法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-08-11
授权
授权
2018-08-21
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/68 申请日:20180420
实质审查的生效
2018-07-27
公开
公开
技术领域
本发明涉及医用检测试剂技术领域，具体涉及一种特异性肺非小细胞癌早期自身抗体酶联免疫诊断panel。
背景技术
肺癌已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位，5年生存率为30-40％。肺癌通常指的是起源于支气管黏膜上皮的恶性肿瘤。肺癌根据世界卫生组织(WHO)的病理学分析,可分为两种主要组织类型:小细胞肺癌(SCLC，small cell lung cancer)和非小细胞肺癌(NSCLC，non-small cell lung cancer)。
非小细胞型肺癌包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。因此，肺非小细胞肺癌的早期诊断和及时治疗是延长5年存活期的关键。
目前用于肺癌早期诊断的方法主要依靠X线检查、CT、经皮穿刺肺活检、纤维支气管镜，肿瘤标志物如NSE、CEA、SCC、CYFR21-1等，但其都缺乏特异性。
近年来研究表明，肿瘤在发生早期即可激发宿主体内产生自身抗体(AAbs)，利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的特异性和敏感性均比肿瘤抗原(TAAs)检测肿瘤要高得多，是一种非常有前景的肿瘤检测标志物。AAbs在肺癌的诊断中占优势主要体现在：第一，自身抗体比相应肿瘤抗原的敏感度高，可以对肿瘤进行早期诊断。研究表明在影像学确诊实体癌数月至数年前即可检测到自身抗体，有些自身抗体甚至在患者临床出现五年前就可以被检测到。第二，研究发现，单个标志物的敏感性和特异性不足以满足肺癌筛查，多个标志物组合是获取高敏感性和高特异性诊断的手段。那么，获取高敏感性和特异性的抗体组合，从而制作成检测试剂盒用于临床诊断，具有重要的应用价值和社会效益。因此，本领域迫切需要开发能够诊断非小细胞肺癌的特异性抗体及其特异性抗体组合，实现对癌症进行早期诊断及为个体患者提供更好的辅助治疗方法。本发明将为非小细胞肺癌以及癌前病变的早期诊断、高危人群的筛查提供有用的血清学标志物。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的在于提供一种早期诊断肺非小细胞癌的有效方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个方面提供一种早期诊断肺非小细胞癌的标志物，该标志物为与血清中抗原NF2相结合的抗体。
本发明的另一个方面提供一种早期诊断肺非小细胞癌的血清标志物，该标志物为与血清中抗原KLF8相结合的抗体。
本发明的再一个方面提供一种早期诊断肺非小细胞癌的血清标志物，该标志物为与血清中抗原POU4F3相结合的抗体。
本发明的再一个方面提供一种早期诊断肺非小细胞癌的血清标志物组合，该组合为与血清中抗原NF2、KLF8和POU4F3相结合的抗体。
本发明公开中的NF2、KLF8和POU4F3抗原产生的自身抗体，是先从含有1627个疾病相关抗原的蛋白质芯片中筛选得到10个自身抗体，再运用小规模蛋白质芯片(包含上述10个自身抗体的抗原)进行中筛，得到6个自身抗体，最后，核实阶段运用ELISA方法从6个自身抗体中，最终筛选确认得到的有效特异性抗体NF2、KLF8和POU4F3组合，检测这些抗体的标志物在临床早期诊断肺非小细胞癌具有很高的应用价值，而且灵敏度高，特异性强。但是研究发现，这三种标志物联合成的组合物诊断价值比单个标志物的诊断价值更高，且敏感性和特异性也提高。
本发明的另一个方面，提供一种上述标志物或标志物组合在非小细胞肺癌的早期诊断试剂或试剂盒中的应用。
所述非小细胞肺癌包括肺鳞癌、肺腺癌、大细胞肺癌。
本发明的再一个方面，提供一种肺非小细胞癌的早期特异性自身抗体诊断试剂盒，该试剂盒包括产生NF2、KLF8和POU4F3自身抗体的抗原。
本发明的再一个方面，提供一种肺非小细胞癌的早期特异性自身抗体诊断试剂盒，该试剂盒还包括1M碳酸氢钠缓冲液，PBST缓冲液，酶标抗体，TMB底物，终止液，ELISApanel板。
优选的，所述PBST是含5％脱脂奶粉的PBST，配制方法为：取5g脱脂奶粉，加入100mlPBST中，配制成为5％脱脂奶粉的PBST。
优选的，所述终止液为2M H2SO4终止液。
