一种检测半夏中乌头酸含量的HPLC方法

摘要

本发明提供了检测半夏中乌头酸含量的方法在半夏质量检测中的用途，另外本发明提供了一种检测半夏中乌头酸含量的HPLC方法。本发明方法可以准确、有效地检测半夏中的顺式、反式乌头酸含量，为提高半夏的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测半夏中乌头酸含量的HPLC方法。

背景技术

半夏为天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit的干燥块茎。具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结的功效。用于湿痰寒痰，咳喘痰多，痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛，呕吐反胃，胸脘痞闷，梅核气；外治痈肿痰核。

半夏成分复杂，含有多种有机酸、生物碱、蛋白等，其中有机酸类是其发挥疗效的一类重要的药效成分。目前常将琥珀酸含量作为半夏质量的评定标准，例如中国药典2015版中采用电位滴定法，以琥珀酸含量计算测定总有机酸含量，对半夏进行质量控制。该方法操作复杂，易受到其它有机酸及操作条件的影响，误差较大，计量不够准确，对半夏的质量控制并不理想。也有少量文献报道测定半夏中草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸的含量，但评价指标仍不够完善。

因此，为了半夏的全面质量控制，需要进一步寻找半夏中有机酸测定的评价指标及测定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的对半夏进行质量检测的方法。

发明人在研究中首次发现，半夏含有顺式乌头酸、反式乌头酸2种新的有机酸，并对其进行了分离及含量测定。

本发明提供了检测半夏中乌头酸含量的方法在半夏质量检测中的用途。

其中，所述乌头酸为顺式和/或反式乌头酸。

本发明提供了一种检测半夏中乌头酸含量的方法，步骤如下：

a、制备供试品溶液：

取半夏粉末，超声提取，离心，取上清液，加磷酸混匀，用乙酸乙酯萃取，蒸干，用流动相溶解，得供试品溶液；

b、制备对照品溶液：

取顺式乌头酸和/或反式乌头酸对照品，水溶解，得对照品溶液；

c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：流动相为甲醇(或乙腈)-0.1％磷酸溶液(3～10:97～90)；

检测波长：210nm；

d、根据检测结果计算得到半夏中的顺式乌头酸和/或反式乌头酸含量。

其中，步骤a中，超声提取的提取溶剂为水或80％甲醇。

其中，每1g半夏粉末，水的用量为20～50mL；优选地，每1g半夏粉末用50mL水。

其中，步骤a中，每25ml上清液用0.1ml磷酸；和/或，乙酸乙酯的萃取次数为5次。

其中，所述超声提取的时间为15～120分钟；优选地，提取的时间为60分钟。

其中，步骤c中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm；优选的色谱柱型号为Inertsil ODS-3C18色谱柱。

其中，步骤c中，流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液(3:97)、乙腈-0.1％磷酸溶液(3:97)或甲醇-0.1％磷酸溶液(10:90)。

其中，所述色谱条件的柱温为25～35℃；流速为0.5～0.8mL/min；

优选地，柱温为35℃；流速为0.8mL/min。

发明人通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了测定半夏中顺式、反式乌头酸含量的HPLC方法，该方法准确可靠、简便快速，为半夏的有机酸含量分析、提高半夏的全面质量控制奠定了基础，有利于半夏药材的开发利用，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1空白样品HPLC色谱图。

图2对照品HPLC图谱图；其中，1为顺式乌头酸，2为反式乌头酸。

图3半夏样品HPLC图谱(实施例1方法)；其中，1为顺式乌头酸，2为反式乌头酸。

图4半夏样品HPLC图谱(实施例2方法)；其中，1为顺式乌头酸，2为反式乌头酸。

图5半夏样品HPLC图谱(实施例3方法)；其中，1为顺式乌头酸，2为反式乌头酸。

图6半夏样品HPLC图谱(实施例4方法)；其中，1为顺式乌头酸，2为反式乌头酸。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1 本发明HPLC方法

