长非编码RNA及在作为调控神经干细胞增殖和分化中的应用

摘要

本发明属生理和生物医学领域，涉及一种长非编码RNA及在作为调控神经干细胞增殖和分化中的应用；从技术层面上，本申请发现了调控神经干细胞发育的长非编码RNASox2ot，并首次确认了它在神经元生成中的促进作用。这些发现将有助于我们从体内水平直接改变长非编码RNASox2ot的表达，以影响神经干细胞发育；从临床角度上，通过探索非编码RNASox2ot在神经干细胞中的作用，有助于我们进一步开发检测影响大脑早期发育的基因的临床诊断试剂，以预防小脑症发生；进一步地，由于非编码RNA易于在体外合成和干预它的表达水平，我们可以直接利用非编码RNA调控神经干细胞的增殖和分化。这将为临床上开发应用神经干细胞治疗人类神经系统疾病，提供新的疗法和技术手段。

说明书

技术领域

本发明属生理和生物医学领域，涉及一种长非编码RNA及在作为调控神经干细胞 增殖和分化中的应用。

背景技术

人类和小鼠大脑皮层的正常发育，依赖于神经干细胞(neuralstemcell,NSC)和神 经祖细胞(neuralprogenitor)的精确增殖、分化，及神经元的生成。这个过程需要精确 的分子调控。神经干细胞的增殖、分化对大脑的正常发育至关重要，与大脑的功能戚戚 相关。遗传和环境因素可以引起基因突变，导致大脑发育畸形。例如，多小脑回症 (polymicrogyria)是由许多的小的脑回(gyri)引起的。患者一般有癫痫，智障和运动 障碍。和神经祖细胞分裂相关基因的突变，例如orphanGprotein-coupledreceptor56 (GPCR56)的突变，被证明和多小脑回症相关。又如，小脑症(microcephaly)的显著 特征是婴儿大脑尺寸明显减小。患者一般身材矮小，有智障和语言障碍。控制神经干细 胞、祖细胞扩增的基因发生突变是引起小脑症的主要原因。例如ASPM(abnormalspindle protein-like,microcephalyassociated)的突变已被检测出。由此可见，阐释神经干细胞、 祖细胞增殖、存活、分化的分子机制，将有助于揭示大脑皮层的正常发育机理，并探寻 大脑发育畸形的病因。

那么什么分子机制可能调控神经干细胞、祖细胞的增值和分化哪？长期以来，人们 的研究对象一直是蛋白质编码基因(proteincodinggenes)。近几年的最新研究成果显示， 非编码RNAs(noncodingRNAs)同样起着举足轻重的作用，尤其是长非编码RNA(long noncodingRNA,lncRNA)。长非编码RNA一般长度大于200个核苷酸，和蛋白编码基 因的表达没有明显区别，只是没有合成蛋白质的能力。目前的研究显示，长非编码RNA 可以在细胞核和细胞质中行使功能，在特异的细胞中表达，参与基因的转录调控。但人 们对长非编码RNA的作用机制，依然不清楚。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种长非编码RNA及在作为调控 神经干细胞增殖和分化中的应用。研究神经分化的分子机制，可以诱导神经干细胞定向 分化成特异性的神经元，用于治疗神经系统疾病。我们筛选了在小鼠胚胎神经干细胞中 表达的长非编码RNA：Sox2ot(Sox2overlappingtranscript)。我们首次发现Sox2ot促进 神经干细胞的分化，产生更多神经元。本申请发现，长非编码RNA对神经干细胞增值 和分化发挥重要作用。我们发现长非编码RNA在神经干细胞中表达。当过表达长非编 码RNA时，会引起神经干细胞、神经祖细胞增值减少，导致神经干细胞分化，产生更 多神经元。这些研究表明，和蛋白质编码基因一样，长非编码RNA在神经发生中起重 要作用，可以用于诱导神经分化。因此，Sox2ot可以作为诱导神经分化的新手段。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种长非编码RNASox2ot，其基因组序列如SEQIDNo.2所 示。

