3分钟CIK免疫细胞，备用后续培养。

实施例3

1、配制1000g冻存液，且营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为90%、5%、5%，即营养剂、保护剂以及稳定剂的质量分别为900g、50g、50g。

具体配置工艺如下

1.1、配置冻存稳定剂50g

按照质量百分比计算，甘氨酸10%、明胶0.1% 、甘露醇10%、乳糖5%、人血白蛋白10%、右旋糖苷10%，余量为基础细胞培养液；称取甘氨酸5g、明胶0.05g、甘露醇5g、乳糖2.5g、人血白蛋白5g、右旋糖苷5g、RPMI-1640无血清培养液27.45g，混合均匀配置成细胞冻存稳定剂；

1.2、配置冻存保护剂50g

保护剂选用DMSO，称取DMSO 75g。

1.3、配置冻存营养剂900g

称取RPMI-1640无血清培养液900g，培养液中含有浓度为50%的α-MEM基础培养基以及浓度为15g/l的人血白蛋白。

1.4、配置冻存液

将上述步骤1.1、1.2、1.3配置的稳定剂、保护剂、营养剂混合，制得冻存液。

2、CIK免疫细胞冻存

2.1、量取步骤1中配置的冻存液100ml，加入CIK免疫细胞并控制细胞密度为1×10

2.2、将将冻存管置于4℃下预冷4小时，随后将冻存管置于-20℃~冻存30分钟；再转入-80℃下冻存冷4小时，然后转入液氮中长期冻存。

3、CIK免疫细胞复苏

从液氮中取出冻存管，置于43℃的温度下复苏2分钟CIK免疫细胞，备用后续培养。

对比例1

对比例1中不含稳定剂。

1、配制1000g冻存液，且营养剂、保护剂的质量百分比分别为70%、30%，即营养剂、保护剂的质量分别为700g、300g。

具体配置工艺如下

1.1、配置冻存保护剂300g

DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺按照1:2:2比例，称取DMSO 60g、磺基水杨酸120g及乙酰胺120g，混合均匀，得到保护剂；

1.2、配置冻存营养剂700g

称取无血清CORNING培养液700g，培养液中含有浓度为54%的α-MEM基础培养基以及浓度为20g/l的人血白蛋白。

1.3、配置冻存液

将上述步骤1.1、1.2配置的保护剂、营养剂混合，制得冻存液。

2、CIK免疫细胞冻存

2.1、量取步骤1中配置的冻存液100ml，加入CIK免疫细胞并控制细胞密度为1.5×10

2.2、将冻存管置于4℃下预冷4小时，随后将冻存管置于-20℃~冻存30分钟；再转入-80℃下冻存冷4小时，然后转入液氮中长期冻存。

3、CIK免疫细胞复苏

从液氮中取出冻存管，置于40℃的温度下复苏2分钟CIK免疫细胞，备用后续培养。

（二）、NK免疫细胞为例说明

实施例4

1、配制1000g冻存液，且营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为65%、25%、10%，即营养剂、保护剂以及稳定剂的质量分别为650g、250g、100g。

具体配置工艺如下

1.1、配置冻存稳定剂100g

按照质量百分比计算，甘氨酸6%、明胶1.5%、甘露醇8%、乳糖4%、人血白蛋白16%、右旋糖苷8%，余量为基础细胞培养液；称取甘氨酸6g、明胶1.5g、甘露醇8g、乳糖4g、人血白蛋白16g、右旋糖苷8g、CORNING无血清培养液56.5g，混合均匀配置成细胞冻存稳定剂；

1.2、配置冻存保护剂250g

DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺按照1:1:1比例，称取DMSO 83.4g、磺基水杨酸83.3g及乙酰胺83.3g，混合均匀，得到保护剂；

1.3、配置冻存营养剂650g

称取无血清CORNING培养液650g，培养液中含有浓度为54%的α-MEM基础培养基以及浓度为14g/l的人血白蛋白。

1.4、配置冻存液

将上述步骤1.1、1.2、1.3配置的稳定剂、保护剂、营养剂混合，制得冻存液。

2、NK免疫细胞冻存

2.1、量取步骤1中配置的冻存液100ml，加入NK免疫细胞并控制细胞密度为1.5×10

2.2、将冻存管置于4℃下预冷4小时，随后将冻存管置于-20℃~冻存30分钟；再转入-80℃下冻存冷4小时，然后转入液氮中长期冻存。

3、NK免疫细胞复苏

从液氮中取出冻存管，置于40℃的温度下复苏2分钟NK免疫细胞，备用后续培养。

实施例5

1、配制1000g冻存液，且营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为80%、10%、10%，即营养剂、保护剂以及稳定剂的质量分别为800g、100g、100g。

具体配置工艺如下

1.1、配置冻存稳定剂100g

按照质量百分比计算，甘氨酸8%、明胶0.5%、甘露醇7%、乳糖2.5%、人血白蛋白14%、右旋糖苷8%，余量为基础细胞培养液；称取甘氨酸8g、明胶0.5g、甘露醇7g、乳糖2.5g、人血白蛋白14g、右旋糖苷8g、KBM581的无血清培养液60g，混合均匀配置成细胞冻存稳定剂；

