一种硫酸鱼精蛋白注射液的制备方法，该方法得到的硫酸鱼精蛋白注射液及应用

摘要

本申请涉及一种硫酸鱼精蛋白注射液的制备方法，至少包括以下步骤：将硫酸鱼精蛋白提取物溶解于水中得溶液，加酸调节溶液pH值为2.5‑3.5，然后进行除菌过滤得到除菌过滤液，最后进行灌封得到硫酸鱼精蛋白注射液。在除菌过程中硫酸鱼精蛋白几乎没有损失，且产物的效价和细菌内毒素测定满足药典规定，可直接用于临床。

说明书

技术领域

本申请涉及蛋白质精制技术领域，具体讲，涉及一种硫酸鱼精蛋白注射液的制备方法，该方法得到的硫酸鱼精蛋白注射液，以及该硫酸鱼精蛋白注射液的应用。

背景枝术

鱼精蛋白是从鱼类精子细胞中提取的一种多聚阳离子肽的硫酸盐。其具有强碱性基团，在体内可与强酸性的肝素结合，形成稳定的复合物，从而使肝素失去抗凝能力。由于该物质能与一些蛋白质、多肽结合，可用来与胰岛素、促皮质激素等形成络合物，以制备长效注射剂。

硫酸鱼精蛋白生产的主要包括提取、分离及精制三个步骤。其中，鱼精蛋白的提取一般是将成熟雄鱼的鱼白绞碎，加入稀醋酸溶液，分离出凝聚的精子核，然后采用有机溶剂沉淀，之后加入无机酸搅拌一定时间，弃去废渣，提取液采用有机溶剂沉淀，得到鱼精蛋白无机酸盐粗品。在分离步骤，最常用的方法就是有机溶剂和硫酸反复沉淀溶解，逐步去除不同的杂质。也有采用蛋白沉淀剂如钨酸、偏磷酸、磺基水杨酸等进行沉淀分离的。

现有技术最常用的蛋白质精制方法是采用色谱柱进行纯化，主要采用离子交换层析和肝素亲和层析。但是，上述方法只能对鱼精蛋白进行提纯，无法直接得到硫酸鱼精蛋白注射液。而且鱼精蛋白原料为带菌原料，目标产物为无菌水溶液，但该蛋白对热不耐受，不能对中间产物进行热灭菌。导致在生产硫酸鱼精蛋白注射液时，对生产过程的无菌控制要求极为苛刻，系国内药品生产环境要求中最高级别，因此需要简化该过程的无菌控制，且不影响提纯效果，通过提纯直接得到硫酸鱼精蛋白注射液。