所述长非编码RNASox2ot在小鼠基因组中和SEQIDNo.1所示的Sox2基因序列重 叠：Sox2基因是在胚胎干细胞、神经干细胞中高表达的基因。Sox2能够促进干细胞增值， 保持干细胞处于分裂状态。有意义的是，长非编码RNASox2ot和Sox2在小鼠胚胎大脑皮 层表达较高(图1)。另外，长非编码RNASox2ot在基因组中和Sox2重叠，并按同一个方 向转录(图2)。这说明Sox2ot很可能调控Sox2的表达，并参与干细胞增值和分化的调控。

第二方面，本发明提供一种所述长非编码RNASox2ot在调控神经干细胞发育中的 应用。

第三方面，本发明提供一种用所述长非编码RNASox2ot调控神经干细胞发育的方 法，所述方法包括：原位杂交(insituhybridization)的方法用以验证Sox2ot在大脑皮层 中表达的部位及细胞。

为确定Sox2ot是否和Sox2一样也对神经干细胞发育起作用，我们采用原位杂交的方 法检测了Sox2ot和Sox2在小鼠胚胎13.5和15.5天大脑中的表达状态。我们发现Sox2表达 于神经干细胞集中的皮层脑室区(ventricularzone,VZ)(图3)。和Sox2相似，Sox2ot 也表达在皮层脑室区。我们的结果表明Sox2ot和Sox2可能有相近的功能，同样调控神经 干细胞发育。

第四方面，本发明提供一种所述长非编码RNASox2ot在诱导神经干细胞分化中的应 用。

第五方面，本发明提供一种用所述长非编码RNASox2ot诱导神经干细胞分化的方 法，所述方法包括：小鼠胚胎电转的方法。即在胚胎期小鼠的脑室内注射DNA，通过电 击的方法，使Sox2ot外源DNA表达在大脑皮层的神经干细胞中。

我们进一步探索了在大脑发育中Sox2ot的功能。通过小鼠胚胎电转的方法，我们在 胚胎13.5天大脑皮层中过表达Sox2ot，然后观察胚胎14.5天大脑皮层中神经干细胞的发 育。我们发现，当用BrdU标记处于分裂状态的神经干细胞、神经祖细胞时，在过表达 Sox2ot的小鼠大脑皮层中，BrdU阳性细胞数明显减少。进一步的，Sox2标记的神经干细 胞数，也因过表达Sox2ot而明显减少(图4)。我们的结果表明：和Sox2的作用相反，Sox2ot 的功能是促进神经干细胞分化。

第六方面，本发明提供一种所述长非编码RNASox2ot在促进神经元生成中的应用。

第七方面，本发明提供一种用所述长非编码RNASox2ot促进神经元生成的方法，所 述方法包括：小鼠胚胎电转的方法。即在胚胎期小鼠的脑室内注射DNA，通过电击的方 法，使Sox2ot外源DNA表达在大脑皮层的神经干细胞中。之后，让神经干细胞在体内继 续发育4天，标记神经元的生成。

通过小鼠胚胎电转的方法，我们在胚胎13.5天大脑皮层中过表达Sox2ot，然后检测 胚胎17.5天大脑皮层中神经元的生成(图5A)。我们发现，Tbr1和Satb2标记的新生神 经元数量均显著升高(图5)。我们的结果表明：Sox2ot的功能是促进神经元生成。

第八方面，本发明提供了一种所述长非编码RNASox2ot在开发检测影响大脑早期 发育基因的临床诊断试剂以预防小脑症发生中的应用。

本专利将对基础研究和进一步的临床应用具有现实意义。人类小脑症的病因是由于 大脑神经干细胞、神经祖细胞数目的减少，新生神经元生成的降低。诱导神经干细胞扩 增，促进神经元生成将是治疗小脑症的有效手段。与现有技术相比，本发明具有如下的 有益效果：

从技术层面上，本申请发现了调控神经干细胞发育的长非编码RNASox2ot，并首次 确认了它在神经元生成中的促进作用。这些发现将有助于我们从体内水平直接改变长非 编码RNASox2ot的表达，以影响神经干细胞发育。从临床角度上，通过探索非编码 RNASox2ot在神经干细胞中的作用，有助于我们进一步开发检测影响大脑早期发育的基 因的临床诊断试剂，以预防小脑症发生。进一步地，由于非编码RNA易于在体外合成 和干预它的表达水平，我们可以直接利用非编码RNA调控神经干细胞的增殖和分化。 这将为临床上开发应用神经干细胞治疗人类神经系统疾病，提供新的疗法和技术手段。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特 征、目的和优点将会变得更明显：

