取代嘧啶化合物及其药物组合物和该化合物的用途

摘要

本发明涉及取代的嘧啶类化合物及其药物组合物和该化合物的用途。对突变EGFR和突变HER2具有优良的抑制活性，且具有通式(I)的取代的嘧啶类化合物及其药学上可接受的盐具有优良的药效学性能、代谢稳定性和/或更好的血脑屏障透过性。

说明书

技术领域

本发明属于化学医药领域，本发明涉及一类取代嘧啶化合物和该化合物的药物组合物，此外，本法明还涉及治疗与包括突变EGFR和突变HER2活性的激酶活性相关的疾病和病状的化合物、药物组合物和方法。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)是广泛存在于人表皮细胞和基质细胞的一种具有酪氨酸激酶活性的膜表面受体。正常细胞中，EGFR酪氨酸激酶(EGFR-TK)活性精准控制，但当基因位点突变时，会导致其活性持续增强，从而诱发肿瘤(Chong等Nature Med.2013；19(11):1389-1400)。

肺癌由非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)及神经内分泌肿瘤构成。据报道，在美国约10％的NSCLC患者(10,000例/年)以及在东亚约35％的NSCLC患者被报道具有肿瘤相关的EGFR突变。(Lynch等N Engl J Med.2004；350(21):2129-39)。绝大多数具有EGFR突变的NSCLC病例也具有另一致癌基因的突变(例如KRAS突变、ALK重排等)。EGFR突变主要发生在编码一部分EGFR激酶结构域的EGFR外显子18-21内。EGFR突变通常是杂合性的，伴有突变等位基因拷贝数的扩增。约90％的这些突变是外显子19缺失或外显子21L858R点突变。这些突变使EGFR的激酶活性增加，从而导致下游促存活信号传导路径过度活化。(Pao等Nat Rev Cancer 2010；10:760-774)。

EGFR激酶结构域中的小缺失、插入或点突变已被广泛报道。如Sharma等报道的(Nat Re.Cancer2007；7:169)氨基酸747的同框缺失的外显子19突变占突变的45％，导致L858R取代的外显子21突变占突变的40-45％，并且其余10％的突变涉及外显子18和20)。

EGFR基因的突变大多发生在18-21外显子，大多数突变是19外显子非移码缺失突变和21外显子的L858R点突变，发生这两类突变的患者，使用靶向药效果一般很好。排在EGFR突变第三位的就是EGFR 20外显子插入突变，占EGFR突变的NSCLC患者的6％，这类突变多发生在亚洲、女性、非吸烟、腺癌人群。EGFR外显子20插入据报道占所有EGFR突变肺肿瘤的约4-9.2％(Arcila等2013；12(2):220-9；Oxnard等J Thorac Onco 1.2013；8(2):179-84)。大多数EGFR外显子20插入发生在外显子20的编码氨基酸767至774的区域中，所述区域在EGFR的激酶结构域的C螺旋之后的环内(Yasuda等Lancet Onco1.2012；13(1):e23-31)。除A763_Y764insFQEA以外的EGFR外显子20插入突变体在临床前模型中在极大程度上与对临床上可实现剂量的可逆EGFR TKI厄洛替尼和吉非替尼和不可逆EGFR TKI来那替尼、阿法替尼和达可替尼(CancerRes.2007；67(24):11924-32；Oncogene 2008:27(34):4702-11；Cancer Biol Ther.2007；6(5):661-7))；Yasuda等2012；Yasuda等Sci Transl Med.2013；5(216):216ra177；代表性TKI不敏感性突变体(D770-N771 insNPG)的晶体结构揭示它具有未改变的ATP结合袋，并且不同于EGFR敏化突变，它使EGFR活化而不增加它对ATP的亲和力。具有涉及氨基酸A767、S768、D770、P772和H773的EGFR外显子20插入突变的肿瘤的患者不对吉非替尼或厄洛替尼响应(Clin Cancer Res.2008；14(15):4877-82；Clin CancerRes.2011；17(11):3812-21)。在对患有具有典型EGFR外显子20插入的NSCLC的患者的回顾性和前瞻性分析中，大多数在用吉非替尼或埃罗替尼或阿法替尼治疗的过程中显示进行性疾病。

HER2突变据报道存在于约2-4％的NSCLC中(Int J Cancer 2006；119:2586-2591；Cancer Res 2005；65:1642-6；Nature 2004；431:525-6)。最常见突变是外显子20内的同框插入。在83％的患有HER2相关NSCLC的患者中，四氨基酸YVMA插入突变存在于HER2的外显子20中的密码子775处。(Clin CancerRes 2012；18:4910-4918)。就腺癌组织学来说，HER2突变似乎更常见于从不吸烟者中(Butti tta等2006；Shigematsu等2005；Stephens等2004)。然而，HER2突变也可见于其它NSCLC子组中(包括见于早先和当前吸烟者中)以及见于其它组织学中。外显子20插入导致HER2激酶活性增加以及通过下游路径达成的信号传导增强，从而导致存活、侵袭性和致肿瘤性增加(Cancer Cell 2006；10:25-38)。具有HER2 YVMA突变的肿瘤基本上对已知EGFR抑制剂具有抗性。

近年来，同时能选择性抑制突变EGFR和突变HER2的化合物成为研究的热点。但是如何进一步提高活性、减少毒副作用、改善代谢稳定性和/或者有效增加血脑屏障透过性仍是目前存在的问题。

发明内容

本发明人在研究EGFR和HER2抑制剂的过程中发现了一类新的取代的嘧啶类化合物，对突变EGFR和突变HER2具有优良的抑制活性、改善的代谢稳定性和/或更好的血脑屏障透过性。进一步地，本发明提供一种具有通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，药物组合物以及用途。

本发明提供了一种具有通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，

其中：

R

其中R

其中R

R

R

Z选自N或C。

在本发明的一些实施方案中，R

R

进一步优选地，R

在本发明的一些实施方案中，R

在本发明的一些实施方案中，R

在本发明的一些实施方案中，所述通式(I)化合物选自下列化合物：

在本发明的一些实施方案中，本发明所述的药学上可接受的盐为无机盐或有机盐，无机盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、酸式磷酸盐；所述有机盐选自甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、羟乙酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、戊二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、水杨酸盐、对甲苯磺酸盐、抗坏血酸盐；进一步优选地，所述的药学上可接受的盐选自盐酸盐、琥珀酸盐或甲磺酸盐。

