检测新型隐球菌的成套试剂

摘要

本发明公开了一种检测新型隐球菌的成套试剂。本发明公开的检测新型隐球菌的成套试剂由检测或辅助检测新型隐球菌的引物对和探针组成；所述引物由名称分别为F和R的单链DNA组成；F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；探针的序列为序列表的序列3。实验证明，本发明的检测新型隐球菌的成套试剂在检测新型隐球菌时，具有高特异性，高灵敏度以及很好的重复性与扩增效率，检测新型隐球菌简便、快速、准确，可以用来检测新型隐球菌和制备检测新型隐球菌的试剂。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，检测新型隐球菌的成套试剂。

背景技术

新型隐球菌属于真菌，又名溶组织酵母菌(TorulaHistolytica)。属于条件致病菌，通常情况下，人类对该菌有一定的天然免疫力。当皮肤粘膜受创伤后，或在人体免疫系统平衡缺失时，可能导致病人发生严重感染，如血流感染等。

血流感染(bloodstream infections，BSI)是指一种或多种病原微生物侵入机体血液循环，在血液中释放毒素，生长繁殖并释放代谢产物，引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。

随着基因组学和蛋白质组学的发展，应用于临床实验室血流感染检测的分子生物学技术日益增多，如聚合酶链式反应，质谱，基因芯片，高通量测序等。

实时荧光定量PCR中的TaqMan MGB探针法，属于聚合酶链式反应。TaqMan MGB探针法能否实现针对新型隐球菌感染的全血样本中，新型隐球菌病原体的直接检测的关键，是能否设计一套灵敏度高，特异性好的引物探针，目前，国内外文献报道中尚未有相关MGB探针的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测新型隐球菌。

本发明首先提供了用于检测或辅助检测新型隐球菌的成套试剂，由检测或辅助检测新型隐球菌的引物对和探针组成；

所述引物对由名称分别为F和R的单链DNA组成；

所述F为如下(a1)或(a2)；

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述R为如下(a3)或(a4)；

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述探针的序列为如下(a5)或(a6)；

(a5)序列表的序列3；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的序列。

所述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加具体可为1-5个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。

所述探针可由荧光基团和淬灭基团修饰。所述荧光基团可为FAM荧光基团，所述淬灭基团可为NFQ-MGB。所述荧光基团和所述淬灭基团可位于所述探针的两端。在本发明的一个实施例中，所述荧光基团修饰在所述探针的5′端，所述非荧光淬灭基团修饰在所述探针的3′端。

所述引物对的两条单链DNA可独立包装，这两条单链DNA的摩尔比可为1:1。

所述成套试剂中的各单链DNA和探针均可独立包装。所述成套试剂中所述引物对的两条单链DNA和所述探针的摩尔比可为1：1：1。

本发明还保护所述检测新型隐球菌的引物对。

本发明还保护含有所述成套试剂或所述引物对的系统；所述系统的用途为如下(b1)或(b2)：

(b1)检测待测菌是否为新型隐球菌；

(b2)检测待测样本中是否含新型隐球菌。

所述系统还包括利用定量PCR检测新型隐球菌所需要的其他试剂和/或仪器。

所述利用定量PCR检测新型隐球菌所需要的其他试剂具体可为Superscript IIIplatinum one step qRT-PCR试剂盒中的试剂，如2×Reaction Mix、Superscript IIIplatinum Taq Mix和/或ROX reference dye。所述利用定量PCR检测新型隐球菌所需要的仪器具体可为ViiA^TM>

