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法律状态信息
法律状态
2022-05-20
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明属于植物分子标记技术领域，具体涉及一种利用微卫星分子标记鉴定侧柏无性系的方法及其应用。
背景技术
侧柏属(Platycladus Spach)植物含有1种，即侧柏(Platycladus orientalis(L.)Franco)，分布于中国、朝鲜半岛和俄罗斯远东地区，是我国有最广自然分布区的常绿针叶树种，具有较高的生态与经济利用价值，是我国北方重要的生态抗逆树种之一。我国侧柏种质资源丰富，分为4个种子区7个种子亚区，在不同分布区或栽培区形成了不同的种源、无性系。目前侧柏育种资源的利用仍处于初级阶段，由于侧柏不同品种或不同无性系之间形态学差异较小，无性繁殖后代无法通过常规形态学手段快速鉴定，从而造成育种资源遗传背景不清，植物新品保护和良种利用效益较低。
分子标记技术的出现，使植物种质资源精准鉴定成为可能。微卫星(SimpleSequence Repeats，SSR)分子标记被认为是一种稳定、精确、高效的分子标记技术，在植物遗传多样性分析、种质资源亲缘关系分析与鉴定、指纹图谱及DNA数据库构建等方面得到了广泛应用。目前侧柏遗传研究中也开发了一些微卫星分子标记并已应用于遗传评价分析，但利用微卫星分子标记进行侧柏无性系鉴定并构建指纹图谱的研究还未见报道。
高效、多态、稳定的微卫星分子标记引物是实现种质鉴定的关键。尽管目前已经开发的一些微卫星分子标记在侧柏遗传评价中得以应用，但不同引物间差异较大，或重复性较差、或多态性较低、或杂带较多，严重影响其鉴定与分析的精确性。因此迫切需要开发出高效、稳定、检测精确性高的微卫星分子标记组合，以更好的服务于侧柏属植物的新品种保护与良种培育。
发明内容
本发明的目的是提供一组能够直接应用于侧柏属植物种内及种间，实用性较高的高效多态、稳定可靠、精确性高、操作简单的微卫星分子标记组合、及其筛选方法和品种鉴定方法。
本发明首先提供了一组SSR引物(SSR引物组)。
本发明提供的SSR引物组包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7；
所述引物对1(编号为POL-SSR1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2(编号为POL-SSR2)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3(编号为POL-SSR3)由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4(编号为POL-SSR4)由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5(编号为POL-SSR5)由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6(编号为POL-SSR6)由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7(编号为POL-SSR7)由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成。
上述SSR引物组中，所述编号为POL-SSR1的微卫星分子标记的重复序列为(AG)
进一步的，所述SSR引物组由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7组成。
更进一步的，所述SSR引物组中，每个引物对中的一条引物(如正向引物)进行荧光标记。在本发明中，所述荧光标记具体为6-FAM荧光基团。
本发明又提供了上述SSR引物组的新用途。
本发明提供了上述SSR引物组在如下m1)-m12)中任一种中的应用：
m1)侧柏鉴定和/或分类；
m2)侧柏遗传多样性分析和/或遗传结构分析；
m3)侧柏亲缘关系分析与鉴定；
m4)侧柏指纹图谱和/或DNA数据库构建；
m5)侧柏分子标记辅助育种；
m6)侧柏种质资源保护与利用；
m7)制备侧柏鉴定和/或分类的产品；
m8)制备侧柏遗传多样性分析和/或遗传结构分析的产品；
m9)制备侧柏亲缘关系分析与鉴定的产品；
m10)制备侧柏指纹图谱和/或DNA数据库构建的产品；
m11)制备侧柏分子标记辅助育种的产品；
m12)制备侧柏种质资源保护与利用的产品。
本发明还提供了含有上述SSR引物组的PCR试剂，以及含有上述SSR引物组的试剂盒或含有所述PCR试剂的试剂盒。
上述PCR试剂或试剂盒中，所述PCR试剂由PCR试剂1至PCR试剂7组成；每个PCR试剂中含有一种引物对，所述引物对中的引物在其所在PCR试剂中为等摩尔混合。
上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述SSR引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。
本发明还提供了上述PCR试剂或试剂盒的新用途。
本发明提供了上述PCR试剂或试剂盒在如下n1)-n6)中任一种中的应用：
n1)侧柏鉴定和/或分类；
n2)侧柏遗传多样性分析和/或遗传结构分析；