本发明还提供了一种药物组合物，包括本发明前述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂。

本发明还提供了本发明前述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗哺乳动物尤其是人类由EGFR突变和HER2突变的激酶活性相关的疾病和病状特别是癌症的药物中的用途。

进一步地，其中所述癌症包括肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈部癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌和/或胃癌。

本发明还提供了本发明前述的化合物或其药学上可接受的盐与一种抗肿瘤剂的组合在制备由EGFR和HER2突变体介导的疾病的药物中的用途，所述抗肿瘤剂选自以下：

(i)作用于DNA结构的抗肿瘤药物；

(ii)影响核酸合成的抗肿瘤药物；

(iii)影响核酸转录的抗肿瘤药物；

(iv)微管蛋白合成的抗肿瘤药物；

(v)细胞信号通路抑制剂如表皮生长因子受体抑制剂；

(vi)抗肿瘤单抗。

本发明提供了一种新的用于抑制携带外显子20插入突变或携带DT或LT突变的突变EGFR，以及用于抑制突变HER2的方法，以及治疗由那些突变EGFR或HER2蛋白中的任一个介导的疾病的方法的抑制剂，本发明所述抑制剂可以有效改善突变EGFR和突变HER2活性相关的疾病和病症，此外，本发明的抑制剂具有更好的药效学性能、代谢稳定性更高，可以有效减少皮疹和腹泻等副作用，在本发明的一些具体实施方式中，部分化合物显示了更好的血脑屏障通透性。

具体实施方式

本发明人在研究EGFR和HER2抑制剂的过程中发现了一类新的取代的嘧啶类化合物，对突变EGFR和突变HER2具有优良的抑制活性，毒副作用更低，为治疗EGFR外显子20插入突变患者提供一种治疗方案，半衰期更长，安全性更好。预期此类抑制剂将会有好的疗效，有望克服耐药性问题及毒副作用问题，具有良好的开发前景。

在本发明中C

卤代C

C

卤代C

C

C

卤素包括氟、氯、溴和碘。

在本发明中“药学上可接受的盐”是指表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。术语“盐”是指由无机或有机酸或碱和内部形成的盐制备的根据本发明的化合物的任何盐。通常，这种盐具有生理上可接受的阴离子或阳离子。

如本文使用的术语“疾病”是指损害或干扰细胞、器官或组织的正常功能的任何病症或紊乱。

如本文所使用的术语“抑制剂”是指化合物或试剂具有抑制靶向蛋白或多肽的生物学功能的能力，例如通过抑制蛋白质或多肽的活性或表达。

如本文使用的术语“抗肿瘤剂”是指在肿瘤病症治疗中有用的任何试剂。

如本文使用的术语“药学可接受的”是指在合理的医学范围内，适用于与人和其他哺乳动物的组织接触而没有过度毒性、剌激、过敏反应等，并且有合理的利益/风险比的组分。“药学上可接受的盐”是指任何无毒性的盐，其在施用于受者后，能够直接或间接地提供本发明的化合物或化合物的前药。

如本文所使用的术语“有效量”或“有效治疗量”是指本文所述的化合物或药物组合物的量是足以达到预期的应用，包括，但不限于治疗疾病。在一些实施方案中，所述量是检测到的有效用于杀伤或抑制癌细胞生长或扩散；肿瘤的大小或数量；或癌症的严重性水平，阶段和进展。有效治疗量可以根据预定应用发生变化，例如体外或者体内，疾病的状况和严重程度，受试者年龄，重量，或给药方式等。该术语也适用于剂量将诱导靶细胞，例如，减少细胞迁移的一个特定的响应。具体剂量将取决于，例如，特定的化合物中选取，受试者物种和他们的年龄/现有的健康状况或健康状况的风险，给药途径，疾病的严重程度，与其他药剂组合给药，给药时间，给其施用的组织，和给药装置等。

在本发明中“给药”或“给予”个体化合物是指向需要治疗的个体提供本发明的化合物。

本发明的化合物可以含有一个或多个不对称中心，并且因此作为外消旋物和外消旋混合物、单一对映体、单独的非对映体和非对映体混合物出现。这些化合物的所有此类异构体形式均明确地包括在本发明中。本发明的化合物还可以表现为多种互变异构形式，在此情况下，本发明明确地包括本文所述的化合物的所有互变异构形式。此类化合物的所有此类异构体形式包括在本发明中。本文所述的化合物的所有结晶形式明确地包括在本发明中。

在本发明中“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，乙基“任选”被卤素取代，指乙基可以是未被取代的(CH

在整个本说明书中提到的“实施方式”或“实施方案”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”或“在本申请的部分实施方式中”意指在至少一实施方案中包括与该实施方案所述的相关的具体参考要素、结构或特征。因此，在整个说明书中不同位置出现的短语“在一实施方案中”或“在实施方案中”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”或“在本申请的部分实施方式中”不必全部指同一实施方案。此外，具体要素、结构或特征可以任何适当的方式在一个或多个实施方案中结合。

除非本申请中另外要求，在整个说明书和其后的权利要求书中，词语“包括(comprise)”及其英文变体例如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应解释为开放式的、含括式的意义，即“包括但不限于”。

应当理解，在本申请说明书和附加的权利要求书中用到的单数形式的冠词“一”(对应于英文“a”、“an”和“the”)包括复数的对象，除非文中另外明确地规定。

<化合物或其药学上可接受的盐>

本发明提供一种取代嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，其药物组合物以及用途。该化合物可以作为EGFR和HER2抑制剂，并且药效学性能更好、代谢稳定性更高。