图1、Sox2和长非编码RNASox2ot在胚胎期小鼠大脑皮层中表达量较高。

图2、长非编码RNASox2ot在小鼠基因组中和Sox2重叠，并转录方向一致；

图3、原位杂交结果显示，Sox2和Sox2ot表达在小鼠胚胎13.5和15.5天大脑皮层 脑室区，神经干细胞集中的区域；

图4、在小鼠大脑皮层中过表达Sox2ot(Sox2ot-OE)，诱导神经干细胞分化，引起 BrdU和Sox2标记的细胞数减少；

图5、在小鼠大脑皮层中过表达Sox2ot(Sox2ot-OE)，引起Tbr1和Satb2标记的细 胞数升高，诱导神经元生成。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人 员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于 本发明的保护范围。

实施例1

本申请所述长非编码RNASox2ot在小鼠基因组中和SEQIDNo.1所示的Sox2基因序 列重叠：首先，我们通过解剖，收集了BL6小鼠胚胎期12.5天、15.5天，和出生后0天及 成年的大脑皮层组织[1]。利用Trizol我们提取了RNA，进行了RNA反转录PCR分析 (RT-PCR)[1]。我们设计了扩增Sox2ot和Sox2基因的PCR引物。它们的序列如下：

Sox2ot：F:5’-TGCTACAAGACAACACCCTGA-3’(SEQIDNo.3)，

R:5’-GTTGCCTGGCTTCTCTTTTG-3’(SEQIDNo.4)；

Sox2：F:5’-TACAGCATGTCCTACTCGCA-3’(SEQIDNo.5)，

R:5’-TGGAGTGGGAGGAAGAGGTA-3’(SEQIDNo.6)。

通过RNA反转录PCR分析比对Sox2ot和Sox2在不同发育时期的表达水平，我们检测 到转录因子Sox2和非编码RNASox2ot在小鼠胚胎期12.5天和15.5的大脑皮层组织中呈现 较高表达(图1)。这两个基因在胚胎期的较高表达说明它们可能调控神经干细胞和神经 祖细胞的发育。

进一步通过基因注释和基因序列的比对[2]，我们发现长非编码RNASox2ot和转录因 子Sox2位于小鼠基因组第3号染色体上。Sox2ot基因由5个外显子组成，转录产物约 3000bp。Sox2基因由一个外显子组成，转录产物约2500bp。Sox2基因在基因组中位于 Sox2ot的内含子中，和Sox2ot重叠，并按同一个方向转录(图2)。由于Sox2基因在胚胎 干细胞、神经干细胞中高表达，并能够促进干细胞增值，这说明Sox2ot很可能调控Sox2 的表达，也参与在干细胞增值和分化的调控过程中。

实施例2

我们发现Sox2ot在小鼠胚胎神经干细胞中表达：为确定Sox2ot是否和Sox2一样也 对神经干细胞发育起作用，我们采用原位杂交(insituhybridization)的方法检测了Sox2ot 和Sox2在小鼠胚胎13.5和15.5天大脑中的表达状态[3]。通过RNA体外合成的方式， 我们分别合成了DIG-标记的Sox2ot和Sox2的探针(probe)(图2)[2]。

Sox2ot探针的序列如下：

5’cagcaaatggaaaatgaggtctttcttagttgcacaagagatgtctgaactctcagaccaaagccatcaaccagattctcttaa gcggatcttgaggaaagtacaatttctaggttcgatctcggagttgagagctttcttctgtaatatgtctgttgcctggcttctcttttgcgtgt accagctgcagagattttccgatttgggactacaggcttggacccgcggcgaccatgccagatcagggtgttgtcttgtagcagtttgatt ggcaggtaaaaagcactgaacgtgaaggctccggagcctctcgtcagcccaagctggatcactcctcaccggacagaacgagttga aggagctcgcacttcccccctctttctccatccaaagcacggagaatccatttaggcttttcttcgaccagtctctcccatcagcgtcctgc cttccgcgcaccaccttacaccagcctccaagacctagtctagctttgcctctgcaatccctggaatagaaagaggctttcactcatccca tggatggccactgttctggagaaatctgtcaggtttgcttctcggtactgcccagagctcttgggggtgaggcctgtcccagcagacaag tcctgggaccttccccatcagaggatcaaggttgggtgcgagggtgtggccgtgcacctgaggacaggagccagctaagtgtggaca gagagagccagcaggagagtgtcccctgccacagtcagccctgagcagg-3’(SEQIDNo.7)