n3)侧柏亲缘关系分析与鉴定；
n4)侧柏指纹图谱和/或DNA数据库构建；
n5)侧柏分子标记辅助育种；
n6)侧柏种质资源保护与利用。
本发明还提供了一种利用上述SSR引物组进行侧柏遗传多样性分析或亲缘关系鉴定的方法。
本发明提供的利用上述SSR引物组进行侧柏遗传多样性分析或亲缘关系鉴定的方法包括以下步骤：
(x1)采用上述SSR引物组对侧柏的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(x2)利用毛细管凝胶电泳对步骤(x1)获取的PCR扩增产物进行检测与分析，获取扩增谱带数据并统计引物扩增位点信息；
(x3)根据步骤(x2)获取的数据信息进行遗传多样性分析或亲缘关系鉴定。
进一步的，所述PCR扩增为降落式PCR扩增，所述降落式PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，10个循坏；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s，27个循坏；72℃延伸10min。
所述降落式PCR扩增反应体系为20μL，包括ddH
更进一步的，所述遗传多样性分析的参数包括等位基因数、有效等位基因数、香农信息指数、期望杂合度、观察杂合度和多态性信息含量。
所述遗传多样性分析和亲缘关系分析的方法包括如下步骤：利用GeneMarker软件中的Fragment(plant)片段分析软件对毛细管电泳的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小；然后分别利用Convert软件进行数据转换，利用Popgene1.32软件获取遗传参数并进行遗传多样性分析；再用iTOL构建供试侧柏材料亲缘关系系统进化树，根据不同个体分开的程度，判断供试侧柏材料亲缘关系的远近。
本发明还提供了一种利用上述SSR引物组进行侧柏无性系指纹图谱构建的方法。
本发明提供的利用上述SSR引物组进行侧柏指纹图谱构建的方法包括如下步骤：采用上述SSR引物组中的每个引物对分别对不同侧柏种质材料的基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行毛细管凝胶电泳，得到每个引物对对不同侧柏种质材料扩增的产物条带带型，即构建得到不同侧柏种质材料的指纹图谱。
本发明最后提供了上述SSR引物组的筛选方法。
本发明提供的上述SSR引物组的筛选方法包括如下步骤：
(y1)初选
所述初选是利用琼脂糖凝胶电泳对不同侧柏混合样品的扩增产物进行分析，初步筛选扩增产物良好的引物；
(y2)复选
所述复选是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对少量形态特征差异较大的侧柏个体的扩增产物进行垂直电泳分析，筛选出具有多态性的引物；
(y3)决选
所述决选是利用毛细管电泳对不同侧柏种质的扩增产物的多态性和稳定性进行分析，决选出高效稳定的多态性微卫星分子标记引物。
进一步的，所述初选中，利用2.0％琼脂糖凝胶进行所述琼脂糖凝胶电泳检测。所述复选中，利用6.0％聚丙烯酰胺凝胶进行所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
更进一步的，所述初选中，所述不同侧柏混合样品为6个分别由不同侧柏品种(无性系)混合而成的样品。所述不同侧柏品种(无性系)或不同侧柏种质材料为表1所示的84个侧柏品种(无性系)。
所述复选中，所述少量形态特征差异较大的侧柏为蝶叶侧柏、立叶侧柏、垂枝侧柏和优系1033号。
所述决选中，所述不同侧柏种质为青龙山1号、法海寺1号、法海寺2号、青龙山3号、青龙山4号、青龙山5号、青龙山6号、青龙山7号、1773号、1774号、垂枝侧柏、锥峰山1号、九搂十八杈、1019号、1029号、1031号、1033号、1088号、蝶叶侧柏和立叶侧柏。
上述任一所述应用或方法中，所述侧柏不仅包括侧柏属的各种侧柏品种、种质资源、无性系、家系、优系、优株，还包括其变种、栽培变种，以及它们的无性繁育(如扦插繁殖、嫁接繁殖)后代。
本发明首先利用2.0％琼脂糖凝胶电泳对6个分别由不同侧柏品种(无性系)混合而成的样品进行了大量引物的初选，从149对SSR引物中筛选出108对主带清晰的引物；然后利用6.0％聚丙烯酰胺凝胶电泳对少量形态特征差异较大的侧柏样品进行引物复选，筛选出特异条带清晰、无特异扩增少、多态性高的21对引物；最后合成荧光引物对不同侧柏种质进行高效毛细管电泳分析，并通过多态位点和峰值分析，最终筛选出一个由7对SSR引物(POL-SSR1、POL-SSR2、POL-SSR3、POL-SSR4、POL-SSR5、POL-SSR6、POL-SSR7)组成的鉴别效率最优的组合，可将84份侧柏种质材料进行鉴定区分。利用本发明筛选的多态性微卫星分子标记组合鉴定侧柏的方法具有高效、低成本且不受外界条件干扰等优点，不仅可广泛应用于侧柏属植物种质资源亲缘关系鉴定、遗传多样性分析、构建侧柏优良无性系(品种)的指纹图谱等领域，还可用于对侧柏优良无性系、优良品种、优良单株及其无性繁育后代进行早期鉴定，以及用于我国侧柏属植物新品种保护与良种选育，为侧柏属植物新品种权益保护提供技术支撑。
附图说明
