分子标记及其应用和鉴定无患子与毛瓣无患子种质的方法

摘要

本发明公开一种分子标记及其应用和鉴定无患子与毛瓣无患子种质的方法，所述分子标记，包括引物Samuk10G0092500、Samuk04G0084900、Samuk07G0006800、Samuk12G0105900和或Samuk03G0235800：用于鉴定无患子与毛瓣无患子种质；提取待测无患子或毛瓣无患子幼嫩叶片样品的DNA；根据SSR分子标记进行PCR扩增；毛细管电泳上机检测；对样品的原始数据进行分析，构建系统发育树；检测种质扩增产物结果判定其为无患子或毛瓣无患子。本发明基于基因测序仪建立的荧光标记SSR毛细管电泳检测法是荧光测序技术与SSR分子标记技术的有效结合，实现了对SSR分子标记扩增产物长度的高效和准确获取，能够区分2bp之内的差异片段，准确获得扩增产物长度，检测结果更为稳定、准确和高效。

说明书

技术领域

本发明属于无患子种质鉴定领域，涉及用于鉴定无患子与毛瓣无患子种质的分子标记，以及该分子标记的应用，以及使用该分子标记鉴定无患子与毛瓣无患子种质的方法。

背景技术

无患子(Sapindus mukorossi Gaertn.)和毛瓣无患子(Sapindus rarak DC.)是无患子科(Sapindaceae)无患子属(Sapindus L.)乔木，在国外称肥皂果(Soapberry)，在国内也称洗手果、肥皂树、皮哨子等，毛瓣无患子仅在我国云南省分布，无患子在我国南方地区广泛分布。无患子与毛瓣无患子种仁含油率高达40％左右，油脂中油酸和亚油酸高达62.5％，C16～C20的脂肪酸占98.2％，符合现代生物质柴油各项标准，也可精炼为高档润滑油；果肉中含皂苷5～28％，是优良的天然洗涤化妆品原料，洗脱率超过90％；种壳可制作高级活性炭；国内外研究发现其种仁、果肉、根系中有极具开发潜力的抗癌、降脂、降压的功能性活性成分。因此，无患子与毛瓣无患子是我国集生物能源、生物化工和生物医药等于一体的多功能原料树种。

我国无患子与毛瓣无患子为无患子属近缘种，在我国云南省均有分布，种质资源丰富，但表型性状相似且易受发育阶段、栽培措施及环境条件影响，在云南省无患子与毛瓣无患子交错分布地区，很难从当代的表型区分无患子与毛瓣无患子，这给无患子与毛瓣无患子树种种质鉴定、杂交育种、新品种选育等带来了很大困难。因此本研究团队开展分子生物学SSR分子标记辅助鉴定无患子与毛瓣无患子种质资源，促进无患子与毛瓣无患子良种选育，加快种质资源的开发利用，保护无患子与毛瓣无患子种质资源多样性。

现有技术中还没有利用转录组测序的SSR分子标记鉴定无患子与毛瓣无患子种质相关的文献资料公开。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种能够快速、准确地鉴定无患子与毛瓣无患子种质的分子标记。

本发明的另一目的是提供一种鉴定无患子与毛瓣无患子种质的分子标记的应用。

本发明的又一目的是提供一种鉴定无患子与毛瓣无患子种质的方法。

发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种分子标记，用于鉴定无患子与毛瓣无患子种质，所述分子标记为下列引物中的一对或多对序列：

Samuk10G0092500：

上游引物：5'-TTCTTCCGATTGAGCGCCAT-3'；

下游引物：5'-CGAATCCAGTGGCAGTAGCA-3'；

Samuk04G0084900：

上游引物：5'-CTAGCTGTGGGGGCACATAC-3'；

下游引物：5'-GCATATTAGCACCGACCGGA-3'；

Samuk07G0006800：

上游引物：5'-GAAGCCGGATCTAATGGGCA-3'；

下游引物：5'-TCACTCCAACAGCCTTGTCC-3'；

Samuk12G0105900：

上游引物：5'-AGGAGATTCAAGTGGTGGCG-3'；

下游引物：5'-GACGACGTACACTGCTCCAT-3'；

Samuk03G0235800：

上游引物：5'-CAGTCCGATCTCAGCAGCAT-3'；

下游引物：5'-TTGCCCTAGGGTGTTCTTGG-3'。

本发明还提供了一种前述分子标记的应用，用于鉴定无患子与毛瓣无患子种质，包括以下步骤：

1)提取待测无患子或毛瓣无患子幼嫩叶片样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据SSR分子标记进行PCR扩增；

3)毛细管电泳上机检测；

取步骤2)所得PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；

4)对样品的原始数据进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；进一步分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与毛瓣无患子种质0/1矩阵，计算遗传距离，构建系统发育树；

5)根据检测种质扩增产物结果判定其为无患子或毛瓣无患子。

根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述步骤2)中，SSR分子标记为下列引物中的一对或多对序列：

