一种假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域，所述抗真菌蛋白为由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或插入一个或几个氨基酸序列所获得的具有同等活性的蛋白质。本发明还提供了所述抗真菌蛋白的编码基因、表达载体、工程菌，本发明还提供了类假结核耶尔森菌抗真菌蛋白的分离纯化方法。所述蛋白在抗真菌药剂中的应用以及所述蛋白的编码基因在转化植物中的应用。本发明涉及的YPK_AFP1001抗真菌基因及蛋白具有更高，更广谱的抗真菌活性。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白及其编码基因和应用，具体地说，涉及来源于假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)的抗真菌蛋白YPK_AFP1001、其生产和应用方法以及编码抗真菌蛋白的DNA序列。

背景技术

病原真菌对农作物具有造成破坏性的损害，并对会对牲畜和人类产生不利的健康后果(Wang et al。2003；Yevtushenko et al。2005；Corrado et al。2008)；每年真菌感染直接造成五大粮食农作物水稻、小麦、玉米、土豆和大豆的产量损失达1.25亿吨。真菌感染粮食农作物的疾病主要包括：稻瘟病、小麦杆锈病、玉米黑穗病、土豆晚疫病和大豆锈病等作物疾病。现今，植物疾病的防治主要依靠化学农药，但是农药的使用受到了严格的监管和控制，并且会对环境造成不可逆的破坏。而抗真菌基因或抗真菌蛋白则被认为实践中用于作物水果及蔬菜生物防治的新手段，特别是转抗真菌基因的应用具有很好的应用前景。

生物体通过产生抗真菌蛋白(AFP)，抗真菌肽或化合物来防治真菌侵袭。抗真菌蛋白是先天性免疫反应中的进化保守组件，并且是主要的效应分子。抗真菌蛋白参与生物体的组成抗性或者诱导抗性机制，使生物体能够有效地抵抗致病真菌的侵害(Claude P.S.(2001)Antifungal Proteins[J].Applied And Environment Microbiology67(7):2883-2894)。

一般来说，肽由50个或更少的氨基酸残基组成，分子量较小，而蛋白质则含有更多的氨基酸残基，分子量则更大。抗真菌蛋白基因引入农作物后，可以显著增强其对致病真菌的抗性(Wong等，2010)。研究者已经从许多种动植物、真菌及细菌中分离出来抗真菌蛋白和抗真菌肽(植物：Wang et al。2001；Wel and Loeve 1972；Ye et al。，2001a，b，动物：Wangand Ng 2002b；Lee et al，1995，细菌：Bormann et al 1999和真菌Gun Lee等1999)。根据抗真菌蛋白的结构和/或功能，抗真菌蛋白可以分为：包括几丁质酶和几丁质酶样蛋白，几丁质结合蛋白，亲环蛋白样蛋白，防御素和防御素样蛋白，脱氧核糖核酸酶，胚胎丰富蛋白，葡聚糖酶，凝集素，脂质转移蛋白，过氧化物酶，蛋白酶抑制剂，核糖核酸酶，核糖体失活蛋白，储存2S白蛋白和类似丘脑蛋白等抗真菌蛋白(Ng etc，2013a，b Selitrennikoff2001)。编码这些抗真菌蛋白的基因许多已经被利用生物技术的方法，获得转化植株，这些获得转抗真菌蛋白基因的植物获得更好的抗真菌侵袭性。采用转基因方法来提高宿主对真菌的抗性，可以减少对有害农药的使用，并且比传统的育种方法具有更高的效率(Gust et al。，2010)。这一策略有助于广泛地发展抗病植物病虫害(Jha et al。2009；Meiyalaghan etal。2011)。

脱氧核糖核酸酶是近年来从植物中克隆鉴定到的一种新型抗真菌蛋白，这种抗真菌蛋白可能通过水解侵入的外源DNA而发挥作用。比如从芦笋种子中获得30kDa脱氧核糖核酸酶具有针对灰霉菌的抗真菌活性(Wang和Ng 2001)。其他研究者已经从西洋参，人参和三喜人参中分离出具有抗真菌活性的核糖核酸酶(Lam和Ng 2001d；Ng et al.2002；Wang andNg2001)。但是，目前还未见报道从细菌中获得具有脱氧核糖核酸酶活性的抗真菌蛋白及其基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白及其编码基因和应用。为农作物、蔬菜及水果的生物防治提供一种新的抗真菌蛋白基因。本发明所涉及的蛋白及其基因可用于农业、制药或防腐中对抗真菌疾病。

其具体技术方案为：

一种假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或插入一个或几个氨基酸序列所获得的具有同等活性的蛋白质。

一种假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白在治疗真菌药物制备过程中的应用。

本发明所述假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白在防腐剂制备过程中的应用。

本发明所述假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白在农作物、蔬菜及水果的生物防治过程中的应用。

