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法律状态
2022-06-03
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明涉及一种能有效监测棉铃虫的性信息素受体衍生肽及其生物传感器。
背景技术
棉花是世界经济发展中的最重要的农作物之一。棉花由于含有大量的天然纤维，所以是纺织工业的主要原料，同时棉籽的含油量高，所以是重要的食用油来源和化工原料。棉花的产量直接影响着世界的经济。虫害是严重危害棉花的产量重要因素之一，棉铃虫是其中最主要的一种害虫。棉铃虫在世界地都有分布，并且不仅对棉花有危害，还危害茄子、柑橘、木豆等数百种作物。
监测是控制害虫的发生和发展的重要措施，通过监测有害生物的种群发生动态，才能制定适时、有效的防治措施。生物电子气体传感器有着成本低、操作简单、响应快、实时监测等优点，在检测有害气体领域得到了广泛的应用。例如，金属氧化物、石墨烯和导电聚合物已被用作不同气态物质的传感材料。然而，这些材料的检测极限和选择性通常不令人满意。近年来，气味受体(OR)和气味受体衍生肽(ORP)作为一种新的敏感物质出现。气味受体(OR)是一种在嗅觉神经元中表达的膜蛋白，属于G蛋白偶联受体，具有7个α螺旋跨膜结构域(TM)，可以特异性识别对应的目标气味(配体)。然而，受体蛋白只能在液体中稳定存在，只能在液体中检测目标物质。气味受体衍生肽(ORP)设计自气味受体的配体结合位点区域，简短的多肽片段能稳定的存在于空气中，能高灵敏度、特异性识别目标气味。但是由于气味受体(OR)附着于细胞膜上，提纯后结构会发生改变，所以很难解析其蛋白质结构。目前已鉴定的昆虫气味受体结构只有通过冷冻电镜鉴定出一个榕小蜂Apocrypta bakeri的共受体。同源建模来预测蛋白质的三维结构需要目标序列与模板至少拥有25％的相似性，因此无法利同源建模预测其他昆虫气味受体的结构。因此需要选择昆虫性信息素受体这一类气味受体(OR)，设计出气味受体衍生肽对棉铃虫进行特异性监测。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种性信息素受体衍生肽用于制备能有效监测棉铃虫病虫害的设备的用途，具有如SEQ ID NO：1-3任一项所示氨基酸序列或其经氨基酸残基的修饰、取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
本发明的另一目的是提供一种传感器，包括基底和叉指电极，所述的叉指电极上牢固附着有单壁碳纳米管，并且还包括与单壁碳纳米管连接的性信息素受体衍生肽，其序列如SEQ ID NO：1-3任一项所示氨基酸序列或其经氨基酸残基的修饰、取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列，能够对棉铃虫进行特异性监测。
进一步的，所述的单壁碳纳米管为羧基化单壁碳纳米管，所述的性信息素受体衍生肽的N-末端添加了一个半胱氨酸残基与羧基化单壁碳纳米管连接。
进一步的，所述的叉指电极为14对金电极，电极宽度＝0.15mm，电极间距＝0.18mm，电极厚度＝5μm，基底材料为Al
如上所述的传感器制备方法如下：将羧基化单壁碳纳米管悬浮在纯乙醇中，超声振动20分钟，得到浓度为0.1mg/mL的悬浮液，然后在叉指电极上滴加0.5mL的羧基化单壁碳纳米管悬浮液，乙醇自然蒸发后，用氮气去除了未牢固附着在指间电极上的羧基化单壁碳纳米管；制备浓度为0.05M的4-二甲基氨基吡啶、浓度为0.1M的苄基硫醇和浓度为0.2M的N，N'-二环己基碳二亚胺在二氯甲烷中的混合溶液，将完成的具有羧基化单壁碳纳米管的叉指电极在混合溶液中浸泡2小时，然后，浸泡在浸泡在含有0.01mg/L的衍生肽的溶液中，以浓度为0.05M的4-巯基苯酚为催化剂，时间为48小时。
本发明还提供一种有效监测棉铃虫病虫害的电子设备，包括如上所述的传感器。
本发明的优点及有益效果：本发明的性信息素受体衍生肽的传感器可以实时、敏感、特异性地监测到棉铃虫释放的性信息素的变化，具有监测棉铃虫种群动态的潜力，可以特异性地识别棉铃虫释放的信息素而对寄主挥发物的响应小。在实验室条件下，在12000cm
附图说明
图1为预测确定性信息素的气味受体衍生肽的流程图；
图2为通过HarmOR13和HarmOR6的一致性预测进行二级结构预测图；
图3为HarmOR13和HarmOR6的7个跨膜结构域的3D结构图；
图4为本发明的不同气味受体衍生肽传感器对不同浓度的4种类型的性信息素气体的响应图；
图5为本发明的不同气味受体衍生肽传感器对不同数量和性别的棉铃虫活体产生的不同性信息素气体的响应图；
具体实施方式
下面根据举例对本发明做进一步的说明：
实施例1
制备气味受体衍生肽传感器的试验材料和方法
1、气味受体的选择及结构预测
通过研究棉铃虫的习性，发现雌性棉铃虫在性成熟后，为了吸引雄性达到交配繁衍的目的，会从性腺中释放性信息素，雄性棉铃虫通过气味受体识别性信息素(SP)来寻找雌性棉铃虫。雌性棉铃虫会释放多种性信息素，其中性信息素1：顺11-十六烯醛(Z11-16:Ald)释放量占比达到90％。已经鉴定出雄棉铃虫的HarmOR13是主要性信息素成分Z11-16:Ald的特异性受体，HarmOR6识别性信息素2：顺9-十六碳烯醇(Z9-16:OH)、性信息素3：顺9-十六碳烯醛(Z9-16:Ald)和性信息素4：顺9-十四碳烯醛(Z9-14:Ald)。