本发明提供一种以下通式(I)化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

R

其中R

其中R

R

R

Z选自N或C。

在本发明的某些实施方式中，R

在本发明的一些具体实施方式中，R

在本发明的一些具体实施方式中，为了提高药效活性和代谢稳定性，R

在本发明的一些具体实施方式中，X或Y各自独立地选自N或O，R

在本发明的一些具体实施方式中，R

其中R

在本发明的一些具体实施方式中，R

在本发明的一些具体实施方式中，本发明的化合物选自：

在本发明的一些具体实施方式中，本发明人发现化合物在R

通式(I)的化合物包括其药学上可接受的盐。所述的药学上可接受的盐为无机盐或有机盐，无机盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、酸式磷酸盐；所述有机盐选自甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、羟乙酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、戊二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、水杨酸盐、对甲苯磺酸盐、抗坏血酸盐。更进一步地，所述药学上可接受的盐选自盐酸盐、琥珀酸盐或甲磺酸盐。

进一步地，通式(I)的化合物或它们的盐可以溶剂合物的形式分离，且因此任何这种溶剂合物都属于本发明的范围。

本发明还提供一种药物组合物，包括本发明所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂。

在制备药物组合物时，通常是将本发明通式(I)化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂混合。其中，在单位剂型(例如一个药片或胶囊)中，通式(I)化合物或其药学上可接受的盐的含量可以为0.01-1000mg，例如0.05-800mg、0.1-500mg、0.01-300mg、0.01-200mg、0.05-150mg、0.05-50mg等。

可以按常规制备方法将所述本发明组合物配置为常规药物制剂。例如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、乳液剂、混悬剂、分散液、溶液剂、酊剂、糖浆剂、软膏剂、滴剂、栓剂、吸入剂、喷射剂等。

在某些实施方式中，本发明化合物或其药学上可接受的盐可以配制为用于口服给药的固体制剂，包括，但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂等。在这些固体剂型中，本发明式(I)化合物作为活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，例如与柠檬酸钠或磷酸二钙，或与选自下述成分中的一种或多种混合：

(1)填料或增溶剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸等；

(2)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、阿拉伯胶等；

(3)保湿剂，例如，甘油等；

(4)崩解剂、例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些符合硅酸盐和碳酸钠等；

(5)缓溶剂，例如石蜡等；

(6)吸收加速剂，例如季铵化合物等；

(7)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯等；

(8)吸附剂，例如，高岭土等；

(9)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠等，或其混合物。胶囊剂、片剂、丸剂中也可包含缓冲剂。

在某些实施方式中，所述固体剂型例如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材料如肠溶衣和其他本领域公知的材料晶型包衣或微囊化。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性成分也可与上述赋形剂中的一种或者多种形成微胶囊形式。

在某些实施方式中，本发明化合物或其药学上可接受的盐可以配制为用于口服给药的液体剂型，包括，但不限于药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆、酊剂等。除了作为活性成分的式(I)化合物或其药学上可接受的盐外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，例如水和其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油类，特别是棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油等或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，本发明液体剂型也可包括常规助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料等。所述悬浮剂包括，例如，乙氧基化十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇、和脱水山梨醇、微晶纤维素、琼脂等或这些物质的混合物。

在某些实施方式中，本发明化合物和其药学上可接受的盐可以配置为用于胃肠外注射的剂型，包括，但不限于生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重新溶解成无菌的可注射溶液和分散液的无菌粉末。适宜的载体、稀释剂、溶剂、赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

在某些实施方式中，本发明化合物或其药学上可接受的盐可以配置为用于局部给药的剂型，包括如软膏剂、散剂、栓剂、滴剂、喷射剂和吸入剂等。作为活性成分的本发明通式(I)化合物或其药学上可接受的盐在无菌条件下和生理上可接受的载体及任选的防腐剂、缓冲剂，和必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药，特别是与其他抗肿瘤药物组合。所述治疗剂包括但不限于：作用于DNA化学结构的抗肿瘤药物，如顺铂，影响核苷酸合成的抗肿瘤药物如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等，影响核酸转录的抗肿瘤药物如阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素等，作用于微观蛋白合成的抗肿瘤药物如紫杉醇、长春瑞滨等，芳香化酶抑制剂如氨鲁米特、来曲唑、瑞宁德等，细胞信号通路抑制剂如表皮生长因子受体抑制剂伊马替尼(Imatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)等。待组合的各成分可同时或顺序的给予，以单一制剂形式或者以不同制剂的形式给予。所述组合不仅包括本发明化合物的一种或其他活性剂的组合，而且也包括本发明化合物的两种或更多的其他活性剂的组合。

<化合物的制备方法>

本发明另一方面还提供制备通式(I)化合物的方法，所述方法通过以下反应方案之一来实施：

反应方案一：

反应式1

如反应式1所示，以2,4-二氯嘧啶-5-甲酸异丙酯为原料，与化合物A在催化剂的作用下经傅克反应得到中间体a；中间体a与化合物B发生取代反应得到化合物C；其中，R

上述反应中，所述中间体a的制备是在路易斯酸的作用下进行，所述的路易斯酸可以选自，但不限于，三氯化铁、三氯化铝、氯化锌、三氟化硼；

或者反应方案二：

反应式2

如反应式2所示，以2,4-二氯嘧啶-5-甲酸异丙酯为原料，与吲哚在催化剂的作用下经傅克反应得到中间体b；中间体b与化合物B发生取代反应得到中间体c；最后中间体c经取代反应得到化合物C，其中，R

或者反应方案三：

反应式3

如反应式3所示，中间体c与中间体d经亲核取代得到化合物D；

其中，X、Y、R

或者反应方案四：

反应式4

如反应式4所示，化合物C与R

上述反应的具体反应条件可以参照下面实施例中的条件。

本发明进一步提供了本发明所述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗哺乳动物尤其是人类由EGFR和HER2突变体介导的疾病特别是癌症的药物中的用途。

本发明进一步所述癌症选自肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈部癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌和胃癌。

此外，本发明提供本发明所述化合物或其药学上可接受的盐与一种抗肿瘤剂的组合在制备由EGFR和HER2突变体介导的疾病的药物中的用途，所述抗肿瘤剂选自以下：

(i)作用于DNA结构的抗肿瘤药物；

(ii)影响核酸合成的抗肿瘤药物；

(iii)影响核酸转录的抗肿瘤药物；

(iv)微管蛋白合成的抗肿瘤药物；

(v)细胞信号通路抑制剂如表皮生长因子受体抑制剂；

(vi)抗肿瘤单抗。

本发明的化合物或其药学上可接受的盐可给药于哺乳动物包括人，可以口服、直肠、胃肠外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药(粉剂、软膏剂、滴剂)或瘤内给药。