本发明所述假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白的编码基因在治疗真菌药物制备过程中的应用。

本发明所述假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白的编码基因在防腐剂制备过程中的应用。

本发明所述假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白的编码基因在农作物、蔬菜及水果的生物防治过程中的应用。

一种本发明所述假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白的诱导与纯化方法，包括以下步骤：

1)活化：将已构建好的蛋白表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)(pET28a-ypk_AFP1001)，挑单菌落，接种于含有适量Km 5mL液体LB培养基中，于220rpm，37℃摇床中培养至平台期；

2)转接扩大培养：按1％的比例将菌转接于含有适量Km的500mL LB液体培养基的1L的三角瓶中，37℃，180rpm摇动培养；检测OD600，至0.6时，将摇床温度调至26℃，并按终浓度0.5mM加入诱导剂IPTG，开始诱导；过夜培养，约16-18小时后，诱导完毕；

3)收菌：用低温离心机在4℃下收集菌体，8000rpm，10分钟，重复此步骤，直至收集到所有菌液中的菌体，然后用Binding buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，30mMimidazole)洗涤菌体两次；

4)破碎菌体：加入适量Binding buffer，充分震荡，将菌体悬浮起来，经低温高压细胞破碎仪压榨破碎菌体后，置于超声波破碎仪中进行超声用Binding buffer充分悬浮菌体，在4℃条件下，用超声波细胞破碎仪破碎，功率为200W，工作4s,间歇5s，循环数为99，直至将菌液超清，10000rpm，4℃下离心30分钟，将上清转移到干净的三角瓶中；

5)上柱：将上一步中的上清分批全部加入到事先活化好的Ni-NTA亲和纯化柱中，直至全部液体通过柱子流下；

6)洗涤：用Washing buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，100mM imidazole)将柱子洗两遍；

7)洗脱：用Elution buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，250mM imidazole)洗脱，且每次洗脱液收集在1.5mL事先预冷的EP管中，放置于冰上。

8)透析：将煮好的透析袋用去离子水清洗干净，将收集到的蛋白洗脱液注入透析袋中，两端用夹子夹好，放入透析液(10mM Tris-Cl，100mM NaCl)中(透析液中加入DTT，以防止蛋白被氧化)，4℃下透析过夜；

9)分装：将蛋白溶液分装，-80℃保存；跑SDS-PAGE胶来检测蛋白的纯化情况及进行抑制真菌实验。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明首次报道来源于假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)的具有Dnase活性的，热稳定的抗真菌蛋白YPK_AFP1001，该蛋白具有依赖于Mg²⁺的高水解活性。进行抑菌实验，可对小麦根腐菌、番茄早疫菌、稻瘟菌及粗糙脉孢菌等真菌等植物病原真菌产生明显的抑制效果。本发明所涉及的YPK_AFP1001抗真菌基因及蛋白具有更高，更广谱的抗真菌活性。

附图说明

图1是YPK_AFP1001基因PCR扩增结果；

图2是YPK_AFP1001重组质粒小诱导结果；

图3是YPK_AFP1001重组蛋白纯化结果；

图4是YPK_AFP1001菌落PCR；

图5是YPK_AFP1001双酶切基因片段；

图6是ypk_AFP100:不同离子条件下DNA水解活性结果；

图7是ypk_AFP1001在25℃-70℃之间DNA水解活性检测结果；

图8A是粗糙麦孢菌抑菌效果；

图8B是小麦根腐病菌；

图8C是番茄早疫菌；

图8D是稻瘟菌；

图8E是小麦赤霉菌。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

YPK_AFP1001诱导表达载体的构建

获得新基因ypk_ypk_AFP1001,利用特异引物从野生型假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis YPIII)基因组DNA中扩增ypk_ypk_AFP1001引物序列如下

正向引物YPK_AFP1001-F:

5'-CGCGGATCCATGAAACCGTTAGATCAGAATATTA-3'

反向引物YPK_AFP1001-R:

5'-CCGCTCGAGTTAACATCCTCCGCCACCTTTTGAG-3'

(1)YPK_AFP1001基因的扩增

表1 YPK_AFP1001基因PCR扩增体系

PCR程序：

结束后将PCR产物进行电泳检测

(2)YPK_AFP1001基因PCR扩增产物双酶切：

表2 YPK_AFP1001PCR产物双酶切反应体系(150μL)

离心混匀后，放入37℃水浴中，酶切过夜(14-16hours)；加入15μL LoadingBuffer(10×)，100℃加热3min,终止酶活；取少量酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

(3)YPK_AFP1001PCR酶切片段的回收(参照天根质粒回收试剂盒说明书)