Samuk10G0092500：

上游引物：5'-TTCTTCCGATTGAGCGCCAT-3'；

下游引物：5'-CGAATCCAGTGGCAGTAGCA-3'；

Samuk04G0084900：

上游引物：5'-CTAGCTGTGGGGGCACATAC-3'；

下游引物：5'-GCATATTAGCACCGACCGGA-3'；

Samuk07G0006800：

上游引物：5'-GAAGCCGGATCTAATGGGCA-3'；

下游引物：5'-TCACTCCAACAGCCTTGTCC-3'；

Samuk12G0105900：

上游引物：5'-AGGAGATTCAAGTGGTGGCG-3'；

下游引物：5'-GACGACGTACACTGCTCCAT-3'；

Samuk03G0235800：

上游引物：5'-CAGTCCGATCTCAGCAGCAT-3'；

下游引物：5'-TTGCCCTAGGGTGTTCTTGG-3'。

根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述步骤2)中，

所述PCR扩增采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR反应混合物10μL，及适量ddH

PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度52℃复性30s，72℃延伸30s，95℃变性30s，退火温度50℃复性30s，72℃延伸30s，20次循环后72℃延伸10min；4℃存储。

根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述步骤3)中，上机检测所用仪器为基因分析仪ABI 3730XL DNA analyzer、毛细管ABI 96×50cm 4331246。

根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述基因分析仪参数设置如下：

Module File:GeneMapper50_POP7_1；

Run Voltage:15.0kv；

Injection Voltage:1.6kv；

Injection Duration:15sec；

Temperature:63DegC；

Current_Stability:30.0uA。

根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述PCR反应混合物为MgCl

根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述步骤4)具体为：对样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与毛瓣无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树。

本发明还提供了基于前述分子标记鉴定无患子与毛瓣无患子种质的方法，步骤如下：

1)提取待测无患子或毛瓣无患子幼嫩叶片样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据所述分子标记进行PCR扩增；

所述PCR采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR反应混合物10μL，及适量ddH

PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度52℃复性30s，72℃延伸30s，95℃变性30s，退火温度50℃复性30s，72℃延伸30s，20次循环后72℃延伸10min；4℃存储；

3)毛细管电泳上机检测；

取步骤2)PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；上机检测仪器：基因分析仪ABI3730XL DNA analyzer、毛细管ABI 96×50cm 4331246；

4)电泳结束后，对样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度。利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与毛瓣无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树；

5)根据检测种质扩增产物结果判定其为无患子或毛瓣无患子。

根据本发明鉴定无患子与毛瓣无患子种质的方法的一个实施方式，所述步骤2)中，分子标记为下列引物中的一对或多对序列：

Samuk10G0092500：

上游引物：5'-TTCTTCCGATTGAGCGCCAT-3'；

下游引物：5'-CGAATCCAGTGGCAGTAGCA-3'；

Samuk04G0084900：

上游引物：5'-CTAGCTGTGGGGGCACATAC-3'；

下游引物：5'-GCATATTAGCACCGACCGGA-3'；

Samuk07G0006800：

上游引物：5'-GAAGCCGGATCTAATGGGCA-3'；

下游引物：5'-TCACTCCAACAGCCTTGTCC-3'；

Samuk12G0105900：

上游引物：5'-AGGAGATTCAAGTGGTGGCG-3'；

下游引物：5'-GACGACGTACACTGCTCCAT-3'；

Samuk03G0235800：

上游引物：5'-CAGTCCGATCTCAGCAGCAT-3'；

下游引物：5'-TTGCCCTAGGGTGTTCTTGG-3'。

与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：

本发明与传统形态学、孢粉学及生化鉴定相比，本SSR特异性引物鉴定技术拥有非常明显的优势：

(1)鉴定准确，可以有效判定无患子与毛瓣无患子种质；

(2)在生长发育不同时期和组织都能检测到，几乎不受环境影响；

(3)检测方便，检测样品仅需种质的微量叶片或其他组织，检测成本极低；

(4)SSR分子标记等位变异高、共显性遗传、稳定性好、操作简便快速。

本发明基于基因测序仪建立的荧光标记SSR毛细管电泳检测法是荧光测序技术与SSR分子标记技术的有效结合，实现了对SSR分子标记扩增产物长度的高效和准确获取，能够区分2bp之内的差异片段，准确获得扩增产物长度，检测结果更为稳定、准确和高效。

附图说明

图1是无患子与毛瓣无患子种质在Samuk10G0092500引物扩增后电泳图。

图2是A组SSR引物构建系统发育树。

图3是B组SSR引物构建系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例进行说明。

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。

实施例1

本实施例中，发明人经过大量的试验研究，筛选得到5对SSR特异性引物。在无患子与毛瓣无患子种质鉴定过程中，可以选择其中1对或2对或3对或4对或5作为SSR分子标记。5对SSR特异性引物见表1或序列表中1～10号序列。

表1筛选得到的5对SSR特异性引物信息

实施例2

本实施例是基于实施例1所述SSR分子标记在无患子与毛瓣无患子种质鉴定方法中的应用。

利用转录组测序的SSR分子标记鉴定无患子与毛瓣无患子种质的步骤如下。

1)提取待测无患子或毛瓣无患子幼嫩叶片样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据SSR分子标记进行PCR扩增；