本发明化合物的给药剂量可以大约为0.01-50mg/kg体重/天，例如0.1-45mg/kg体重/天，0.5-35mg/kg体重/天。

实施例

下列实施例用于说明而非限定通式(I)化合物的合成方法。温度均为摄氏度。如果没有另外说明，所有的蒸发均在减压下进行。如果没有另外说明，否则试剂是自商业供货商购得且未经进一步纯化即使用。终产物、中间体和原料的结构通过标准分析方法确认，例如元素分析、光谱特征分析，例如MS、NMR。使用的缩写是本领域常规缩写，部分中间体购置盐城正驰生物科技有限公司。

具体实施例中涉及如下中间体物质，可参见下述路线过程合成得到：

中间体1a:N-(5-氨基-2-(((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺

合成方法如下：

步骤a：(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)氨基甲酸叔丁酯的制备

将4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(3g,16.12mmol)溶于二碳酸二叔丁酯(10mL)中，加热至80℃，保温16h，将反应液冷却至室温，固体析出，过滤，滤饼用正己烷洗涤，烘干得4.3g黄色粉末状固体。

步骤b：(4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)氨基甲酸叔丁酯的制备

将(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.5g,5.24mmol)溶于DMA(15mL)中，依次加入N,N,N’-三甲基乙二胺(0.8g,7.86mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.01g,7.86mmol)，升温至110℃，反应过夜。加入饱和碳酸钠水溶液调pH至8～9，乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，干燥，浓缩得1.8g淡红色油状液体。

步骤c：(5-氨基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基甲酸叔丁酯的制备

将(4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)氨基甲酸叔丁酯(6g,16.3mmol)溶于乙酸乙酯(40mL)中，加入600mg的Pd/C(5％)，一个大气压氢气氛围，室温反应过夜。反应液经过滤，滤液浓缩，得到粗品5g黑色油状物，直接投下一步。

步骤d：(5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基甲酸叔丁酯的制备

将(5-氨基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基甲酸叔丁酯(500mg,1.48mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入N,N-二异丙基乙胺(228mg,1.77mmol)，-5℃下缓慢滴加丙烯酰氯(147mg,1.625mmol)，滴毕，自然升至室温。3小时后，反应液经水洗，浓缩得到500mg粗品。直接投下一步。

步骤e：N-(5-氨基-2-(((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(中间体1a)的制备将(5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基甲酸叔丁酯(500mg,1.27mmol)溶于HCl-MeOH(1M,10mL)溶液中，室温反应过夜，反应液经浓缩，加入饱和碳酸氢钠水溶液调pH 8～9，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品，经柱纯化得350mg红色液体。

ESI-MS m/z:293.2[M+H]

中间体2a:N-(5-氨基-2-((2-(二甲基氨基)乙基)N-(5-氨基-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(氘代甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺的制备

合成方法参见中间体1a的制备，区别在于，把N,N,N’-三甲基乙二胺替换成N

ESI-MS m/z:296.2[M+H]

中间体3a:N-(5-氨基-4-甲氧基-2-(甲基(2-(甲基(氘代甲基)氨基)乙基)氨基)苯基)丙烯酰胺

合成方法参见中间体1a的制备，区别在于，把N,N,N’-三甲基乙二胺替换成N

ESI-MS m/z:296.2[M+H]

中间体4a:N-(5-氨基-2-((2-(双氘代甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺

合成方法参见中间体1a的制备，区别在于，把N,N,N’-三甲基乙二胺替换成N

ESI-MS m/z:299.2[M+H]

中间体5a:5-丙烯酰胺-6-吗啉-2-三氟乙氧基-吡啶-3-胺

合成方法如下：

步骤f：6-氯-2-三氟乙氧基-3-硝基吡啶的制备

氮气保护下，将2,6-二氯-3-硝基吡啶(2g,10.4mmol,1.0eq)溶于甲苯(20mL)中，冷却至0℃，分批加入钠氢(0.5g,12.4mmol,1.2eq)，0℃搅拌0.5小时，然后加入三氟乙醇(1.14g,11.4mmol,1.1eq)，室温搅拌12小时。反应液加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，干燥。浓缩得到2.1g，不经纯化直接下一步反应。

步骤g：6-氯-2-三氟乙氧基-吡啶-3-胺的制备

将6-氯-2-(2,2,2-三氟乙氧基)-3-硝基吡啶(2.2g,8.57mmol,1.0eq)溶于15mL乙醇和5mL水中，依次加入氯化铵(2.7g,42.9mmol,5.0eq)和还原铁粉(2.4g,42.9mmol,5.0eq)，80℃搅拌1.5小时。将反应液通过硅藻土趁热过滤，浓缩除乙醇，残留液乙酸乙酯萃取，有机相经干燥，浓缩，柱层析得到棕褐色固体1.2g。

步骤h：N-(6-氯-2-三氟乙氧基吡啶-3-基)乙酰胺的制备

将6-氯-2-三氟乙氧基吡啶-3-胺(2.3g,10.1mmol,1.0eq)溶于二氯甲烷(15mL)中，加入二异丙基乙基胺(1.9g,15.1mmol,1.5eq)，0℃下慢慢加入乙酰氯(0.95g,12.1mmol,1.2eq)，继续反应1小时。反应液依次用水，1N盐酸及饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品，经硅胶柱层析得到1.5g棕褐色固体。

步骤i：N-(6-氯-2-三氟乙氧基-5-硝基吡啶-3-基)乙酰胺的制备

将N-(6-氯-2-三氟乙氧基吡啶-3-基)乙酰胺(1.2g,4.47mmol,1.0eq)溶于三氟乙酸酐(10mL)中，冷却至-l0℃，慢慢滴加发烟硝酸(0.31g,4.92mmol,1.1eq)，继续反应1.5小时。将反应物缓慢加入碎冰中，析出固体，过滤。得到的粗产品于60℃烘干，乙酸乙酯打浆，得到885mg黄色固体。步骤j：N-(6-吗啉-2-三氟乙氧基-5-硝基吡啶-3-基)乙酰胺的制备