所述系统可仅由所述成套试剂或所述引物对组成，也可由所述成套试剂或所述引物对与所述利用定量PCR检测新型隐球菌所需要的其他试剂和/或仪器组成。

所述系统可为仅包括相关试剂的试剂盒。

本发明还保护所述成套试剂或所述引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：

(c1)检测待测菌是否为新型隐球菌；

(c2)检测待测样本中是否含新型隐球菌。

本发明还保护所述成套试剂的制备方法，包括将各单链DNA和探针分别独立包装。

本发明还保护所述引物对的制备方法，包括将所述引物对的两条单链DNA分别独立包装。

本发明还保护所述成套试剂在检测或辅助检测新型隐球菌中的应用。

本发明还保护所述引物对在检测或辅助检测新型隐球菌中的应用。

利用所述成套试剂在检测待测样品时，如反应体系中出现扩增曲线，所述待测菌为或候选为新型隐球菌或所述待测样品含有或候选含有新型隐球菌；如反应体系中无扩增曲线，所述待测菌不为或候选不为新型隐球菌或所述待测样品不含有或候选不含有新型隐球菌。

以上任一所述待测菌可为无乳链球菌、溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、单增李斯特菌、产气荚膜梭菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、黏质沙雷氏菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、木糖氧化无色杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌或近平滑念珠菌。

实验证明，本发明的检测新型隐球菌的成套试剂在检测新型隐球菌时，具有高特异性，高灵敏度以及很好的重复性与扩增效率，检测新型隐球菌简便、快速、准确，可以用来检测新型隐球菌和制备检测新型隐球菌的试剂。

附图说明

图1为实施例1的成套试剂的特异性检测。1-23依次表示10种革兰氏阳性菌(无乳链球菌，溶血葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，肺炎链球菌，单增李斯特菌，产气荚膜梭菌，表皮葡萄球菌，屎肠球菌，粪肠球菌)，9种革兰氏阴性菌(大肠杆菌，产酸克雷伯菌，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯菌，黏质沙雷氏菌，鲍曼不动杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，木糖氧化无色杆菌，洋葱伯克霍尔德菌)，3种真菌(白色念珠菌，光滑念珠菌，近平滑念珠菌)以及阴性对照。

图2为实施例1的成套试剂的灵敏度检测。

图3为实施例4的标准曲线。

图4为对应于图3的各点的扩增曲线。

图5为批间标准曲线。

图6为第一次重复实验的批内标准曲线。

图7为第二次重复实验的批内标准曲线。

图8为第三次重复实验的批内标准曲线。

图9为成套试剂甲的特异性检测结果。

图10为成套试剂乙的特异性检测结果。

图11为成套试剂丙的特异性检测结果。

图12为成套试剂丙的灵敏度检测结果。

图13为成套试剂丁的特异性检测结果。

图14为成套试剂丁的灵敏度检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、检测新型隐球菌的成套试剂的制备