1.2、配置冻存保护剂100g

DMSO、磺基水杨酸、乙酰胺按照1:3:1比例，称取DMSO 20g、磺基水杨酸60g、乙酰胺20g，混合均匀，得到保护剂；

1.3、配置冻存营养剂800g

称取KBM581的无血清培养液800g，培养液中含有浓度为52%的α-MEM基础培养基以及浓度为28g/l的人血白蛋白。

1.4、配置冻存液

将上述步骤1.1、1.2、1.3配置的稳定剂、保护剂、营养剂混合，制得冻存液。

2、NK免疫细胞冻存

2.1、量取步骤1中配置的冻存液100ml，加入NK免疫细胞并控制细胞密度为2×10

2.2、将冻存管置于4℃下预冷4小时，随后将冻存管置于-20℃~冻存30分钟；再转入-80℃下冻存冷4小时，然后转入液氮中长期冻存。

3、NK免疫细胞复苏

从液氮中取出冻存管，置于37℃的温度下复苏3分钟NK免疫细胞，备用后续培养。

实施例6

1、配制1000g冻存液，且营养剂、保护剂以及稳定剂的质量百分比分别为70%、20%、10%，即营养剂、保护剂以及稳定剂的质量分别为700g、200g、100g。

具体配置工艺如下

1.1、配置冻存稳定剂100g

按照质量百分比计算，甘氨酸3%、明胶1%、甘露醇6%、乳糖2%、人血白蛋白12%、右旋糖苷5%，余量为基础细胞培养液；称取甘氨酸3g、明胶1g、甘露醇6g、乳糖2g、人血白蛋白12g、右旋糖苷5g、KBM581的无血清培养液61g，混合均匀配置成细胞冻存稳定剂；

1.2、配置冻存保护剂200g

磺基水杨酸与乙酰胺按照1:5比例，称取磺基水杨酸33.33g、乙酰胺166.67g，混合均匀，得到保护剂；

1.3、配置冻存营养剂700g

称取KBM581的无血清培养液700g，培养液中含有浓度为54%的α-MEM基础培养基以及浓度为35g/l的人血白蛋白。

1.4、配置冻存液

将上述步骤1.1、1.2、1.3配置的稳定剂、保护剂、营养剂混合，制得冻存液。

2、NK免疫细胞冻存

2.1、量取步骤1中配置的冻存液100ml，加入NK免疫细胞并控制细胞密度为2×10

2.2、将冻存管置于4℃下预冷4小时，随后将冻存管置于-20℃~冻存30分钟；再转入-80℃下冻存冷4小时，然后转入液氮中长期冻存。

3、NK免疫细胞复苏

从液氮中取出冻存管，置于37℃的温度下复苏3分钟NK免疫细胞，备用后续培养。

对比例2

对比例2中不含稳定剂。

1、配制1000g冻存液，且营养剂、保护剂的质量百分比分别为70%、30%，即营养剂、保护剂的质量分别为700g、300g。

具体配置工艺如下

1.1、配置冻存保护剂300g

DMSO、磺基水杨酸及乙酰胺按照1:1:1比例，称取DMSO 83.4g、磺基水杨酸83.3g及乙酰胺83.3g，混合均匀，得到保护剂；

1.2、配置冻存营养剂700g

称取无血清CORNING培养液700g，培养液中含有浓度为54%的α-MEM基础培养基以及浓度为14g/l的人血白蛋白。

1.3、配置冻存液

将上述步骤1.1、1.2配置的稳定剂、保护剂、营养剂混合，制得冻存液。

2、NK免疫细胞冻存

2.1、量取步骤1中配置的冻存液100ml，加入NK免疫细胞并控制细胞密度为1.5×10

2.2、将冻存管置于4℃下预冷4小时，随后将冻存管置于-20℃~冻存30分钟；再转入-80℃下冻存冷4小时，然后转入液氮中长期冻存。

3、NK免疫细胞复苏

从液氮中取出冻存管，置于40℃的温度下复苏2分钟NK免疫细胞，备用后续培养。

二、检测试验结果分析

1、细胞生长增值

图1为CIK细胞培养生长曲线图; 图2 NK细胞培养生长曲线图；其中，图1和2中的“未冻存细胞”分别表示未冻存的CIK细胞和NK细胞直接培养，而实施例1至6和对比例1至2中的细胞，则是经过冻存30天复苏后再继续培养18天。表1分别对应图1和图2。