将N-(6-氯-2-三氟乙氧基-5-硝基吡啶-3-基)乙酰胺(400mg,1.27mmol,1.0eq)溶于乙腈(5mL)中，加入吗啉(133mg,1.53mmol,1.2eq)，80℃反应3小时。反应液减压浓缩至约1/3的体积，再加入0.5mL乙酸乙酯，析出固体，过滤，得到353mg黄色固体。

步骤k：N-(6-吗啉-2-三氟乙氧基-5-氨基吡啶-3-基)乙酰胺的制备

将N-(6-吗啉-2-三氟乙氧基-5-硝基吡啶-3-基)乙酰胺(1g)溶于15mL甲醇中，加入100mg鈀碳(10％)，氢气氛围，反应3小时。过滤除去鈀碳，滤液浓缩得到800mg红棕色油状物。

步骤l：5-丙烯酰胺-6-吗啉-2-三氟乙氧基-吡啶-3-基-乙酰胺的制备

将N-(6-吗啉-2-三氟乙氧基-5-氨基吡啶-3-基)乙酰胺(334mg,1.0mmol,1.0eq)溶于10mL二氯甲烷中，加入三乙胺(151mg,1.5mmol,1.5eq)，反应液降温至0℃并慢慢加入丙烯酰氯(108mg,1.2mmol,1.2eq)，0℃反应2小时。反应液经水洗，有机相干燥后浓缩得产物。

步骤m：5-丙烯酰胺-6-吗啉-2-三氟乙氧基-吡啶-3-胺的制备

将5-丙烯酰胺-6-吗啉-2-三氟乙氧基-吡啶-3-基-乙酰胺(150mg,0.386mmol)，溶于甲醇(3mL)中，加入0.15mL浓盐酸，60℃反应2.5h。浓缩除甲醇，残留液溶于乙酸乙酯，饱和碳酸氢钠调中性，有机相经氯化钠洗涤，干燥，浓缩，柱层析得到118mg砖红色固体。

ESI-MS m/z:347.1[M+H]

中间体6a:5-丙烯酰胺-6-吗啉-2-甲氧基-吡啶-3-胺

合成方法参见中间体5a的制备，区别在于，把三氟乙醇替换成甲醇。

ESI-MS m/z:279.1[M+H]

中间体7a:5-丙烯酰胺-6-[(2-二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)]-2-三氟乙氧基-吡啶-3-胺

合成方法参见中间体5a的制备，区别在于，把吗啉替换成N,N,N’-三甲基乙二胺。

ESI-MS m/z:362.1[M+H]

中间体8a:5-丙烯酰胺-6-[(2-二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)]-2-甲氧基-吡啶-3-胺

合成方法参见中间体5a的制备，区别在于，把吗啉替换成N,N,N’-三甲基乙二胺，三氟乙醇替换成甲醇。

ESI-MS m/z:294.2[M+H]

中间体1b:2-氯-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-甲酸甲酯

合成方法如下：

步骤n：2,4-二氯嘧啶-5-甲酰氯的制备

将3.5g脲嘧啶-5-甲酸分散于三氯氧磷(15mL)中，0℃下分批加入12g五氯化磷，氮气保护，100℃反应18小时，旋蒸除三氯氧磷，浓缩液经减压蒸馏得3.4g液体，产率：72.3％。

步骤o：2,4-二氯嘧啶-5-甲酸异丙酯的制备

将2,4-二氯嘧啶-5-甲酰氯(3.4g,16.1mmol)溶于干燥四氢呋喃(20mL)中，降温至-78℃，慢慢加入异丙醇(1.2g,19.3mmol)，升至室温过夜。浓缩反应液，经柱纯化得2.4g液体，产率63.5％。

步骤p：2-氯-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-甲酸异丙酯(中间体E)的制备

将2,4-二氯嘧啶-5-甲酸异丙酯(200mg,0.851mmol)溶于乙二醇二甲醚(3mL)中，0℃下分批加入无水三氯化铝(136mg,1.021mmol)，室温搅拌1小时。然后慢慢加入1-甲基-吲哚(122mg,0.936mmol)的乙二醇二甲醚(0.5mL)溶液，室温搅拌18小时，反应液经加水淬灭，二氯甲烷萃取，有机相干燥后浓缩，粗品经柱纯化得100mg黄色固体，产率：35.7％

ESI-MS m/z:330.1,332.1[M+H]

合成方法参见中间体1b的制备，区别在于，把1-甲基-吲哚替换成1-氘代甲基-吲哚。

ESI-MS m/z:333.1,335.1[M+H]

中间体3b:2-氯-4-(1–环丙基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-甲酸甲酯的制备

合成方法参见中间体1b的制备，区别在于，把1-甲基-吲哚替换成1-环丙基-吲哚。

ESI-MS m/z:356.1,358.1[M+H]

中间体4b:2-氯-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-甲酸甲酯的制备

合成方法参见中间体1b的制备，区别在于，把1-甲基-吲哚替换成吲哚。

ESI-MS m/z:316.1,318.1[M+H]

实施例1：异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1-氘代甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯

将中间体2b(24mg,0.073mmol)溶于乙腈(2mL)中，依次加入中间体1a(25mg,0.087mmol)和对甲苯磺酸一水合物(4mg,0.022mmol)，氮气保护，加热至80℃反应18小时。反应液经浓缩后，柱纯化得15mg灰色固体，产率35.3％。

ESI-MS m/z:589.4[M+H]

实施例1A：异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1-氘代甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯琥珀酸盐

将异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1-氘代甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯(400mg,0.68mmol)的四氢呋喃(4mL)中慢慢滴加琥珀酸(84.2mg,0.71mmol)的四氢呋喃(1mL)溶液。保温搅拌12小时。固体析出，趁热过滤，真空干燥得淡黄色固体320mg，产率66.7％。

ESI-MS m/z:589.4[M+H]

实施例1B：异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1-氘代甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯甲磺酸盐