WU-T等人利用狗和人的嗅觉受体，预测了识别三甲胺氨气、乙酸、邻二甲苯气味的结合位点并设计多肽序列，连接到传感器后成功的识别这些气体。此前的研究这些结合位点都在OR的跨膜结构域(TM)上。气味受体因此推测结合位点位于跨膜结构域上，且因G蛋白偶联受体跨膜结构域通常包含21个疏水的氨基酸序列，其三维结构为一个α螺旋结构，且无蛋白质结构中的对预测有影响的β-折叠以及无规则的loop区。因此推测可以用结构预测较为可靠的跨膜结构域与性信息素对接来鉴定结合位点，进而设计出可以连在传感器上识别性信息素的多肽序列。
选择棉铃虫已经鉴定的性信息素受体，HarmOR13、HarmOR16。根据在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的基因登录号，获取这些受体的完整编码区(CDS)氨基酸序列。利用CDS、网站topcons(https://topcons.net/pred/)在线预测这些性信息素受体的二级结构，预测得到这些受体的7个跨膜结构域，通常包含21个氨基酸。在7个跨膜结构域(21aa)上下游选择40个氨基酸的序列作为建模序列，即利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对7个带有跨膜结构域的肽链(40aa)分别建模，下载建模结果。
1.1、棉铃虫性信息素气味受体的筛选
棉铃虫性信息素成分主要成分为性信息素1(SP1)，其比例远超过其他组分,次要成分为性信息素2(SP2),性信息素3(SP3),性信息素4(SP4)。已从雄性棉铃虫嗅觉感器上鉴定出多种性信息素受体(HarmORX)，这些受体可以识别雌性棉铃虫释放的性信息素。HarmOR13在爪蟾卵母系统中特异性识别性信息素1，HarmOR6可以识别性信息素2,性信息素3,性信息素4等几个组分。因此选择研究棉铃虫性信息素受体与性信息素的结合位点，并将多肽片段连接在传感器上，实现利用多肽传感器监测棉铃虫发生的动态。其中从NCBI上获得HarmOR13、HarmOR6的一级列。完整编码区氨基酸序列FASTA格式如下。
>HarmOR13
MKILSDGSDLEGVEKVEDIFYINLARKSMWILDSWPKTPNESVTYRYFVLALNVATLVGGAVYLRNNTGVLSSFELGHTYITVFMNCITCSRCIMILSREYNEVMLSFVNKIHLFHHRHKSEYAYKTHIFIHKISHFYTVYLLGLALNGLLLFNMIPFYNCYSRGMFRDVIPANATYDHSVFYSVPFDYTTKFKGYIAMTSFNCFISYTCTSYFCVVDLTVSLVIFHLWGHMRLLTYHLANFKKPASVLESNENTDAIKDHSYTQEELKEVFGKLREYIRHHNLILNFSSEMSNAFGPALLAYMVFHQVSGCILLLECSQLDMKTLVRYGPLTVVIFQQLIQISVIFELLGSSNDKLIDAVYLVPWEYMDTKNRKLVFVMLRQSQRSIDLKMMSMLTVGVQTMTAILKTSFSYFVMLKTVAEEEQ
>HarmOR6
MSFRKFLFENEAVDGINGPADYLYIKILRFTLDVIRSWPRKELGEPESASFTVFMKYFYLVLTIATVVGSILYVVVHVTELSFLEAGLMYLIILMSFLDALTVMSLTFSEKYRVLAKDFLTKIHLFYYKDRSKAAMEIHKKVHLISHLFSLWLLFQMLSGLSLFNLTPMYSNLAAGKYRRGGLGNTTFEHSLYYLYPFNTSTDVIGYIVACILHWIISYLCSTWFCMFNLFISLMVFNLWGHFKILIITLEEFPRPKSIGSLPSAYKYSQEELVEVAEKLKDCINYHRVIKNFTNRMSDVFGPMLFVYYSFHQASGCLLLLECSQMTAQALMRYLPLTIILTQQLIQLSVIFELVGSESEKLKDAVYSVPWECMDTKNRKMVRFFLMNVQEPIHVKAMGIANVGVTTMAAILKTSMSYFTFLRSM
1.2、二级结构预测
利用TOPCONS(https://topcons.net/pred/)预测整个受体的二级结构，由于气味受体跨膜结构域的疏水特性，所以利用氨基酸序列的疏水性预测跨膜结构域的数量以及起止位点。
HarmOR13全长425aa。利用https://topcons.net/pred/预测得到七个跨膜结构域(TM)，氨基酸序号45-65，75-95，135-155，209-229，297-317，330-350，394-414，分别为HarmOR13-TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7。HarmOR6全长425aa，预测得到7个跨膜结构域，氨基酸序号55-75，86-106，145-165，220-240，302-322，333-353，400-420，分别为HarmOR6-TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7。表1列出了HarmOR13、HarmOR6的7个跨膜结构域的序列。
表1.HarmOR13、HarmOR6的7个TM的氨基酸序列.