检测新型隐球菌的成套试剂由检测或辅助检测新型隐球菌的引物对和探针P组成；

该引物对由名称分别为F和R的单链DNA组成；F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

探针P的序列为序列表的序列3，该探针的5’末端由FAM荧光基团修饰，3’末端由NFQ-MGB淬灭基团修饰。

序列1-序列3的第1位均为相应序列的5′端核苷酸。

检测新型隐球菌的成套试剂的各单链DNA和探针分别独立包装，引物对中的两条单链DNA的摩尔比为1:1。

实施例2、检测新型隐球菌的成套试剂的特异性

一、待测菌株

所用菌株为如下23株菌：

10种革兰氏阳性菌(无乳链球菌，溶血葡萄球菌(舒小莉；吴亦栋；尚世强,细菌16SrRNA基因实时荧光定量及分型方法的建立.中国当代儿科杂志,2008.10(6):p.732-736.)，金黄色葡萄球菌(Li,L.,et al.,Phenol-soluble modulin alpha4mediatesStaphylococcus aureus-associated vascular leakage by stimulating heparin-binding protein release from neutrophils.Sci Rep,2016.6:p.29373.)，化脓性链球菌(Wang,J.,et al.,Identification and cluster analysis of Streptococcuspyogenes by MALDI-TOF massspectrometry.PLoS One,2012.7(11):p.e47152.)，肺炎链球菌(舒小莉；吴亦栋；尚世强,细菌16S rRNA基因实时荧光定量及分型方法的建立.中国当代儿科杂志,2008.10(6):p.732-736.)，单增李斯特菌(Cheng,C.,et al.,Listeriamonocytogenes 10403S Arginine Repressor ArgR Finely Tunes Arginine MetabolismRegulation under Acidic Conditions.Front Microbiol,2017.8:p.145.)，产气荚膜梭菌(王景林,王.,吴东林,康琳,姜永强,A型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆及高效表达.军事医学科学院院刊,2004.28(1):p.28-30.)，表皮葡萄球菌(杨祖钦，尚世强，吴亦栋，杜立中,脑脊液细菌16S rRNA荧光定量PCR快速诊断儿童化脓性脑膜炎.中国实用儿科杂志,2007.22(3):p.192-195.)，屎肠球菌(Si,H.,et al.,Novel plasmid-borne multidrugresistance gene cluster including lsa(E)from a linezolid-resistantEnterococcus faecium isolate of swine origin.Antimicrob Agents Chemother,2015.59(11):p.7113-6.)，粪肠球菌(Shao,C.,et al.,LuxS-dependent AI-2regulatesversatile functions in Enterococcus faecalis V583.JProteome Res,2012.11(9):p.4465-75.))；

9种革兰氏阴性菌(大肠杆菌(舒小莉；吴亦栋；尚世强,细菌16S rRNA基因实时荧光定量及分型方法的建立.中国当代儿科杂志,2008.10(6):p.732-736.)，产酸克雷伯菌(Jiang,X.,et al.,Sequencing of blaIMP-Carrying IncN2Plasmids,and ComparativeGenomics of IncN2Plasmids Harboring Class 1Integrons.Front Cell InfectMicrobiol,2017.7:p.102.)，铜绿假单胞菌(Jiang,F.,et al.,The Pseudomonasaeruginosa Type VI Secretion PGAP1-like Effector Induces Host Autophagy byActivating EndoplasmicReticulum Stress.Cell Rep,2016.16(6):p.1502-9.)，肺炎克雷伯菌(Jiang,X.,et al.,Sequencing of blaIMP-Carrying IncN2Plasmids,andComparative Genomics of IncN2Plasmids Harboring Class 1Integrons.Front CellInfect Microbiol,2017.7:p.102.)，黏质沙雷氏菌(高建峰；朱力；刘先凯；严群；杨树兴；冯尔玲；植懿丹；廖祥儒；王恒樑,温度对粘质沙雷菌蛋白质表达谱的影响.军事医学,2007.31(4):p.312-316.)，鲍曼不动杆菌(刘炜，张丽娟,谭.程.王.黄.,多耐鲍曼不动杆菌分子流行病学分析.传染病监测,2015.30(1).)，嗜麦芽窄食单胞菌(汤雪萍；许广杨；姜永强；李艳,钱.尚.,嗜麦芽窄食单胞菌全菌灭活苗在小鼠体内的免疫保护作用.军事医学2016.40(4).)，木糖氧化无色杆菌(Chen,Z.,et al.,IMP-1encoded by a novel Tn402-like class 1integron in clinical Achromobacter xylosoxidans,China.Sci Rep,2014.4:p.7212.)，洋葱伯克霍尔德菌)；

4种真菌(白色念珠菌(Li,M.,et al.,Tea tree oil nanoemulsions forinhalation therapies of bacterial and fungal pneumonia.Colloids Surf BBiointerfaces,2016.141:p.408-16.)，光滑念珠菌(王菡；韩黎；胡小华,念珠菌PCR-SSCP分子流行病学分析,全军防生物危害医学专业学术会议2007,第八届全军防生物危害医学专业学术会议论文集:北京.)，新型隐球菌(王欣，张伦理，郭彦，杨裔，于虹，高基民，寇志华，周育森,新型隐球菌检测方法的比较及临床应用.中国卫生检验杂志,2013.23(5):p.1180-1195.)，近平滑念珠菌(Huang,X.,et al.,Mitochondrial complex I bridges aconnection between regulation of carbon flexibility and gastrointestinalcommensalism in the human fungal pathogen Candida albicans.PLoS Pathog,2017.13(6):p.e1006414.)。