鉴于此，特提出本申请。

发明内容

本申请的首要发明目的在于提出一种硫酸鱼精蛋白注射液的制备方法。

本申请的第二发明目的在于提出该方法得到的硫酸鱼精蛋白注射液。

本申请的第三发明目的在于提出该硫酸鱼精蛋白注射液的应用。

为了完成本申请的目的，采用的技术方案为：

本申请涉及一种硫酸鱼精蛋白注射液的制备方法，至少包括以下步骤：

(1)将硫酸鱼精蛋白提取物溶解于水中得溶液，加酸调节溶液pH值为2.5-3.5；

(2)对步骤(1)得到的溶液进行除菌过滤，得到除菌过滤液；

(3)对步骤(2)得到的除菌过滤液进行灌封，得到所述硫酸鱼精蛋白注射液。

优选地，步骤(1)中，将所述提取物溶解于水中，得到浓度为10-30g/L，优选为20g/L的溶液。

优选地，步骤(1)中，pH值调节完成后，向所述溶液中补水，稀释至浓度为5-15g/L，优选为10g/L，然后进行步骤(2)。

优选地，所述步骤(2)至少包括以下步骤：

(2a)第一次除菌过滤：采用孔径为0.22μm的除菌滤芯对所述溶液进行过滤，得到第一过滤液；

(2b)第二次除菌过滤：采用孔径为0.22μm的除菌滤芯对所述第一过滤液进行过滤，得到第二过滤液；

(2c)第三次除菌过滤：采用孔径为0.2μm的除菌滤芯对所述第二过滤液进行过滤，得到第三过滤液；

(2d)第四次除菌过滤：采用孔径为0.2μm的除菌滤芯对所述第三过滤液进行过滤，得到所述除菌过滤液。

优选地，步骤(2a)和(2b)中，所述过滤压力≤0.2mpa。

优选地，步骤(2c)中，所述过滤压力≤0.1mpa。

优选地，步骤(2d)中，所述过滤压力≤0.05mpa。

优选地，步骤(2a)-(2d)中，所述过滤过程中控制过滤前后的溶液温度为26-30℃。

优选地，步骤(2c)结束后，对所述第三过滤液进行检验。

优选地，灌封前后均进行充氮气处理，所述氮气浓度为99.999％，保证封口后成品内气体含氧量＜3％。

本申请还涉及所述方法得到的硫酸鱼精蛋白注射液。

本申请还涉及所述硫酸鱼精蛋白注射液在抗肝素中的应用。

本申请的技术方案至少具有以下有益的效果：

本申请提供了一种硫酸鱼精蛋白注射液的制备方法，该方法将硫酸鱼精蛋白提取物溶解并调pH值后，直接进行除菌过滤，即可得到硫酸鱼精蛋白注射液。在除菌过程中硫酸鱼精蛋白几乎没有损失，且产物的效价和细菌内毒素测定满足药典规定，可直接用于临床。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。

本申请硫酸鱼精蛋白注射液的制备方法，至少包括以下步骤：

(1)将硫酸鱼精蛋白提取物溶解于水中得溶液，加酸调节溶液pH值为2.5-3.5；

(2)对步骤(1)得到的溶液进行除菌过滤，得到除菌过滤液；

(3)对步骤(2)得到的除菌过滤液进行灌封，得到硫酸鱼精蛋白注射液。

作为对该方法的一种改进，步骤(1)中，将提取物溶解于水中，得到浓度为10-30g/L，优选为20g/L的溶液。将溶液浓度控制在上述范围，原因为提取物入水后易结成粘稠块状物，若浓度过高则不易溶解，浓度过低则降低后续除菌过滤效率，增加生产成本。优选将水温控制在40±2℃，在该温度下搅拌15分钟可保证提取物完全溶解于水中，且可以避免因温度过高造成的药性变化。

由于除菌过滤对溶液浓度几乎没有影响，因此可以在步骤(1)中的pH值调节完成后，向溶液中补充注射用水，将溶液浓度稀释至5-15g/L，优选为10g/L，即成品浓度，然后进行步骤(2)的除菌过滤。

在过滤领域，滤芯孔径越小，价格越高，过滤速度也相应降低。如果仅使用精度高的除菌滤芯，可以完全拦截细菌与颗粒，但过滤器会很快堵塞，因此需要选择一个过滤速度与滤芯孔径的契合点。可采用分步过滤的方式，在保证过滤效果的前提下，先采用造价较低的大孔径滤芯进行快速过滤，然后采用小孔径滤芯，使最终得到的滤液满足使用要求。因此作为对该方法的一种改进，步骤(2)至少包括以下步骤：

(2a)第一次除菌过滤：采用孔径为0.22μm的除菌滤芯对溶液进行过滤，得到第一过滤液；

(2b)第二次除菌过滤：采用孔径为0.22μm的除菌滤芯对第一过滤液进行过滤，得到第二过滤液；

(2c)第三次除菌过滤：采用孔径为0.2μm的除菌滤芯对第二过滤液进行过滤，得到第三过滤液；

(2d)第四次除菌过滤：采用孔径为0.2μm的除菌滤芯对第三过滤液进行过滤，得到除菌过滤液。

作为对除菌过滤步骤的一种改进，步骤(2a)和(2b)中，除菌滤芯为长度为10英寸的折叠式除菌滤芯，材质为聚醚砜(PES)，过滤面积为0.6m²，过滤压力≤0.2mpa。

作为对除菌过滤步骤的一种改进，步骤(2c)中，除菌滤芯为长度为10英寸的折叠式除菌滤芯，材质为聚偏二氟乙烯(PVDF)，过滤面积为0.66m²，过滤压力≤0.1mpa。

作为对除菌过滤步骤的一种改进，步骤(2d)中，除菌滤芯为折叠式一次性除菌滤芯，材质为聚偏二氟乙烯(PVDF)，过滤面积为0.08m²，过滤压力≤0.05mpa。

其中，滤芯材质、过滤面积和过滤压力也是决定过滤效果的重要因素。申请人经过大量实验，选择了聚醚砜(PES)和聚偏二氟乙烯(PVDF)材质的滤芯。其中，PES有独特的孔结构，及较好的耐温耐水解性能。PVDF为精过滤材料，有极佳的热稳定性和化学稳定性，能承受多次蒸汽灭菌，并可制成亲水性滤膜，可用于制药工业针剂用水和蒸馏水的过滤。

当颗粒含量一定时，过滤速度与过滤面积成正比。增大过滤面积，过滤速度就会增大。同时过滤速度又与过滤压力有关。在上述过滤面积和过滤压力下，能够最好地实现过滤效率和过滤质量的平衡。