1)柱平衡：将CB2放入预先准备好的收集管中，用移液枪吸取500μL BL，加入到吸附柱CB2中，静置5min，12,000rpm，离心1min，弃去管中废液；

2)将YPK_AFP1001PCR酶切产物加等倍提交的PC溶液混匀后，全部转移至吸附柱CB2中，静置5min，12,000rpm离心1min，弃去管中废液；

3)加入600μl PW至吸附柱中，12,000rpm，离心1min，弃去管中废液；

4)重复步骤5；

5)12,000rpm，离心3min，以甩干柱子里残余的液体，将吸附柱于通风处，晾干至无乙醇气味；

6)把吸附柱放于1.5mL EP上，向回收柱内中间位置，悬空加入灭菌ddH2O 80μL(已于55℃预热)，12,000rpm，离心2min，为提高回收效率，可重复一次；

7)于-20℃贮存。

(4)表达质粒pET28a提取(参照天根质粒提取试剂盒方法略有改动)

1)在吸附柱CP3中，用移液器加500μL的BL，12000rpm,离心1min，弃去废液；

2)从含pET28a表达载体的大肠杆菌TG1平板上各挑取3个单克隆接种到5mL含Km的液体LB培养基中，37℃、220r摇床，过夜培养；

3)离心收集菌体：将过夜培养的含pET28a表达空载菌液TG1 3Ml,12000rpm,离心2min收集到1.5mL EP管中，加250μL溶液P1，彻底悬浮菌体；加250μL溶液P2，上下翻转4-6次(要轻柔)，使菌体充分裂解，注意避免裂解过度；加350μL溶液P3，立即上下翻转4-6次(要轻柔)，至出现白色絮状沉淀，冰浴5min，12000rpm,离心20min；转移上清至吸附柱中，12000rpm,离心1min，重复一次，弃去废液；加500μL PD，12000rpm，离心2min，弃去废液；加入600μL PW于吸附柱中，2000rpm，离心1min，重复一次；将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm，离心2min；将吸附柱于通风处，晾干至无乙醇气味；把吸附柱置于灭菌处理新的1.5mL EP管，向回收柱中间位置悬空加入灭菌ddH2O 100μL(已于55℃预热)，12,000rpm，离心2min，重复一次；-20℃贮存。

(5)表达质粒pET28a的双酶切

按如下体系加入各反应物。

表3 pET28a质粒双酶切反应体系(200μL)

离心混匀后，放入37℃培养箱中，过夜酶切；加入20μL Binding Buffer(10×)混匀，终止酶活，将产物进行琼脂糖电泳检测分析；对目标片段进行回收。

(6)重组表达载体的构建：

1)按如下反应体系加入各反应物

表4载体片段连接体系

置于16℃连接仪,连接过夜。

2)热激转化(全过程于冰上进行)取出TG1感受态细胞；于超净台中将连接产物完全加入感受态细胞，切勿吹打；冰浴半小时，42℃热激90秒，立即放至冰上，冰浴3-5分钟；加入800μl LB培养基,(37℃预热无抗)，100rpm，37℃摇床，复苏40-55分钟；4000rpm，离心3min，弃上清。重悬沉淀，涂板，37℃，过夜培养。

3)菌落PCR阳性克隆的筛选和鉴定

表5重组质粒转化TG1的菌落PCR初步筛选

按照上述PCR反应体系为加入各反应组分，含转化克隆的平板上挑取适量单克隆，加入PCR管中；进行PCR程序；

PCR程序：

结束后将PCR产物进行电泳检测；筛选出正确阳性克隆；挑取阳性克隆，于液体5MlLB培养基中，37℃，120rpm摇床，过夜培养。进行小量双酶切验证；并对酶切验证的阳性克隆宋上海生工生物公司进行测序，筛选出测序结果突变的阳性克隆质粒，保存备用。

(7)获得表达克隆：

取出预先制备好的-80℃保存的L21(DE3)感受态细胞，在超净台中加入1μL阳性克隆质粒，轻轻混匀后；冰浴半小时，42℃热激90秒，立即放至冰上，冰浴3-5分钟；加入800μlLB培养基,(37℃预热无抗)，100rpm，37℃摇床，复苏60-90分钟；取50-100μL菌液涂板，37℃，过夜培养，获得重组表达克隆的单菌落。

ypk_AFP1001蛋白的诱导与纯化

1)活化：将已构建好的蛋白表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)(pET28a-ypk_AFP1001)，挑单菌落，接种于含有适量Km 5mL液体LB培养基中，于220rpm，37℃摇床中培养至平台期；

2)转接扩大培养：按1％的比例将菌转接于含有适量Km的500mL LB液体培养基的1L的三角瓶中，37℃，180rpm摇动培养；检测OD600，至0.6时，将摇床温度调至26℃，并按终浓度0.5mM加入诱导剂IPTG，开始诱导；过夜培养，约16-18小时后，诱导完毕；