所述ELISA panel板如图1所示。
所述酶标抗体为HRP标记的抗待测抗体的种属来源的IgG的抗体。
上述所述诊断试剂盒诊断价值高，敏感性和特异性也高。
上述试剂盒的使用方法如下：
1、包被：用1M的碳酸氢钠缓冲液将有肺癌抗原NF2、KLF8和POU4F3分别以5ug/ml、2ug/ml和2ug/ml的最佳包被浓度包被于ELISA板，4℃过夜，然后使用5％脱脂奶粉的PBST封闭1.5小时；
2、加样：用含5％脱脂奶粉的PBST将待测样品血清1：100稀释，然后取100μL/孔加入上述包被有抗原的微孔板中，37℃孵育30min，PBST洗涤5遍；
3、加HRP标记的抗体：除空白孔外，各反应孔中分别加入100μl HRP标记的抗待测抗体的种属来源的IgG的抗体，37℃孵育30min，去除液体，并用PBST洗涤5遍；
4、加显色底物：在各反应孔中加入TMB底物，37℃显色15min；
5、终止反应：在各反应孔中加入2M H2SO4终止液；
6、结果判定：在MD-SpectraMax M5多功能酶标仪上，于波长450nm和630nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，将三种标志物的OD值带入方程，得到的p值≥cutoff值0.43，即为阳性结果，当p值＜cutoff值0.43时，为阴性结果。
所述方程为logistic回归所得方程，为ln(p/1-p)＝-1.038+33.766×ODNF2+21.673×ODKLF8+14.004×ODPOU4F3。
本发明的有益效果
1)本发明首次从血清中筛选出NF2、KLF8和POU4F3抗体，可作为早期诊断肺非小细胞癌的标志物，研究检测发现，这些标志物及标志组合物具有诊断价值，KLF8 AUC为0.744，POU4F3 AUC为0.612，NF2 AUC为0.621，标志物组合AUC为0.805(在医学研究中，一般认为AUC≤0.5时对诊断没有意义，在0.5＜AUC≤1时有诊断价值，其中1为最理想)，且灵敏度高，特异性强。因此，本发明发现的这3种血清标志物或标志物组合可以成为诊断肺非小细胞癌的重要指标。此外，通过研究发现，这三种标志物联合成的组合物诊断价值比单个标志物的诊断价值更高，且敏感性和特异性也提高。
2)本发明抗体的筛选来源于大量的临床样本而出，准确性高，指标更为客观。
3)本发明提供的肺非小细胞癌的早期特异性自身抗体诊断试剂盒灵敏度高，特异性强，操作简单、检测方便，在临床上推广该试剂盒，对非小细胞肺癌的诊断有一定的意义。
附图说明
图1是ELISA板。
图2是KLF8 ROC曲线。
图3是POU4F3 ROC曲线。
图4是NF2 ROC曲线。
图5是三者联合ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：
本发明肺癌特异抗体是利用蛋白质芯片筛选获得(购于上海优宁维生物技术有限公司)。
实验样本、试剂和仪器：
血清样本：健康人群血清样本来源于体检中心。病例血清样本来源于山东省肿瘤医院及山东省千佛山医院。
试剂：TMB底物购自美国BD公司。
HRP标记的抗待测抗体的种属来源的IgG的抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
本发明蛋白质芯片购于上海优宁维生物技术有限公司。
MD-SpectraMax M5多功能酶标仪购自美国。
实施例1 初筛实验：
血清收集：对照组血清来自体检中心的健康人群。所有肺癌病例均经过组织病理学诊断，依据最新WHO肺癌组织分类及第6版肺癌UICC分期标准，并满足：①病理组织学或细胞学确诊的原发性肺非小细胞癌患者(包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌)。②采血前未接受过任何抗癌治疗。③所有患者签署知情同意书。
首先将病人的血清与含有1627个疾病相关蛋白质芯片杂交，获得特异性结合的高亮点，芯片经过MicroVigene software(Vigene Tech version 2.9.9.2)扫描，得到光密度值。通过统计学软件spss17.0进行分析筛选出与检测血清中抗体特异性结合的抗原蛋白。
筛选自身抗体的依据为：95％的病人和对照血清有统计学差异，并：95％的实验组病人的数值高于95％的对照组的数值2倍。
通过以上筛选标准，从1627个自身抗体中筛选出10个自身抗体。
结论：从1627个自身抗体中筛选出10个自身抗体，10个自身抗体见表1。
表1初筛筛选出的10个自身抗体
实施例2 中筛实验方案：
1)血清收集：肺良性肿瘤病人血清：①采血前未接受过任何抗癌治疗。②所有患者均签署知情同意书。所有肺癌病例入组标准同初筛。