于70℃下，异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1-氘代甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯(500mg,0.85mmol)的乙醇(10mL)和EtOAc(8mL)的混合溶剂中慢慢滴加甲磺酸(98mg,1.02mmol)的EtOAc(4mL)溶液。保温搅拌1.5小时。趁热过滤，于80℃下真空干燥得淡黄色固体430mg，产率74.0％。

ESI-MS m/z:589.4[M+H]

实施例2：异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(氘代甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体2a，中间体2b替换成中间体1b。

ESI-MS m/z:589.4[M+H]

实施例3：异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(N

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体3a，中间体2b替换成中间体1b。ESI-MS m/z:589.4[M+H]

实施例4：异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(N

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体4a，中间体2b替换成中间体1b。

ESI-MS m/z:592.4[M+H]

实施例5：N-{2-(2-吗啉-6-甲氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体6a，中间体2b替换成中间体1b。

ESI-MS m/z:572.2[M+H]

实施例6

N-{2-(2-吗啉-6-甲氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-氘代甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体6a。

ESI-MS m/z:575.3[M+H]

实施例7：N-{2-(2-吗啉-6-甲氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-环丙基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体6a，中间体3b替换成中间体1b。

ESI-MS m/z:598.3[M+H]

实施例8：N-{2-[2-吗啉-6-(2,2,2-三氟乙氧基)]-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体5a，中间体2b替换成中间体1b。

ESI-MS m/z:640.2[M+H]

实施例9：N-{2-[2-吗啉-6-(2,2,2-三氟乙氧基)]-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-氘代甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体5a。

ESI-MS m/z:643.2[M+H]

实施例10：N-{2-[2-吗啉-6-(2,2,2-三氟乙氧基)]-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-环丙基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体5a，中间体2b替换成中间体3b。

ESI-MS m/z:666.3[M+H]

实施例11：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体7a，中间体2b替换成中间体1b。

ESI-MS m/z:655.3[M+H]

实施例12：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-氘代甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体7a。

ESI-MS m/z:658.3[M+H]

实施例13：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-环丙基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体7a，中间体2b替换成中间体3b。

ESI-MS m/z:681.3[M+H]

实施例14：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-甲氧基-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体8a，中间体2b替换成中间体1b。

ESI-MS m/z:587.3[M+H]

实施例15：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-甲氧基-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-氘代甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体8a。

ESI-MS m/z:590.3[M+H]

实施例16：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-甲氧基-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-环丙基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，把中间体1a替换成中间体8a，中间体2b替换成中间体3b。

ESI-MS m/z:613.3[M+H]

实施例17：异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1-羟甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯

异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯的制备

合成方法参见实施例1的合成，区别在于，中间体2b替换成中间体4b。ESI-MS m/z:572.3[M+H]

将异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯(100mg,0.175mmol)混悬于水(1mL)，二氯甲烷(1mL)，甲醇(1mL)中，加入甲醛水溶液(37％,0.4mL)和四丁基氟化铵(1M,0.08mL)。室温过夜，反应液用二氯甲烷萃取，有机相经饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，柱纯化得固体80mg，产率76％。

ESI-MS m/z:602.3[M+H]

实施例18：N-(2-{2-二甲氨基乙基-甲氨基}-4-甲氧基-5-{[4-(5-异丙基羧酸酯-1-甲基磷酸二叔丁酯-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)丙烯酰胺

将异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯(100mg,0.175mmol)溶于2mL DMF中，冰浴下加入NaH(8.4mg,0.210mmol)，加完后0℃下反应0.5h，然后将二叔丁基氯甲基磷酸酯(58.5mg,0.210mmol)溶于DMF(0.5mL)中，并加至反应液中，室温反应2h，反应液倒至水中，DCM萃取，有机相经饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，柱纯化得固体30mg，产率:21.6％。

ESI-MS m/z:794.4[M+H]

实施例19：N-(2-{2-二甲氨基乙基-甲氨基}-4-甲氧基-5-{[4-(5-异丙基羧酸酯-1-甲基磷酸二乙酯-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)丙烯酰胺

合成方法参见实施例18的合成，区别在于，把二叔丁基氯甲基磷酸酯替换成二乙基氯甲基磷酸酯，产率:18.6％。

ESI-MS m/z:738.3[M+H]

实施例20：N-(2-{2-二甲氨基乙基-甲氨基}-4-甲氧基-5-{[4-(5-异丙基羧酸酯-1-甲基磷酸-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)丙烯酰胺

将N-(2-{2-二甲氨基乙基-甲氨基}-4-甲氧基-5-{[4-(5-异丙基羧酸酯-1-甲基磷酸二叔丁酯-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)丙-2-烯酰胺(100mg)溶于1mL稀盐酸(1M)和1mL四氢呋喃中，室温搅拌1小时，调pH为6-7，二氯甲烷萃取，干燥后旋干得固体30mg,产率35％。

ESI-MS m/z:682.3[M+H]

实施例21：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-羟甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例17，区别在于，把中间体1a替换成中间体7a，产率45.6％。

ESI-MS m/z:671.3[M+H]

实施例22：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-甲基磷酸二叔丁酯-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例18，区别在于，把中间体1a替换成中间体7a，产率15.6％。

ESI-MS m/z:863.4[M+H]

实施例23：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-甲基磷酸二乙酯-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例18，区别在于，把二叔丁基氯甲基磷酸酯替换成二乙基氯甲基磷酸酯，中间体1a替换成中间体7a。产率17.3％。

ESI-MS m/z:807.3[M+H]

实施例24：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-甲基磷酸-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例20，区别在于，把中间体1a替换成中间体7a，产率25.4％。

ESI-MS m/z:751.3[M+H]

实施例25：异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1-甲氧基甲基-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯

将异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-4-(1-羟甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯(即实施例17化合物)(100mg,0.166mmol)溶于2mL干燥DMF中，冰浴下加入NaH(8mg,0.2mmol)，加完后0℃下反应0.5h，然后将碘甲烷(28mg,0.2mmol)溶于DMF中，并加至反应液中，室温反应2h，反应液倒至水中，DCM萃取，有机相经饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，柱纯化得固体25mg，产率:24.5％。

ESI-MS m/z:616.3[M+H]