二、特异性检测

提取上述各菌株的基因组DNA，采用Superscript III platinum one step qRT-PCR试剂盒按照如下反应体系进行实时荧光定量PCR(qPCR)检测实施例1的成套试剂的特异性，正向引物和反向引物在反应体系中的终浓度为200nM，探针在反应体系中的终浓度为200nM。利用水替换基因组DNA作为阴性对照，每种基因组设置三个重复。

反应体系：

在ViiA^TM>

结果如图1所示。结果显示，阴性对照和除新型隐球菌外的其他菌株的反应体系中均未出现阳性扩增曲线，仅有新型隐球菌的反应体系中出现阳性扩增曲线，表明，实施例1的检测新型隐球菌的成套试剂识别新型隐球菌的基因组DNA，与其他作为模板的基因组DNA均未发生反应，具有很好的特异性。

实施例3、检测新型隐球菌的成套试剂的灵敏度

新型隐球菌定量后进行10倍系列稀释，分别得到浓度为10³cfu/mL、10²cfu/mL、和10¹cfu/mL的菌株悬液，各取1mL菌株悬液利用相同方法提取基因组DNA，并用80μL洗脱缓冲液洗脱收集基因组，取5μL作为模板。

按照实施例2的反应体系与反应程序以上述各基因组溶液为模板检测实施例1的成套试剂的灵敏度，每种浓度的基因组溶液设置三个重复。

结果如图2所示。结果显示，10³拷贝/mL、10²拷贝/mL和10¹拷贝/mL的基因组溶液的反应体系中均有扩增曲线，表明，实施例1的成套试剂可以检测到10¹拷贝/mL的新型隐球菌基因组，此时的Ct值为38.26。

实施例4、检测新型隐球菌的成套试剂的扩增效率

新型隐球菌定量后进行10倍系列稀释，分别得到浓度为10⁷cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁴cfu/mL、10³cfu/mL和10²cfu/mL的菌株悬液，各取1mL菌株悬液利用相同方法提取基因组DNA，并用80μL洗脱缓冲液洗脱收集基因组，取5μL作为模板。

按照实施例2的反应体系与反应程序以上述各基因组溶液为模板检测实施例1的成套试剂的扩增效率，每种浓度的基因组溶液设置三个重复。

标准曲线见图3，R²＝0.996，扩增效率(Eff％)为93.441，图3各点的扩增曲线见图4。结果表明实施例1的成套试剂具有很好的扩增效率。

实施例5、检测新型隐球菌的成套试剂的批间重复性

新型隐球菌定量后进行10倍系列稀释，分别得到浓度为10⁶cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁴cfu/mL、10³cfu/mL和10²cfu/mL的菌株悬液，各取1mL菌株悬液利用相同方法提取基因组DNA，并用80μL洗脱缓冲液洗脱收集基因组，取5μL作为模板。

按照实施例2的反应体系与反应程序以上述各基因组溶液为模板检测实施例1的成套试剂的扩增效率。该实验重复三次，重复实验间隔时间为5天。

计算扩增效率的批间批内变异系数。批间的标准曲线如图5所示，R²＝0.995，扩增效率(Eff％)＝89.258，批间变异系数为2.49％。第一次重复实验的批内标准曲线如图6所示，R²＝0.993，扩增效率(Eff％)＝89.84，第二次重复实验的批内标准曲线如图7所示，R²＝0.998，扩增效率(Eff％)＝88.047，第三次重复实验的批内标准曲线如图8所示，R²＝0.998，扩增效率(Eff％)＝90.235，批内变异系数为1.30％。表明，实施例1的成套试剂的重复性好。