方法如下：

1、制备供试品溶液：

取半夏样品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置150ml锥形瓶中，加水50mL，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，离心，精密量取上清液25mL，加磷酸0.1mL，摇匀，用乙酸乙酯萃取5次，每次20mL，合并乙酸乙酯，蒸干，残渣加甲醇(或乙腈)-0.1％磷酸溶液(3:97)溶解，并定容至5mL，滤过，取续滤液，即得。

2、制备对照品溶液

精密称取对照品顺式乌头酸、反式乌头酸，水溶解，摇匀，即得。

制备空白样品：空白样品的制备方法如下：取150ml锥形瓶，加水50mL，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，离心，精密量取澄清液25mL，加磷酸0.1mL，摇匀，用乙酸乙酯萃取5次，每次20mL，合并乙酸乙酯，蒸干，残渣加甲醇-0.1％磷酸溶液(3:97)溶解，并定容至5mL，滤过，取续滤液，即得。

3、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

安捷伦1200高效液相色谱仪(DAD检测器)，Inertsil ODS-3C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，以甲醇-0.1％磷酸溶液(3:97)为流动相；流速：0.8mL/min，检测波长为210nm；柱温为35℃。

4、根据检测结果计算得到半夏中的顺式乌头酸、反式乌头酸含量。

测定结果见图1-3。

可见，本发明方法能够有效测定半夏中的顺式乌头酸和反式乌头酸。

实施例2 本发明HPLC方法

方法如下：

1、制备供试品溶液：同实施例1。

2、制备对照品溶液：同实施例1。

3、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

安捷伦1200高效液相色谱仪(DAD检测器)，Inertsil ODS-3C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，以乙腈-0.1％磷酸溶液(3:97)为流动相；流速：0.8mL/min，检测波长为210nm；柱温为35℃。

4、根据检测结果计算得到半夏中的顺式乌头酸、反式乌头酸含量。

测定结果见图4。

可见，本发明方法能够有效测定半夏中的顺式乌头酸和反式乌头酸。

实施例3 本发明HPLC方法

方法如下：

1、制备供试品溶液：同实施例1。

2、制备对照品溶液：同实施例1。

3、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

安捷伦1200高效液相色谱仪(DAD检测器)，Inertsil ODS-3C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，以甲醇-0.1％磷酸溶液(3:97)为流动相；流速：0.5mL/min，检测波长为210nm；柱温为25℃。

4、根据检测结果计算得到半夏中的顺式乌头酸、反式乌头酸含量。

测定结果见图5。

可见，本发明方法能够有效测定半夏中的顺式乌头酸和反式乌头酸。

实施例4 本发明HPLC方法

方法如下：

1、制备供试品溶液：同实施例1。

2、制备对照品溶液：同实施例1。

3、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

安捷伦1200高效液相色谱仪(DAD检测器)，Inertsil ODS-3C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，以甲醇-0.1％磷酸溶液(10:90)为流动相；流速：0.5mL/min，检测波长为210nm；柱温为25℃。

4、根据检测结果计算得到半夏中的顺式乌头酸、反式乌头酸含量。

测定结果见图6。

可见，本发明方法能够有效测定半夏中的顺式乌头酸和反式乌头酸。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1 本发明方法的工艺参数筛选

一、实验材料

1、药材来源

半夏药材，采自四川省南充市蓬安县半夏试验田，去皮，干燥而成。

2、仪器、试剂、试药

安捷伦1200高效液相色谱仪(DAD检测器)；Inertsil ODS-3C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；干燥箱；旋转蒸发仪(德国Heldolph)；循环水式多用真空泵；HY-4A数显调速多用振荡器；离心机(美国Beckmancoulter)。

顺式乌头酸、反式乌头酸均购自中科微大，纯度＞98％。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其他为分析纯。