1.3、三级结构的建模
在二级结构中确定了的跨膜结构域(21aa)上下游选择40个氨基酸的序列作为建模序列，利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对带有跨膜结构域的肽链(40aa)分别建模,HarmOR13和HarmOR6分别得到了7条α螺旋结构的肽链(图5)。同时跨膜结构域α螺旋结构的特性，且无影响结构预测的β折叠及loop区，因此认为这些建模结果可靠。
1.4、结合位点分析预测可能的结合位点及设计ORP序列
利用Discovery Studio2016中CDOCKER精准对接功能将各个跨膜结构域的3D结构分别与配体分子对接。CDOCKER的操作步骤(settings)：打开receptor文件；利用sketch功能绘制配体；定义receptor活性位点；点击CDOCKER进行精准对接；分析对接结果。利用sketch绘制的构象不同产生的对接结果不同，多次对接后我们记录了所有结果的结合位点。结果中可以查看配体分子每个pose相应的-CDOCKER_ENERGY值，该值越高，表明结合的pose越佳。
HarmOR13对接结果中，配体为Z11-16:Ald，其中与TM4、TM6对接成功。经过多次对接，TM4上的结合位点分别为，220(Thr，Threonine)、222(Ser，Serine)、226(Phe，Phenylalanine)，最低cdocker energy为-8.07004。其中TM6上的结合位点为，337(Phe,Phenylalanine)、338(Gln，Glutamine)最低cdocker energy为-6.53487。在结合位点两侧选择了9-14个氨基酸序列为待合成序列，分别为
HarmOR6对接结果中，配体为Z9-16:Ald，与TM7对接成功，多次对接后，在TM7上的结合位点为409(Ala，Alanine)、413(Lys，Lysine)，最低cdocker energy为-11.0452。配体为Z9-14Ald，与TM7对接成功，在TM7上的结合位点为409(Ala，Alanine)、410(Ala，Alanine)、413(Lys，Lysine)，最低cdocker energy为-11.3238。当配体为Z9-16OH，与TM7对接成功，结合位点413(Lys，Lysine)，414(Thr，Threonine)，415(Ser，Serine)，最低cdockerenergy为-10.1495。设计的待合成氨基酸序列为
2、气味受体衍生肽的制备及与SWCNTs连接
分别在气味受体衍生肽ORP1:
3、性信息素气体
性信息素1-4标准品均购自江苏宁录科技股份有限公司(江苏，中国)。使用正己烷将这些溶液稀释至所需浓度。将试剂密封并保存在室温下。将瓶中的气体气化并气化注入进测量箱。
目标物质气体标准样品由购买的目标物质稀释(％v/v，分析级)生成。为了确定所需的目标溶液的体积，使用公式(1)，其中V
V
4、制备气味受体衍生肽传感器
首先，对单壁碳纳米管进行羧基改性(成都中科时代纳能科技有限公司生产的羧基化单壁碳纳米管)。将羧基化单壁碳纳米管悬浮在纯乙醇中，超声振动20分钟，得到浓度为0.1mg/mL的悬浮液。然后在叉指电极(14对金电极，电极宽度＝0.15mm，电极间距＝0.18mm，电极厚度＝5μm，基底材料为Al
5、气体检测
以气味受体衍生肽传感器的电阻变化作为检测信号。传感器被放在一个封闭的检测箱中。传感器的实时电阻值由直流探头和电阻分析仪(HPS2518，常州海尔帕电子技术有限公司)测量。当传感器电阻值稳定时，将密闭瓶中的气体用注射器注入检测箱中，注入后密封检测箱。传感器对棉铃虫性信息素的响应以ΔR/R
6、棉铃虫产生的气体的检测