Sox2探针的序列如下：

5’-gagcccagcgccataccgggggtgccctgctgcgagtaggacatgctgtaggtgggcgagccgttcatgtaggtctgcg agctggtcatggagttgtactgcagggcgctgacgtcgtagcggtgcatcggttgcatctgtgccgcgccgtgagcgttgaggcccgg gtgctgcgggtagcccagctgctcctgcatcatgctgtagctgccgttgctccagccgttcatgtgcgcgtagctgtccatgcgctggtt cacgcccgcacccaggccggcgcccaccccaaccccgctcgccatgctgttcccgccgggggccagcaagcctccgggaagcgt gtacttatccttcttcatgagcgtcttggttttccgccgcggccggtatttataatccgggtgctccttcatgtgcagagcgcgcagccgctt ggcctcgtcgatgaacggccgcttctcggtctcggacaaaagtttccactccgcgcccaggcgcttgctgatctccgagttgtgcatctt ggggttctcctgggccatcttacgccgctgcccccgggaccataccatgaaggcgttcatgggcctcttgacgcggtccgggctgttct tctggttgccgccggtcgccgccgccgtggcgttgcctcctccgccgccgccccccgaagcttgctgcgggcccggcggcttcagct ccgtctccatcatgttatacatgcgggcgctgggcgcgggcgcggcccgccggcggccgccaaccctcggcccggccgggactgt gggggccgcgctcgggggccgggatgcaggggccgcgggcgggggcctcggcgtgcacggccctgcgcggagatctggcgga gaatagttggggggaagcggagctcgagacgggcgaagtgcaattgggatgaaaaaacaggcgctctcctcctcgggccgccgcg attgttgtgattagtttttggaaaggcttaagcctcgggctccaaacttctc-3’(SEQIDNo.8)

我们之后收集了小鼠胚胎13.5和15.5天大脑的冠状切片。Sox2ot和Sox2的探针于 65℃在切片上杂交后，通过BM-Purple显色可以检测到Sox2ot和Sox2的表达。我们发 现Sox2表达于神经干细胞集中的皮层脑室区(ventricularzone,VZ)(图3)。和Sox2相 似，Sox2ot也表达在皮层脑室区。皮层脑室区是大脑中神经干细胞集中的区域。我们的 结果表明Sox2ot和Sox2可能有相近的功能，同样调控神经干细胞发育。

实施例3

我们首次发现Sox2ot诱导神经干细胞分化：为探索Sox2ot在大脑发育中的功能，我 们通过小鼠胚胎电转的方法，在胚胎13.5天大脑皮层中过表达Sox2ot，然后观察胚胎14.5 天大脑皮层中神经干细胞的发育。具体方法如下：

我们将Sox2ot的全长cDNA片段(SEQIDNo.2所示)通过XhoI和NotI两个酶切位点 的连接克隆在了pCAGIG载体上[4]。pCAGIG载体含有actin启动子和巨细胞病毒启动子 (CMV)，因此具有较高的表达活性[4]。此质粒同时装载绿色荧光蛋白基因(eGFP)，作 为标记以示踪电转后的细胞[4]。作为对照，我们也电转了不含Sox2ot的pCAGIG空载体 质粒。

怀孕期13.5天的母鼠麻醉后，将子宫暴露出。通过显微注射，Sox2otDNA通过子宫 膜注射进入胚胎小鼠的脑室区。之后用镊子状电极给胚胎小鼠大脑轻微电击[2]。具体电 击条件是：在35V电压下，给以5次电击，每次间隔50毫秒(ms)。由于DNA带负电， 会向正电极方向转入。于是正电极方向的大脑皮层就被转入了Sox2otDNA。