图1为利用本发明的7对荧光微卫星分子标记引物对84份侧柏品种(无性系)基因组扩增结果的亲缘关系聚类图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的侧柏品种(无性系)均来源于北京市农林科学院林业果树研究所侧柏种质资源圃，具体如下：
青龙山1号-青龙山12号(又名京平柏1-12号，简写为QLS-1
法海寺1号-法海寺3号(又名京海柏1号～3号，简写为FHS-1
锥峰山3号-锥峰山5号(简写为ZFS-3
蝶叶侧柏：经过北京市林木良种审定委员会审定的侧柏良种(简写为DY，良种编号：京-S-SV-PO-001-2006)(平台资源号1111C0003115000707)；
立叶侧柏、垂枝侧柏、林果1号、林果2号：在北京市海淀区自然分布的侧柏林中，经实生选优获得优良无性系；
1733号、1747号、1763号、1771号、1773号-1777号(简写为JX-1733
1002号-1096号(37个)、1870号、2004号：在栽培变种洒金柏实生后代中，经实生选优获得优良无性系；
侧西优1号-侧西优11号、侧西垂1号-侧西垂2号：在北京市西山国家森林公园实生侧柏林中，经实生选优获得优良无性系。
实施例1、一种获得侧柏多态性微卫星分子标记引物组合的方法
1、引物初选
1.1供试材料
供试材料为84个侧柏品种(无性系)叶片样品，具体如表1所示，来源于北京市农林科学院林业果树研究所侧柏种质资源圃。
1.2混合样品的制备
将84份侧柏叶片样品每14份一组，随机分成6组，混合样品由来自任意14份叶片混合而成。
1.3DNA提取与检测
采用改良CTAB法提取侧柏叶片的基因组DNA。提取产物取2-3μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4引物的合成
从已发表的在北美乔柏、欧刺柏、罗汉柏、侧柏、香漆柏、祁连圆柏、圆柏、福建柏等近缘种属上开发出的微卫星引物中合成149对。
1.5PCR扩增进行引物筛选
引物筛选所用PCR反应体系为20μL，包括ddH
引物筛选所用降落式PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，10个循坏；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s，27个循坏；72℃延伸10min。
1.6琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物
利用2.0％琼脂糖凝胶电泳对6组混合样品的扩增产物进行分析，筛选出得到目的基因产物的微卫星分子标记引物108对。
2、引物复选
2.1供试材料
供试材料为叶形、叶色、冠形等形态特征差异较大的4个侧柏品种(无性系)(分别为蝶叶侧柏、立叶侧柏、垂枝侧柏和优系1033号)叶片样品，来源于北京市农林科学院林业果树研究所侧柏种质资源圃。
2.2DNA提取与检测
采用改良CTAB法提取侧柏叶片基因组DNA。提取产物取2-3μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.3引物的合成
根据1.6琼脂糖凝胶电泳结果，合成初选获得的108对扩增目的基因清晰的引物。
2.4PCR扩增进行引物筛选
引物筛选所用PCR反应体系为20μL，包括ddH
引物筛选所用PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，10个循坏；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s，27个循坏；72℃延伸10min。
2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物
利用6.0％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行垂直电泳分析，复选出特异条带清晰、无特异扩增少、多态性高的微卫星分子标记引物21对。
3、引物决选
3.1供试材料
供试材料为20个侧柏无性系(分别为青龙山1号、法海寺1号、法海寺2号、青龙山3号、青龙山4号、青龙山5号、青龙山6号、青龙山7号、1773号、1774号、垂枝侧柏、锥峰山1号、九搂十八杈、1019号、1029号、1031号、1033号、1088号、蝶叶侧柏、立叶侧柏)的叶片样品，来源于北京市农林科学院林业果树研究所侧柏种质资源圃。
3.2DNA提取与检测
采用改良CTAB法提取侧柏叶片基因组DNA。提取产物取2-3μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.3引物的合成
根据2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果，合成复选获得的21对正向引物序列5’端添加6-FAM的荧光微卫星分子标记引物。
3.4引物筛选PCR扩增
引物筛选所用PCR反应体系为20μL，包括ddH
引物筛选所用PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，10个循坏；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s，27个循坏；72℃延伸10min。
3.5毛细管凝胶电泳检测荧光PCR扩增产物