实施例26：异丙基-2-((5-丙烯酰胺基-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-异丙基苯基)氨基)-4-(1-甲氧基甲基-吲哚-3-基)嘧啶-5-羧酸酯

合成方法参见实施例25，区别在于，把碘甲烷替换成溴代异丙烷，产率:21.8％。

ESI-MS m/z:616.3[M+H]

实施例27：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-甲氧基甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例25，区别在于，把实施例17化合物替换成实施例21化合物，产率：18.8％。

:ESI-MS m/z:685.3[M+H]

实施例28：N-{2-{[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基}-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-{5-甲酸异丙酯-[4-(1-异丙氧基甲基-lH-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}-吡啶-3-基}丙烯酰胺

合成方法参见实施例25，区别在于，把实施例17化合物替换成实施例21化合物，把碘甲烷替换成溴代异丙烷，产率:20.3％。

ESI-MS m/z:713.3[M+H]

以上实施例2至28均可用实施例1A和1B中相似的方法制备相应琥珀酸盐和甲磺酸盐。

生物学实施例：

应用例1：ASV和NPG EGFR外显子20插入突变

可使用己用EGFR外显子20插入转导的鼠类祖B细胞系Ba/F3细胞评估化合物在选择性抑制EGFR外显子20插入突变方面的活性。通过反式慢病毒ORF组装系统(ThermoScientific)将编码人EGFR外显子20插入NPG(H773-V774insNPG)或ASV(V769-D770insASV)的表达载体pLVX-IRES puro(Clontech)转染至HEK293细胞中以产生编码EGFR外显子20插入的病毒。通过EGFR外显子20病毒来感染维持在补充有10％胎牛血清、200μM L-谷氨酰胺/200μg/mL青霉素/200μg/mL链霉素(Life Technology)和10ng/mL IL-3(R&D system)的RPMI1640培养基中的Ba/F3(DSMZ)细胞，并且随后通过嘌呤霉素(Life Technology)选择和IL-3消减来选择。表达EGFR外显子20插入的Ba/F3细胞(命名为Ba/F3-EGFR-外显子20-NPG或Ba/F3-EGFR-外显子20-ASV)可在不存在IL-3下增殖。测定化合物的抗增殖活性方法：用测试化合物(溶解于DMSO中)在一系列浓度(4倍稀释，最高浓度：10,000nM)下处理接种在96孔板中的BaF3-EGFR外显子20细胞(NPG或ASV)(2500个细胞/孔)。在37℃孵育器中在5％CO

应用例2：EGFR外显子19缺失和外显子20T790M并行突变

可使用已用EGFR外显子19缺失和T790M突变转导的鼠类祖B细胞系Ba/F3细胞评估化合物在选择性抑制EGFR外显子19缺失和T790M并行突变方面的活性。通过反式慢病毒ORF组装系统(Thermo Scientific)将编码人EGFR E746-A750缺失和T790M突变的表达载体pLVX-IRES puro(Clontech)转染至HEK293细胞中以产生编码EGFR外显子19缺失和T790M突变的病毒。通过EGFR E746-A750缺失和T790M突变病毒来感染维持在补充有10％胎牛血清、200μM L-谷氨酰胺/200μg/mL青霉素/200μg/mL链霉素(Life Technology)和10ng/mL IL-3(R&D system)的RPMI 1640培养基中的Ba/F3(DSMZ)细胞，并且随后通过嘌呤霉素(LifeTechnology)选择和IL-3消减来选择。表达EGFR E746-A750缺失和T790M突变的Ba/F3细胞(命名为Ba/F3-EGFR-Del/T790M)可在不存在IL-3下增殖。测定化合物的抗增殖活性方法：用测试化合物(溶解于DMSO中)在一系列浓度(4倍稀释，最高浓度:10,000nM)下处理接种在96孔板中的BaF3-EGFR-Del/T790M细胞(2500个细胞/孔)。在37℃孵育器中在5％CO

应用例3：EGFR外显子21L858R和外显子20T790M并行突变

可使用已用EGFR L858R和T790M双重突变转导的鼠类祖B细胞系Ba/F3细胞评估化合物在选择性抑制EGFR L858R和T790M并行突变方面的活性。通过反式-慢病毒ORF组装系统(Thermo Scientific)将编码人EGFR L858R和T790M双重突变的表达载体pLVX-IRESpuro(Clontech)转染至HEK293细胞中以产生编码EGFR L858R和T790M双重突变的病毒。通过EGFR L858R和T790M双重突变病毒来感染维持在补充有10％胎牛血清、200μM L-谷氨酰胺/200μg/mL青霉素/200μg/mL链霉素(Li fe Technology)和10ng/mL IL-3(R&D system)的RPMI 1640培养基中的Ba/F3(DSMZ)细胞，并且随后通过瞟岭霉素(Life Technology)选择和IL-3消减来选择。表达EGFR L858R和T790M双重突变的Ba/F3细胞(命名为Ba/F3-EGFRL858R/T790M)可在不存在IL-3下增殖。测定化合物的抗增殖活性方法：用测试化合物(溶解于DMSO中)在一系列浓度(4倍稀释，最高浓度:10,000nM)下处理接种在96孔板中的BaF3-EGFR L858R/T790M细胞(2500个细胞/孔)。在37℃孵育器中在5％CO

应用例4：HER2外显子20YVMA插入突变

可使用已用ER2外显予20YVMA插入转导的鼠类祖B细胞系Ba/F3细胞评估化合物在选择性抑制HER2外显子20YVMA插入突变方面的活性。通过反式-慢病毒ORF组装系统(Thermo Scientific)将编码人EGFR外显子20插入YVMA(A775-G776ins YVMA)的表达载体pLVX-IRES puro(Clontech)转染至HEK293细胞中以产生编码EGFR外显子20插入的病毒。通过EGFR外显子20病毒来感染维持在补充有10％胎牛血清、200μM L-谷氨酰胺/200μg/mL青霉素/200μg/mL链霉素(Life Technology)和10ng/mL IL-3(R&D system)的RPMI 1640培养基中的Ba/F3(DSMZ)细胞，并且随后通过嘌呤霉素(Life Technology)选择和IL-3消减来选择。表达Her2外显子20YVMA插入的Ba/F3细胞(命名为Ba/F3-Her2外显子20YVMA)可在不存在IL-3下增殖。测定化合物的抗增殖活性方法：用测试化合物(溶解于DMSO中)在一系列浓度(4倍稀释，最高浓度:10,000nM)下处理接种在96孔板中的BaF3-Her2外显子20YVMA细胞(2500个细胞/孔)。在37℃孵育器中在5％CO