3)收菌：用低温离心机在4℃下收集菌体，8000rpm，10分钟，重复此步骤，直至收集到所有菌液中的菌体，然后用Binding buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，30mMimidazole)洗涤菌体两次；

4)破碎菌体：加入适量Binding buffer，充分震荡，将菌体悬浮起来，经低温高压细胞破碎仪压榨破碎菌体后，置于超声波破碎仪中进行超声用Binding buffer充分悬浮菌体，在4℃条件下，用超声波细胞破碎仪破碎，功率为200W，工作4s,间歇5s，循环数为99，直至将菌液超清，10000rpm，4℃下离心30分钟，将上清转移到干净的三角瓶中；

5)上柱：将上一步中的上清分批全部加入到事先活化好的Ni-NTA亲和纯化柱中，直至全部液体通过柱子流下；

6)洗涤：用Washing buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，100mM imidazole)将柱子洗两遍；

7)洗脱：用Elution buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，250mM imidazole)洗脱，且每次洗脱液收集在1.5mL事先预冷的EP管中，放置于冰上。

8)透析：将煮好的透析袋用去离子水清洗干净，将收集到的蛋白洗脱液注入透析袋中，两端用夹子夹好，放入透析液(10mM Tris-Cl，100mM NaCl)中(透析液中加入DTT，以防止蛋白被氧化)，4℃下透析过夜；

9)分装：将蛋白溶液分装，-80℃保存；跑SDS-PAGE胶来检测蛋白的纯化情况及进行抑制真菌实验；

ypk_AFP1001纯化蛋白的DNA水解实验：

1)、将纯化好的ypk_AFP1001-his蛋白与PUC18T质粒，按照如下体系孵育：

表6

分别按照步骤1，做7组实验组和一组阳性对照，一组阴性对照，将实验组分别放置于25℃，30℃，37℃，42℃，50℃，55℃和70℃培养箱中反应1h，阴性对照和阳性对照置于37℃培养箱反应1h；

2)、配置0.7％琼脂糖凝胶；

3)、将反应后的样品加入load Buffer，100V电压跑胶检测。

ypk_AFP1001纯化蛋白的抑制真菌实验：

1)、制备适于霉菌生长的土豆培养基，配方如下：马铃薯200g、葡萄糖200g、琼脂15～20g和蒸馏水1L；将200g的马铃薯去皮切碎，于沸水中煮烂，用八层纱布过滤得土豆汁，后加入200g葡萄糖，加入琼脂20g，加水定容1L，121℃，25min灭菌；

2)、用打孔器将三层滤纸打孔，置于培养皿中，121℃，25min灭菌

3)、从冻存管中活化霉菌，置于26℃培养箱中活化；

4)、将活化好的霉菌转接于另一份土豆培养基上，放置于26℃培养箱中生长，待其霉菌大小长到合适大小后，将灭菌的滤纸置于霉菌周围(共4份)，分别在滤纸上点阳性对照(放线菌酮)、阴性对照(PBS)、ypk_AFP1001-his(低浓度)、ypk_AFP1001-his(高浓度)蛋白，酒精灯下吹干后，重新置于26℃培养箱中培养；24h后观察抑菌效果。

表7：ypk_AFP1001抑菌活性：

注：+++、++、+表示抑菌活性，由强至弱。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种假结核耶尔森氏菌抗真菌蛋白及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Pro Leu Asp Gln Asn Ile Thr Tyr Gly Gln Ala Arg Gly Tyr

1 5 1015

Glu Gln Phe Tyr Ile Asp Glu Phe Gly Thr Lys Thr Gly Val Arg Gly

202530

Asp Asp Ile Ser Pro Met Asn Arg Gly Asn Lys Ile Asn Ser Tyr Asp

354045

Ser Asn Ser Thr Thr Arg Asp Pro Ile Arg Gln Gln Tyr Phe Asp Asp

505560

Ala Tyr Asp Ser Lys Lys Ser Gly Thr Ser Ser Lys Gly Gly Gly Gly

65707580

Cys

<210> 2

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaccgt tagatcagaa tattacatat ggtcaagctc gtggctatga gcagttttat 60

attgatgagt ttggaaccaa aactggggtg aggggagatg atatatcacc aatgaatcga 120

ggaaataaaa taaactccta cgatagtaat agtacaactc gtgatccaat aagacagcaa 180

tattttgatg atgcttatga tagtaagaaa agtggtacga gctcaaaagg tggcggagga 240

tgttaa 246

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcca tgaaaccgtt agatcagaat atta 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagt taacatcctc cgccaccttt tgag 34