棉铃虫饲养到幼虫化蛹后，在人工气候箱中等待羽化，光周期为16：8(light:dark)，温度26℃，湿度60％。据此前研究表明，棉铃虫在羽化后第二个暗期第六个小时，性腺中信息素释放含量最高，推测第六个小时释放量最高。所以棉铃虫羽化后，在第二个暗期的第四个小时，把装有不同数量的棉铃虫的虫笼放入实验箱，关灯并用黑布罩住试验箱保持暗期环境监测四小时，四小时后，开灯并取掉罩住试验箱的黑布，再维持一个小时的光期，之后开箱半小时，观察传感器信号变化
实施例2
试验检测结果
1、气味受体衍生肽传感器检测性信息素标准品
如图4所示，气味受体衍生肽传感器对性信息素气体的响应图，通过多周期实时测量传感器的电阻变化。
图中a:气味受体衍生肽1传感器对浓度为：10ppb至100ppm的性信息素1气体的响应；
图中b:气味受体衍生肽2传感器对浓度为：100ppm至10ppm的性信息素1气体的响应；
图中c:气味受体衍生肽3传感器对浓度为：100ppb至100ppm的性信息素2气体的响应；
图中d:气味受体衍生肽3传感器对浓度为：100ppm至10ppm的性信息素3气体的响应；
图中e:气味受体衍生肽3传感器对浓度为：1ppm至100ppm的性信息素4气体的响应；
本实施例一个测量周期包括气入和气出状态。气体进入状态时，封闭检测室充满了性信息素气体，气体排出状态时，用新鲜空气冲洗检测室，直到没有性信息素气体。不含气味受体衍生肽的传感器的电阻在不同种类和浓度的性信息素下没有变化，这表明裸单壁碳纳米管对性信息素没有响应。肽1的传感器可以检测到10ppb的主要性信息素。肽2传感器可以检测到100ppb的主要性信息。肽3传感器可以检测到100ppb的性信息素1,100ppb的性信息素2，1ppm的性信息素3。总体来说，所有的气味受体衍生肽对性信息素都表现出来高敏感性。
此外，比较了能测到性信息素1的肽1和肽2的灵敏度，发现肽1的性能明显优于肽二。与软件预测中的结合能大小关系相符。然后，比较了肽3对性信息素1、2、3的灵敏度。肽3传感器相对比肽1传感器，敏感性、检测范围等性能都有所欠缺。且雌性棉铃虫的信息素1、2、3释放量远低于性信息素1(释放的性信息素1为占比为90％，众多别的性信息素共10％)，所以后续实验使用识别能力最强的肽1。
2、气味受体衍生肽传感器检测棉铃虫释放的性信息素
如图5所示，本实施例制备的气味受体衍生肽传感器对不同数量、不同性别的棉铃虫活体产生的性信息素气体的响应。对于雄性棉铃虫，气味受体衍生肽传感器的电阻没有明显的变化，表明雄性棉铃虫未产生信息素，且产生的别的气味不影响传感器的反应。相比之下，气味受体衍生肽传感器对雌性棉铃虫具有显著的响应。具体而言，随着雌棉铃虫数量以及检测时间的增加，气味受体衍生肽传感器表现出较大的电阻变化。可以识别到一只雌性棉铃虫释放的性信息素。对于未连接气味受体衍生肽的裸单壁碳纳米管对30只雌性棉铃虫无响应，表明单壁碳纳米管是识别棉铃虫释放的信息素特异性传感材料。
本发明的气味受体衍生肽传感器能够检测出浓度低至10ppb的性信息素1以及100ppb的性信息素2、性信息素3和1ppm的性信息素4。气味受体衍生肽1传感器对不同数量与性别的棉铃虫进行了高效的实时检测，并实现了实验条件下单只棉铃虫的检测。结果表明，该方法制备的气味受体衍生肽传感器不仅可以提供一种监测棉铃虫灾的方法，还可以提了供一种观察棉铃虫释放性信息素行为方法。在未来农林中的虫害的实时监测和研究昆虫行为的机理等方面有巨大的应用潜力。
序列表
<110> 东北林业大学
<120> 一种能有效监测棉铃虫的性信息素受体衍生肽及其生物传感器
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Leu Thr Val Ser Leu Val Ile Phe His Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Val Ile Phe Gln Gln Leu Ile Gln Ile
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Met Ala Ala Ile Leu Lys Thr Ser Met Ser
1 5 10