表1显示了应用例1-4的结果。即表1显示了实施例化合物和参照化合物(可商购化合物TAK-788)的ASV和NPG插入突变外显子20EGFR IC

表1本发明的实施例以及参照化合物活性测定的数据(nM)

其中n＝实验重复的次数

结果显示，经羟甲基替换甲基、氘代甲基替换甲基的化合物提高了实施例的生物活性，由于对比例TAK-788，显示了更强的治疗潜能。虽然实施例18-20、实施例22-28并未在细胞活性测试中体现出优于TAK-788的效果，但实施例18-20、实施例22-28可经体内代谢得到实施例17或实施例21，达到类似的治疗潜能。

应用例5：使用人体肝脏微粒体进行化合物稳定性的评价

将实施例化合物的肝微粒体酶稳定性与参照化合物TAK-788进行比较。

测定系统：本发明化合物的代谢稳定性利用由男女混合的肝脏微粒体用1mMNADPH进行试验。样品使用质谱仪进行分析。将HRMS用于确定峰面积响应比率(对应于试验化合物或对照物的峰面积除以分析内标的峰面积)而不运行标准曲线。为了检测到所有的可能代谢物，在适当的m/z范围内进行HRMS扫描。

测定条件：该测定用一次孵育(N＝1)进行。将试验化合物在37℃下在含有0.5毫克/毫升肝脏微粒体蛋白的缓冲液中孵育。通过加入辅因子引发反应，并于0、2、4、8、16、24、36、48小时取样，平行孵育阳性对照物(5μM睾丸素)并于0、2、4、8、16、24、36、48小时取样。

测定质量控制：平行进行对照化合物睾丸素以证实(肝脏)微粒体的酶活性。最终时间点后，利用荧光测定法来确认NADPH添加到反应混合物中。对照物的T1/2满足可接受的内标。

分析方法：液相色谱柱：Thermo BDS Hypersil C18 30X2.0mm，3μm，具有保护柱M.P.，缓冲液：25mM甲酸接缓冲液，pH 3.5；水相(A)：90％水，10％缓冲液；有机相(B)：90％乙腈，10％缓冲液；流速：300微升/分钟；自动进样器：注射体积10微升。

梯度程序参见表2。

表2梯度程序

通过使用人体肝微粒体，如本发明中所述实施例的代谢半衰期测定结果如表3所示。

表3实施例化合物和参照化合物代谢半衰期

结果显示，在特定位置的甲基氘代、三氟乙氧基取代和或环丙基取代的化合物提高了实施例的代谢稳定性，相对较长的代谢半衰期使得它们具有降低医疗剂量和扩大给药时间间隔的潜能。

应用例6：血脑屏障渗透测定

依据文献(Journal of Medicinal Chemistry,2013,56(1):2-12)K

在具有半透膜的HT渗析板上进行体外血液和脑结合测定。用5μM测试化合物(一式三份)将稀释的血液(用DPBS 1:1，pH为7.4)和脑匀浆(与DPBS 1:3，pH为7.4)加标并且在37℃下，在缓慢旋转的平板中在150μL的等体积的100mM PBS缓冲液(pH7.4)中透析4小时。在孵育结束时，取50μL来自接受侧的等分部分以及5μL来自供体室的等分部分。将5μL样品进一步用45μL的空白血液或脑匀浆稀释。成对样品与缓冲液或空白血液/脑匀浆进行基质匹配并且混合2min，并且然后用150μL具有作为内标的100ng/mL甲苯磺丁脲的冷乙腈进行沉淀。在4000rpm处离心20min之后，将上清液用0.1％甲酸水溶液进行稀释并且针对LC/MS/MS进行分析。通过缓冲液侧反应与脑匀浆/血液侧反应的比例计算脑匀浆和稀释的血液中的测试化合物的未结合部分(fu)，并且用以下等式f

短期口服吸收(SOA)模型是用于鉴定一种化合物的脑渗透的体内筛选模型。用1％甲基纤维素中的2mg/kg的化合物向六只雄性wistar大鼠(扬州大学比较医学中心)口服给药。在给药0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时以及7小时之后，从大池收集脑脊液(CSF)，并且经由心脏穿刺将血液样品(＞60μL/时间点/每个部位)收集到单独的EDTA凝固试管中，并且然后立即用3倍体积的水进行稀释。收获脑组织并且在3倍体积的磷酸盐缓冲盐水(pH为7.4)中均质化。在LC/MS/MS分析之前，将所有样品存储在约-70℃下。

通过加标空白血液、脑匀浆以及0.2ng/mL至500ng/mL的人工CSF制备标准品。通过添加3倍体积的含有内标(40ng/mL地塞米松和40ng/mL双氯芬酸)的冷乙腈来沉淀均质化的脑组织连同血液样品，并且用100μL含有内标的冷乙腈来沉淀10μL的CSF样品。在涡旋2min并且在14,000rpm离心5min之后，通过LC/MS/MS分析上清液。在每批来自血液样品分析的开始和结束处运行两组标准曲线。针对脑样品和CSF样品，连同测试样品一起制作标准曲线。

在口服给药之后，通过啮齿类中的AUC脑/AUC血液测量被表示为脑/血液比(K

在下表中显示了针对本发明部分实施例测定的数据以及针对参照化合物TAK-788(游离碱形式)获得的数据：

表4本发明的实施例和参照化合物的脑屏障渗透性实验数据

当与TAK-788相比时，本发明化合物的具有更优的脑屏障渗透特性，对非小细胞肺癌脑转移的治疗具有更好的潜能。

尽管本发明通过之前的特定实施例说明，但不应将其解释为受此限制；而是本发明涵盖之前公开的一般方面。可在不背离本发明的精神和范围下进行多种修饰并具有多种实施方案。