对比例1、其他成套试剂的检测

一、成套试剂甲

利用根据新型隐球菌基因组DNA设计的成套试剂甲，利用成套试剂甲以实施例2中的方法进行特异性检测。

成套试剂甲由引物对甲和探针甲组成，引物对甲的两条单链DNA的序列如下：

F:5′-TATCAGGAAATCTACAACGTCCACG-3′；

R:5′-TATCAGGAAATCTACAACGTCCACG-3′；

探针甲的序列为:5′-CTCGGCATCCCCATCAAATTTCTTG-3′；该探针的5’末端由FAM荧光基团修饰，3’末端由NFQ-MGB淬灭基团修饰。

结果如图9所示。结果显示，成套试剂甲与目标模板无反应，但是与非特异模板有杂交。成套试剂甲不可用来检测新型隐球菌的扩增。

二、成套试剂乙

利用根据新型隐球菌基因组DNA设计的成套试剂乙，利用成套试剂乙以实施例2中的方法进行特异性检测。

成套试剂乙由引物对乙和探针乙组成，引物对乙的两条单链DNA的序列如下：

F:5′-TGATGGATGTGGCGTTCACC-3′；

R:5′-AATACTTGTGTCTCCAGTTCTCGC-3′；

探针乙的序列为:5′-AGGGACAGCATCTGCAAATCGGTG-3′；该探针的5’末端由FAM荧光基团修饰，3’末端由NFQ-MGB淬灭基团修饰。

结果如图10所示。结果显示，成套试剂乙与目标模板无反应，不可用来检测新型隐球菌的扩增。

三、成套试剂丙

利用根据新型隐球菌基因组DNA设计的成套试剂丙，利用成套试剂丙以实施例2中的方法进行特异性检测。

新型隐球菌定量后进行10倍系列稀释，分别得到浓度为10⁴cfu/mL、10³cfu/mL、10²cfu/mL、10¹cfu/mL和10⁰cfu/mL的菌株悬液，各取1mL菌株悬液利用相同方法提取基因组DNA，并用80μL洗脱缓冲液洗脱收集基因组，取5μL作为模板。

利用成套试剂丙以实施例3中的方法进行灵敏度检测。

成套试剂丙由引物对丙和探针丙组成，引物对丙的两条单链DNA的序列如下：

F:5′-TATCAGGAAATCTACAACGTCCACG-3′；

R:5′-CCCATAGTGAACATCCACTCCCTA-3′；

探针丙的序列为:5′-CTCGGCATCCCCATCAAATTTCTTG-3′；该探针的5’末端由FAM荧光基团修饰，3’末端由NFQ-MGB淬灭基团修饰。

特异性检测结果如图11所示。灵敏度检测结果如图12所示。结果显示，成套试剂丙灵敏度低，仅可以检测到10³拷贝/mL的新型隐球菌基因组。

四、成套试剂丁

利用根据新型隐球菌基因组DNA设计的成套试剂丁，利用成套试剂丁以实施例2中的方法进行特异性检测。

新型隐球菌定量后进行10倍系列稀释，分别得到浓度为10⁴cfu/mL、10³cfu/mL、10²cfu/mL、10¹cfu/mL和10⁰cfu/mL的菌株悬液，各取1mL菌株悬液利用相同方法提取基因组DNA，并用80μL洗脱缓冲液洗脱收集基因组，取5μL作为模板。

利用成套试剂丁以实施例3中的方法进行灵敏度检测。

成套试剂丁由引物对丁和探针丁组成，引物对丁的两条单链DNA的序列如下：

F:5′-TGATGGATGTGGCGTTCACC-3′；

R:5′-AATACTTGTGTCTCCAGTTCTCGC-3′；

探针丙的序列为:5′-AGGGACAGCATCTGCAAATCGGTG-3′；该探针的5’末端由FAM荧光基团修饰，3’末端由NFQ-MGB淬灭基团修饰。

特异性检测结果如图13所示。灵敏度检测结果如图14所示。结果显示，成套试剂丁灵敏度低，仅可以检测到10³拷贝/mL的新型隐球菌基因组。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所

<120> 检测新型隐球菌的成套试剂

<160> 3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

catttgggag atggggatat agtg 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gttactctgc ccgtctcttt gct 23

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

ctggagccat tcgg 14