2)蛋白质芯片中筛：将初筛到的10个抗体对应的抗原蛋白打印于玻片上，制成芯片，在各张芯片上加入病人血清或对照血清，经加入兔抗人二抗、扫描、统计学分析。
筛选自身抗体的依据为：在特异性大于90％前提下，敏感性在20％以上。
经过中筛得到6个自身抗体分别为HOXA1，IKZF3，KLF8，NF2，POU4F3，TLX2。
结论：中筛实验中，统计学分析后得到上述6个自身抗体。
实施例3 核实阶段实验方案：
1)血清收集：收集原则同初筛阶段。但不能有重复血清。
2)运用ELISA(酶联免疫吸附实验)方法检测中筛后得到的有效抗体的相对表达量(OD值)。其方法为：在96孔板中，包被抗-GST的抗体孵育过夜后，加入带有GST标签的相应抗原蛋白，抗原被抗-GST捕获，包被于孔板内。再加入实验用血清孵育，最后加入兔抗人二抗，TMB底物显色，OD450读取数值。
筛选的自身抗体的依据：在特异性大于90％前提下，敏感性在30％以上。
结论：检测获得三个血清中特异自身抗体NF2、KLF8、POU4F3。
实施例4 数据统计分析阶段
1)运用ELISA得到的有效抗体的原始数据，spss17.0绘制各个抗体的ROC曲线，计算各个自身抗体的AUC、特异性和敏感性。如图2、图3、图4所示。
2)将上述核实阶段得到的有效抗体组合，进行抗体联合检测。采用logistic回归方法建立回归方程，具体为：ln(p/1-p)＝-1.038+33.766×ODNF2+21.673×ODKLF8+14.004×ODPOU4F3。得到联合检测的预测概率p，再把预测概率作为检验变量进行ROC曲线分析，获得AUC、灵敏度和特异度等诊断效能参数。如图5所示。
3)诊断临界值判定标准：以特异度＞90％时取得的最大敏感度所对应的临界值，同时使该临界值最靠近坐标轴左上方。选取特异度＞90％主要是为使该检测适用于早期诊断。
结果：KLF8 AUC为0.744，敏感度为82.5％，特异度62.5％；POU4F3 AUC为0.612，敏感度为70.5％，特异度52.5％；NF2 AUC为0.621，敏感度为45％，特异度为82.5％；三者联合AUC为0.805，敏感度为82.5％，特异度为72.5％。
以上结果提示KLF8抗体、NF2抗体、POU4F3抗体对非小细胞肺癌有一定的诊断价值，且三者联合后诊断价值更高，特异性和灵敏度更高。
实施例5
一种肺非小细胞癌的早期特异性自身抗体诊断试剂盒，该试剂盒由产生NF2、KLF8和POU4F3抗体的抗原，1M的碳酸氢钠缓冲液，PBST缓冲液，酶标抗体，TMB底物，终止液组成。
所述PBST是含5％脱脂奶粉的PBST，配制方法为：取5g脱脂奶粉，加入100mlPBST中，配制成为5％脱脂奶粉的PBST。
所述终止液为2M H2SO4终止液。
上述试剂盒的使用方法如下：
1、包被：用1M的碳酸氢钠缓冲液将有肺癌抗原NF2、KLF8和POU4F3以各自最佳包被浓度(5ug/ml、2ug/ml和2ug/ml)包被于ELISA板(如图1所示)，4℃过夜，然后使用5％脱脂奶粉的PBST封闭1.5小时；
2、加样：用含5％脱脂奶粉的PBST将待测样品血清1：100稀释，然后取100μL/孔加入上述包被有抗原的微孔板中，37℃孵育30min，PBST洗涤5遍；
3、加HRP标记的抗体：除空白孔外，各反应孔中分别加入100μl HRP标记的抗待测抗体的种属来源的IgG的抗体，37℃孵育30min，去除液体，并用PBST洗涤5遍；
4、加显色底物：在各反应孔中加入TMB底物，37℃显色15min；
5、终止反应：在各反应孔中加入2M H2SO4终止液；
6、结果判定：在MD-SpectraMax M5多功能酶标仪上，于波长450nm和630nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，将三种标志物的OD值带入方程，得到的p值≥cutoff值0.43，即为阳性结果，当p值＜cutoff值0.43时，为阴性结果。
所述方程为logistic回归所得方程，为ln(p/1-p)＝-1.038+33.766×ODNF2+21.673×ODKLF8+14.004×ODPOU4F3。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
机译： 早期诊断癌症的基础是寻找针对csk蛋白的自身抗体，以及用于实施该试剂盒的试剂盒。
机译： 用于检测内皮细胞特异性分子1的试剂盒，例如用于早期诊断血管内皮的改变，包括两种特异性抗体
机译： 用于心血管疾病的早期诊断的组合物，用于心血管疾病的早期诊断的试剂盒和用于早期诊断心血管疾病的信息的方法