由图1 、图2和表1可知，CIK细胞和NK细胞,第0天时分别为1×10

同样，实施例4中NK细胞冻存后复苏培养生长数量达到285.82×10

由上述细胞生长数量可知，①、使用本发明冻存剂冻存的免疫细胞，如，CIK冻存复苏后再继续培养生长扩增倍数介于252~279倍，与未冻存CIK细胞直接培养生长扩增倍数约为281倍相接近；NK 免疫细胞冻存复苏后再继续培养生长扩增倍数介于268~286倍，与未冻存NK细胞直接培养生长扩增倍数约为289倍相接近；②、对比例1和2中，冻存液中均未添加本发明提供的冻存稳定剂，致使CIK细胞冻存复苏再培养时的扩增倍数约为180倍，而NK细胞生长扩增倍数约为182倍。也就是说明，本发明提供的冻存稳定剂，能有效稳定细胞表型，防止细胞膜破裂，保持了细胞复苏后的活性和生理功能，使免疫细胞冻存与未冻存的活性、生长扩增以及生理功能基本保持一致。

表1免疫细胞培养生长数量计数表，×10

2、CIK细胞冻存复苏活率

分别将实施例1至6、对比例1和2的CIK和NK细胞进行台盼蓝染色，放入18~25℃下保存4小时后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞数和细胞活率，如图3、图4、表2和3；其中，表2数据与图3相一致；表3数据与图4相一致。

表2 CIK细胞冻存前后细胞数量及活性率表

表3 NK细胞冻存前后细胞数量及活性率表

从图3、图4、表2和3中可以看出，实施例1至3中CIK细胞数量以及细胞活率高于对比例1；实施例4至6中NK细胞数量以及细胞活率高于对比例2。也就说明，采用本发明提供的冻存稳定剂能有效稳定细胞表型，防止细胞膜破裂，保持了细胞复苏后的活性和生理功能，使免疫细胞冻存与未冻存的活性基本保持一致。

3、CIK细胞CD3+CD56+表型检测及NK细胞CD3-CD56+表型检测

图5、6、7、8、9分别为CIK细胞培养7天后的CD3+CD56+表型检测图，其中，图5为未冻存的CIK细胞直接培养；图6、7、8、9分别为实施例1至3、对比例1中的CIK细胞冻存30日后复苏再培养。

图10、11、12、13、14分别为NK细胞培养7天后的CD3-CD56+表型检测图，其中，图10为未冻存的NK细胞直接培养；图11、12、13、14别为实施例4至6、对比例2中的NK细胞冻存30日后复苏再培养。

CIK细胞培养至第7天，分别取未冻存CIK细胞、实施例1至3、对比例1培养的CIK细胞制成细胞悬液并调整细胞终浓度为1×10

NK细胞培养至第7天，分别取未冻存NK细胞、实施例4至6、对比例2培养的NK细胞制成细胞悬液并调整细胞终浓度为1×10

因此，说明本发明提供的冻存剂冻存免疫细胞复苏后，冻存稳定剂对免疫细胞的表型具有较好的保护作用，且稳定剂对免疫细胞的表面标志物影响较小，无外来污染，免疫细胞冻存复苏后基本上无需洗涤可以直接使用。

4、免疫细胞对K562的杀伤率。

取未冻存CIK细胞、实施例1至3、对比例1中CIK细胞冻存30日复苏再培养7天后的相同细胞数量。转至5组离心管组（每组离心管组4支离心管，每组都对应有未冻存CIK细胞、实施例1至3、对比例1中培养的CIK细胞）中，然后采用各自对应的培养液，将5组离心管组分别调整终浓度约为1.0×10

K562细胞作为靶细胞，按照效靶比1:1、5:1、10:1、20:1进行靶细胞K562和效应细胞CIK进行铺孔，每组3个复孔。CIK细胞和K562靶细胞的每个孔分别为500μl。每孔加入500μl实施例6至10、对比例1中各自对应的培养基。

效应细胞CIK细胞自然释放组：1.0×10

K562靶细胞最大释放组：1.0×10

K562靶细胞自然释放组：1.0×10

培养液空白对照试验组：每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。

铺板后，将培养板250g离心4分钟，置于37℃、5%CO

杀伤活性按照如下公式计算：

杀伤活性=（A -B-C）/（D-C）×100%;

其中：

A-表示试验组吸光度值校正值；

B-表示效应细胞自然释放组；

C-表示靶细胞自然释放组；

D-表示靶细胞最大释放组。

相同地，NK细胞也采用CIK细胞的类似上述操作，在此不再赘述。

CIK、NK分别与K562细胞的杀伤效靶比详见图15、图16、表4；其中，表示4中的数据分别与图15和图16中的数据是相对应一致的。

表4免疫细胞（CIK,NK）与K562杀伤测试结果表

由表4、图15和图16可知，在杀伤K562细胞时，本发明提供的含稳定剂冻存液冻存免疫细胞（如，CIK,NK）复苏再培养，如实施例1至6，比对比例1和2冻存复苏再培养的免疫细胞（如，CIK,NK）的杀伤效果更好，差异较明显；且未冻存免疫细胞直接培养与实施例1至6冻存免疫细胞复苏培养的杀伤效果差别不大，尤其是实施例1和实施例4的对应的免疫细胞的杀伤效果较优。实施例1至6中，免疫细胞（如，CIK,NK）培养7天后，在杀伤K562细胞时，以效靶比为20:1条件下，其细胞杀伤率介于86%~95%，远高于临床应用标准，即大于等于40%。

应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。