荧光PCR产物送至北京博友顺生物技术有限公司进行毛细管凝胶电泳检测。具体方法为：将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。通过原始数据和峰型分析，最终筛选出7对扩增稳定、高效多态的微卫星分子标记引物组成侧柏多态性微卫星分子标记组合，以用于侧柏亲缘关系分析与鉴定。
所述侧柏多态性微卫星分子标记组合由7对引物组成(POL-SSR1、POL-SSR2、POL-SSR3、POL-SSR4、POL-SSR5、POL-SSR6和POL-SSR7)。
用于PCR扩增的分子标记POL-SSR1的重复序列为(AG)
正向引物序列：5’-GTCGGGAGTTCTTGAACGAG-3’(序列1)；
反向引物序列：5’-AAACTCTCATCCCTTCTTGGG-3’(序列2)。
用于PCR扩增的分子标记POL-SSR2的重复序列为(AC)
正向引物序列：5’-ATGGCTTTATTGCATCCGTC-3’(序列3)；
反向引物序列：5’-ACAGAACATAGCATTAAACACCCA-3’(序列4)。
用于PCR扩增的分子标记POL-SSR3的重复序列为(AAAC)
正向引物序列：5’-CTCACTTCCTGCCATAAGCC-3’(序列5)；
反向引物序列：5’-CAAGTTGAACAGCCTCAGCA-3’(序列6)。
用于PCR扩增的分子标记POL-SSR4的重复序列为(AAG)
正向引物序列：5’-TCTTGCTCTCAAACCATCCC-3’(序列7)；
反向引物序列：5’-CCCATCATTCCCAATACCAA-3’(序列8)。
用于PCR扩增的分子标记POL-SSR5的重复序列为(AT)
正向引物序列：5’-GGGAAGCGGAAAGCTATTTT-3’(序列9)；
反向引物序列：5’-GGTAATCCACAGCAGCCAAT-3’(序列10)。
用于PCR扩增的分子标记POL-SSR6的重复序列为(AC)
正向引物序列：5’-TTCTAGCTCGCACCCAAACT-3’(序列11)；
反向引物序列：5’-TTGTTTCGCCGATATGTTCA-3’(序列12)。
用于PCR扩增的分子标记POL-SSR7的重复序列为(GA)
正向引物序列：5’-AATTGGAATAATCATATATGCT-3’(序列13)；
反向引物序列：5’-TCTTTCACTTTCTCCCCTT-3’(序列14)。
实施例2、一种利用实施例1提供的多态性微卫星分子标记引物鉴定侧柏的方法
1、供试材料
供试材料为84个侧柏叶片样品，来源于北京市农林科学院林业果树研究所侧柏种质资源圃。其中，侧柏栽培变种垂枝侧柏3份(对应序号为17、79和80对应的材料)，侧柏栽培变种洒金柏39份(序号为29-67对应的材料)，其余42份均为侧柏品种(无性系)，具体编号及名称如表1所示。
表1、84份侧柏种质相关信息
2、DNA提取与检测
采用改良CTAB法提取84份侧柏品种(无性系)叶片的基因组DNA。提取产物取2-3μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
3、荧光引物合成
分别在实施例1筛选出的7对侧柏微卫星分子标记的多态性引物的正向引物序列5’端加上6-FAM荧光集团，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。
4、微卫星荧光引物PCR扩增
本发明采用降落式PCR进行扩增。
微卫星荧光引物PCR扩增反应体系为20μL，包括ddH
微卫星荧光引物PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，10个循坏；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s，27个循坏；72℃延伸10min。
5、毛细管电泳检测
将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。
6、数据标准化处理
根据每对荧光引物对不同侧柏品种(无性系)扩增条带分子量的大小，按从小到大依次编码为1-8(表2)。当引物对某一侧柏品种(无性系)扩增有2个等位基因时，按等位基因碱基数较小的条带编码进行赋值(表3)，并通过非加权配对算术平均法进行聚类分析，建立亲缘关系图(图1)。
表2、本发明中微卫星分子标记引物扩增等位基因谱带大小及相应等位基因赋值标准
表3、由7位数字构成的84份侧柏的DNA分子身份证
7、鉴定效率评价
本发明根据引物对不同侧柏品种(无性系)扩增条带分子量的大小进行编码、组合，构建了84份侧柏种质材料的分子身份证，其中7对微卫星分子标记引物可将84份侧柏种质材料中的71份两两区分开，虽然有11份侧柏种质材料不能用此指纹鉴别，但其鉴别效率仍高于微卫星标记在苹果(用10个微卫星标记将41份苹果品种区分开)和山茶(用7对微卫星引物将24份山茶种质区分开来)上的应用效果。而根据非加权配对算术平均法构建的亲缘关系聚类图，利用该7对微卫星分子标记引物则可以完全将84份侧柏种质材料区分开来。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种利用微卫星分子标记鉴定侧柏无性系的方法及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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