作为对除菌过滤步骤的一种改进，步骤(2a)-(2d)中控制过滤前后的溶液温度为26-30℃。优选当溶解完成后，将溶液自然降温到常温，然后进行多次过滤，这样能够保证灌封之后溶液体积稳定，不会因过滤温度和储存温度差别过大造成体积急剧变化，同时硫酸鱼精蛋白不会因为温度骤降而析出。该温度下能够保证蛋白的稳定性，如果温度过低，蛋白容易析出，如果温度过高，蛋白容易变性，影响产物药效。

作为对除菌过滤步骤的一种改进，步骤(2c)结束后，对第三过滤液进行检验，如性状、pH值、细菌内毒素和渗透压摩尔浓度均合格，进行步骤(2d)，否则将第三过滤液弃用。

进一步地，合格标准为：pH值为2.5-3.5，性状为无色透明液体，细菌内毒素为：每1mg硫酸鱼精蛋白中含内毒素的量小于6.0EU，渗透压摩尔浓度为270-320mOsmol/kg。

除菌过滤完成后进行灌封，优选灌封前后均进行充氮气处理，氮气浓度为99.999％，保证封口后产品内气体含氧量＜3％。

因产品为蛋白类物质不耐热，储存条件为在凉暗处(避光并不超过20℃)保存。若温度过高，则蛋白变质分解，影响生物活性。若温度过低＜0℃，也会破坏蛋白质结构。

通过上述方法制备得到的硫酸鱼精蛋白注射液，其应符合2015版药典规定的质量标准。

具体地，该硫酸鱼精蛋白注射液的pH值为2.5-3.5；性状为无色透明液体；渗透压摩尔浓度为270-320mOsmol/kg；细菌内毒素为：每1mg硫酸鱼精蛋白中含内毒素的量小于6.0EU；不溶性微粒含量为：每30ml注射液中含10μm及10μm以上的微粒数≤6000粒，含25μm及25μm以上的微粒数≤600粒；效价为：按每1mg硫酸鱼精蛋白中和肝素100单位计算，其效价为标示量的90％-115％；浓度为5-15g/L，优选为10g/L；规格为每5ml注射液含50mg硫酸鱼精蛋白，可直接用于临床。

由于硫酸鱼精蛋白具有强碱性基团，在体内可与强酸性的肝素结合，形成稳定的复合物，从而使肝素失去抗凝能力。因此该注射液为抗肝素药，用于因注射肝素过量所引起的出血。

实施例

下述实施例中采用的硫酸鱼精蛋白提取物均由北京斯利安药业有限公司提供，其型号(批号)为YY150701，效价为146单位。

实施例1

(1)将硫酸鱼精蛋白提取物加入到注射用水中，将水温控制在40±2℃，搅拌使其完全溶解，得到浓度为20g/L的溶液，加入硫酸或醋酸，调节溶液pH值为2.5-3.5。向溶液中补充注射用水，至浓度为10g/L，即成品浓度。

(2)对步骤(1)得到的溶液进行除菌过滤，包括步骤(2a)-(2d)：

(2a)第一次除菌过滤：采用杭州科百特过滤器材有限公司生产的长度为10英寸的折叠式除菌滤芯，其孔径为0.22μm，材质为聚醚砜(PES)，过滤面积为0.6m²，过滤压力≤0.2mpa，对步骤(1)得到的溶液进行除菌过滤。过滤前后的溶液和滤液温度为26-30℃，当待过滤溶液与柱体积之比为280:1时，得到的滤液直接进行下一次过滤。

(2b)第二次除菌过滤：采用杭州科百特过滤器材有限公司生产的长度为10英寸的折叠式除菌滤芯，其孔径为0.22μm，材质为聚醚砜(PES)，过滤面积为0.6m²，过滤压力≤0.2mpa，对步骤(2a)得到的滤液进行除菌过滤。过滤前后的滤液温度为26-30℃，当待过滤溶液与柱体积之比为280:1时，得到的滤液直接进行下一次过滤。

(2c)第三次除菌过滤：采用PALL过滤器材有限公司生产，型号为AB1DFL7P，长度为10英寸的折叠式除菌滤芯，其孔径为0.2μm，材质为聚偏二氟乙烯(PVDF)，过滤面积为0.66m²，过滤压力≤0.1mpa，对步骤(2c)得到的滤液进行除菌过滤。过滤前后的滤液温度为26-30℃，当待过滤溶液与柱体积之比为255:1时，得到的滤液直接进行下一次过滤。