所述PCR采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR MasterMix(MgCl

PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度52℃复性30s，72℃延伸30s，95℃变性30s，退火温度50℃复性30s，72℃延伸30s，20次循环后72℃延伸10min；4℃存储。

所述SSR标记引物选自实施例1所述3对SSR特异性引物中的1对、2对或3对。

3)毛细管电泳上机检测；

在步骤2)中，取PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机(基因分析仪ABI 3730XL DNAanalyzer、毛细管ABI 96×50cm 4331246)检测，具体参数见下表：

表2基因分析仪参数设置

4)电泳结束后，对样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度。利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与毛瓣无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树。

5)根据检测种质扩增产物结果判定其为无患子或毛瓣无患子。

实施例3

本实施例对利用实施例1所述SSR分子标记鉴定无患子或毛瓣无患子的方法进行进一步详细的描述，方法的具体步骤如下。

1)利用天根高效植物基因组DNA提取试剂盒(DP320-03)提取20份我国不同省份无患子与毛瓣无患子(表3)种质幼嫩叶片样品的DNA。

表3无患子与毛瓣无患子种质信息

本实施例中，设置两组SSR特异性引物对照。实验组A组为本发明实施例1所述5对SSR特异性引物，分别是S78、S129、S105、S449和S38(序列信息见表1)，对照组B组是发明人在完成本发明过程中大量试验数据中随机摘选的其它5对SSR特异性引物，分别是S704、S36、S63、S140、S449(序列信息见序列表中11～20号序列或表4)，两组特异性SSR正、反向引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

表4 B组SSR特异性引物信息

2)以步骤1)提取的DNA为模板，分别利用上述A、B两组SSR特异性引物进行PCR扩增，所用PCR仪型号为Bio-rad T100热循环PCR仪。

所述PCR体系采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR MasterMix(MgCl

PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度52℃复性30s，72℃延伸30s，95℃变性30s，退火温度50℃复性30s，72℃延伸30s，20次循环后72℃延伸10min；4℃存储。

3)毛细管电泳上机检测；

在步骤2)中，取PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机(基因分析仪ABI 3730XL DNAanalyzer、毛细管ABI 96×50cm 4331246)检测，具体参数见下表：

4)电泳结束后，分别对两组样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度。利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与毛瓣无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树。

表5无患子与毛瓣无患子种质A组引物扩增产物长度

**代表无条带。

表6无患子与毛瓣无患子种质B组引物扩增产物长度

**代表无条带。

实验结果如表5、表6所示，无患子与毛瓣无患子种质在两组特异性SSR引物的扩增产物差异明显。A组中(表5)，毛瓣无患子种质ind14-16、18-20在S129特异性引物扩增下产物为180bp纯合体或183bp和189bp杂合体；在S78特异性引物扩增下产物均为180bp，为纯合体；在S105特异性引物扩增下产物均为231bp和234bp，为杂合体；在S449特异性引物扩增下产物均为168bp，为纯合体；在S38特异性引物扩增下，毛瓣无患子种质间产物长度有所差距，但与无患子产物长度相差明显。B组中(表6)，5对SSR特异性引物扩增产物均有所差异，种质间差异明显，但无法有效鉴定无患子与毛瓣无患子种质。根据各种质扩增产物长度换算为0/1矩阵，并在Nysts软件中计算遗传距离矩阵，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树，分析结果如图2、图3所示，A组中(图2)5对SSR特异性引物构建的系统发育树在系数为0.04处将无患子与毛瓣无患子种质分别分为两组，上面一组包含ind1、2、5、3、8、17、11、12、13、6、4、7、10、9种质，均为无患子，下面一组包含ind14、15、18、19、20、16种质，均为毛瓣无患子，利用5对SSR特异性引物可以完全鉴定无患子与毛瓣无患子。B组中(图3)5对SSR特异性引物构建系统发育树，但无法有效将无患子与毛瓣无患子种质鉴定开，无患子与毛瓣无患子种质混杂在一起，表明B组3对SSR引物无法有效鉴定无患子与毛瓣无患子种质。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京林业大学

福建源华林业生物科技有限公司

<120> 分子标记及其应用和鉴定无患子与毛瓣无患子种质的方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 1

gaagccggat ctaatgggca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 2

tcactccaac agccttgtcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 3

aggagattca agtggtggcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 4

gacgacgtac actgctccat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 5

ttcttccgat tgagcgccat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 6

cgaatccagt ggcagtagca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 7

ctagctgtgg gggcacatac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 8

gcatattagc accgaccgga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 9

cagtccgatc tcagcagcat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

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ttgccctagg gtgttcttgg 20

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

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acaactggca agagatcgca 20

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 12

cacacctcca tttggctcct 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 13

gtcacagctc aggtgttcct 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 14

tcgccactcc tttaggcttt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 15

ttgctttctc gttggcctca 20

<210> 16

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<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

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acagattgtg gttggacgca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

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gctacccaca gctcacaagt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

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actctgtgag gagggtcaga 20

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<213> 人工序列(DNA)

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agcaatcacc gggaacaaca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

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ccctgagccg agacaacatt 20