二、本发明方法的筛选

(一)对照品溶液的制备

分别精密称取对照品顺式乌头酸、反式乌头酸10.20mg、11.46mg，水溶解，摇匀，即得。

(二)供试品溶液的制备

发明人对供试品的提取方法、提取溶剂、提取时间及提取溶剂用量进行了考察，具体如下：

1、提取方法的考察

取半夏样品粉末(过四号筛)1g，精密称定，加水50mL，称定重量，超声处理或加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，离心，精密量取上清液25mL，加磷酸0.1mL，摇匀，用乙酸乙酯萃取5次，每次20mL，合并乙酸乙酯，蒸干，残渣加甲醇(或乙腈)-0.1％磷酸溶液(3:97)溶解，并定容至5mL，滤过，取续滤液，即得。

取供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，以顺式乌头酸和反式乌头酸的混合溶液为对照品，计算2种乌头酸的含量。

色谱条件如下：以Inertsil ODS-3C18(4.6×250mm，5μm)为色谱柱，以甲醇-0.1％磷酸溶液(3:97)为流动相；流速：0.8mL/min，检测波长为210nm；柱温为35℃。

结果见表1。

表1 不同提取方式处理结果

由表1可知，仅超声提取方法能够提取出2种乌头酸，回流提取方法无法提取得到2种乌头酸，而且提取过程中，加热回流提取高温易导致半夏中的淀粉糊化，不利于后续的离心及成分的提取。

因此，选择超声提取方法制备待测样品。

2、提取溶剂的考察

选用不同的溶剂，其它按照上述超声提取的方法，考察水和80％甲醇两种提取溶剂的影响。结果见表2。

表2 不同提取溶剂处理结果

由表2可知，2种溶剂均能够提取出乌头酸，其中，水的提取效果最好。因此，选择水为提取溶剂。

2、提取时间的考察

按上述超声提取的方法，以水为提取溶剂，超声处理15、30、60、120min，考察提取时间。结果见表3。

表3 不同提取时间处理结果

由表3可知，超声时间为30-120min时均能有效提取出2种乌头酸，为了保障不同样品的充分提取，提取时间选择60min。

4、提取溶剂用量的考察

取样品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，加水20mL、30mL、40、50mL，称定重量，超声处理60min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，离心，精密量取上清液，加磷酸0.1mL，摇匀，用乙酸乙酯萃取5次，每次20mL，合并乙酸乙酯，蒸干，残渣加甲醇(或乙腈)-0.1％磷酸溶液(3:97)溶解，并定容至5mL，滤过，取续滤液，即得。考察提取时间。

取供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，以顺式乌头酸和反式乌头酸的混合溶液为对照品，计算2种乌头酸的含量。

色谱条件如下：以Inertsil ODS-3C18(4.6×250mm，5μm)为色谱柱，以甲醇-0.1％磷酸溶液(3:97)为流动相；流速：0.8mL/min，检测波长为210nm；柱温为35℃。结果见表4。

表4 不同提取溶剂用量考察结果

由表4可知，水用量为20-50ml时均能有效提取出2种乌头酸，由于半夏淀粉含量较高，液体体积较少时半夏粉末不易分散，故宜50ml为宜。

因此，最终确定的最佳的供试品溶液制备方法为：取样品粉末(过四号筛)1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，离心，精密量取上清液25mL，加磷酸0.1mL，摇匀，用乙酸乙酯萃取5次，每次20mL，合并乙酸乙酯，蒸干，残渣加甲醇(或乙腈)-0.1％磷酸溶液(3:97)溶解，并定容至5mL，滤过，取续滤液，即得。

综上，本发明人在研究中发现，半夏含有顺式乌头酸、反式乌头酸2种新的有机酸，并通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了测定半夏中顺式、反式乌头酸含量的HPLC方法，该方法准确可靠、简便快速，为半夏的有机酸含量分析、提高半夏的全面质量控制奠定了基础，有利于半夏药材的开发利用，具有良好的应用前景。