在第三次除菌过滤结束后，取得到的滤液进行检验，如性状、pH值、细菌内毒素和渗透压摩尔浓度均合格，进行步骤(2d)，否则将第三过滤液弃用。该检验标准编号为QZB-Z-015-06，标准操作规程编号为SOP-02-04-199-07。标准依据为硫酸鱼精蛋白注射液成品质量标准，如下：

pH值为2.5-3.5，性状为无色透明液体，细菌内毒素为：每1mg硫酸鱼精蛋白中含内毒素的量小于6.0EU，渗透压摩尔浓度为270-320mOsmol/kg。

(2d)第四次除菌过滤：采用PALL过滤器材有限公司生产，型号为KA2DFLP1的折叠式一次性除菌滤芯，其孔径为0.2μm，材质为聚偏二氟乙烯(PVDF)，过滤面积为0.08m²，过滤压力≤0.05mpa，对步骤(2c)得到的滤液进行除菌过滤。过滤前后的滤液温度为26-30℃，当待过滤溶液与柱体积之比为2100:1时，得到的滤液直接进行灌封，得到硫酸鱼精蛋白注射液。

灌封前后均进行充氮气处理，氮气浓度为99.999％，保证封口后成品内气体含氧量＜3％。

在上述制备硫酸鱼精蛋白注射液的过程中，溶解温度、过滤温度、过滤面积和过滤压力见表1。

表1

对比例1

按照实施例1中注射液P1的制备方法制备硫酸鱼精蛋白注射液，其中，改变步骤(1)中的溶解温度，如表2中所示。

表2

对比例2

按照实施例1中注射液P1的制备方法制备硫酸鱼精蛋白注射液，其中，改变步骤(2a)-(2d)中的过滤温度，如表3中所示。

表3

对比例3

按照实施例1中注射液P1的制备方法制备硫酸鱼精蛋白注射液，其中，改变步骤(2a)-(2d)中的过滤压力，如表4中所示。

表4

对比例4

按照实施例1中注射液P1的制备方法制备硫酸鱼精蛋白注射液，其中，变化的条件如表5中所示。

表5

按照2015年版《中国药典》第二部第1346页规定的方法，对实施例和对比例得到的硫酸鱼精蛋白注射液进行检测，结果如表6所示：

表6

其中：

*“-”表示无法进行测试或没有检测结果。

*细菌内毒素的含义为每1mg硫酸鱼精蛋白中含内毒素的量。

*不溶性微粒的含义为每30ml硫酸鱼精蛋白注射液中含10μm及10μm以上的微粒数，以及含25μm及25μm以上的微粒数。

*效价的含义为：(1mg硫酸鱼精蛋白中和肝素的单位数/标示量)×100％。其中，标示量为每1mg硫酸鱼精蛋白中和肝素100单位。合格标准为效价为标示量的90％-115％。

由于pH值是在硫酸鱼精蛋白溶解后进行调节，渗透压摩尔浓度是由溶解过程中加入氯化钠的量决定，过滤参数的变化对这两项影响不大。从表3的检测结果可知，实施例1对应按照本申请的方法制备得到的硫酸鱼精蛋白注射液，其pH值为2.5-3.5，性状为无色透明液体，细菌内毒素为：每1mg硫酸鱼精蛋白中含内毒素的量小于6.0EU，渗透压摩尔浓度为270～320mOsmol/kg。浓度为10g/L。规格为每5ml注射液含50mg硫酸鱼精蛋白。按每1mg硫酸鱼精蛋白中和肝素100单位计算，其效价为标示量的90％-115％。完全满足使用要求。

对比例1说明，当溶解步骤中的水温低于要求标准，则硫酸鱼精蛋白溶解不彻底，容易在溶解和除菌过滤步骤中团聚，被滤膜截留，影响产品效价。水温进一步降低后，硫酸鱼精蛋白团聚严重，无法进行溶解和后续操作。当溶解步骤中的水温升高后，虽然能加速硫酸鱼精蛋白的溶解过程，但温度过高会导致蛋白质变性，使最终产品的细菌内毒素和效价无法满足要求。

对比例2说明，当过滤步骤中的水温降低后，虽然对最终产品的性能影响不大，但在实际操作过程中，过滤时间延长了两倍以上，降低了生产效率。当过滤步骤中的某一步水温升高后，虽然能加速过滤速度，但粒子运动速度加快，导致产品中的不溶性微粒数量增加。当过滤步骤中的温度整体升高后，产品的不溶性微粒含量无法满足要求。

对比例3说明，当过滤步骤中的某一步压力升高后，虽然能加速过滤速度，但产品中的不溶性微粒数量增加，降低了过滤精度，同时伴随有滤膜穿孔破损的风险；当过滤步骤中的压力整体升高后，产品的不溶性微粒含量无法满足要求。可以推测当压力降低，对产品质量无明显影响，但会降低过滤速度，延长过滤时间。

对比例4说明，申请人经过多次试验，得到包括步骤(2a)-(2d)的除菌过滤步骤，如减少其中的任何一步，均影响最终得到满意的过滤效果。

本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。