电转一天后，我们收集了胚胎大脑，在取脑前一小时，小鼠接受BrdU注射，以标记 有丝分裂S-期细胞。之后小鼠大脑用4％的甲醛固定。通过冰冻切片机切片，我们收集了 电转后的脑片，并通过抗体标记检测了Sox2ot对神经干细胞发育的影响。当用BrdU抗体 标记处于分裂状态的神经干细胞、神经祖细胞时，我们计数了“GFP+/BrdU+”细胞数 与GFP+细胞数的比值。我们发现，在过表达Sox2ot的小鼠大脑皮层中，BrdU阳性细胞 数明显减少(图4)。进一步的，对于Sox2抗体标记的神经干细胞数，我们计数了 “GFP+/Sox2+”细胞数与GFP+细胞数的比值。我们发现，也因过表达Sox2ot，Sox2阳 性细胞数明显减少(图4)。我们的结果表明：和Sox2的作用相反，Sox2ot的功能是促进 神经干细胞分化。

实施例4

我们发现Sox2ot促进神经元生成：为探索Sox2ot在大脑发育中的功能，我们通过小 鼠胚胎电转的方法，在胚胎13.5天大脑皮层中过表达Sox2ot，然后观察胚胎17.5天大脑皮 层中神经元的生成。具体方法如下：

我们将Sox2ot的全长cDNA片段(SEQIDNo.2所示)通过XhoI和NotI两个酶切位点 的连接克隆在了pCAGIG载体上。作为对照，我们也电转了不含Sox2ot的pCAGIG空载体 质粒。怀孕期13.5天的母鼠麻醉后，将子宫暴露出。通过显微注射，Sox2otDNA通过子 宫膜注射进入胚胎小鼠的脑室区。之后用镊子状电极给胚胎小鼠大脑轻微电击[2]。具体 电击条件是：在35V电压下，给以5次电击，每次间隔50毫秒(ms)。由于DNA带负电， 会向正电极方向转入。于是正电极方向的大脑皮层就被转入了Sox2otDNA。电转后将子 宫放回母体，让胚胎得以继续发育。

电转四天后(胚胎期17.5天)，我们收集了胚胎大脑。因为这个时期是神经发生的 阶段，我们可以检测到Sox2ot对神经元生成的影响。用4％的甲醛固定大脑后，通过冰冻 切片机切片，我们收集了电转后的脑片，并通过抗体标记检测了Sox2ot对神经元生成的 影响(图5A)。Tbr1和Satb2抗体分别标记大脑皮层深层和上层的神经元。我们计数了 “GFP+/Tbr1+”及“GFP+/Satb2+”细胞数与GFP+细胞数的比值，这个比值的大小反映 了神经元生成数目的多少(图5B、C、D、E)。我们发现，Tbr1和Satb2标记的新生神 经元数量均显著升高(图4)。我们的结果表明：Sox2ot的功能是促进神经元生成。

本发明所涉生物学操作技术参考如下现有技术，参照部分已在实施例中标出：

1.PollockA,BianS,ZhangC,ChenZ,SunT:Growthofthedevelopingcerebralcortex iscontrolledbymicroRNA-7throughthep53pathway.CellRep2014, 7(4):1184-1196.

2.BianS,HongJ,LiQ,SchebelleL,PollockA,KnaussJL,GargV,SunT:MicroRNA ClustermiR-17-92RegulatesNeuralStemCellExpansionandTransitionto IntermediateProgenitorsintheDevelopingMouseNeocortex.CellRep2013, 3(5):1398-1406.

3.HuangZ,Kawase-KogaY,ZhangS,VisvaderJ,TothM,WalshCA,SunT: TranscriptionfactorLmo4definestheshapeoffunctionalareasindevelopingcortices andregulatessensorimotorcontrol.DevBiol2009,327(1):132-142.

4.MatsudaT,CepkoCL:ElectroporationandRNAinterferenceintherodentretinain vivoandinvitro.ProcNatlAcadSciUSA2004,101(1):16-22.

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上 述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改， 这并不影响本发明的实质内容。