一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株及其在花生黄曲霉毒素污染生物防治中的应用

摘要

本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株及其在花生黄曲霉毒素污染生物防治中的应用。所述不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株命名为黄曲霉菌NAFFHN396，已于2015年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No:10927。本发明获得一株黄曲霉毒素合成簇基因缺失的不产毒黄曲霉菌株，该菌株对强产毒黄曲霉菌株的毒素产量具有显著的抑制作用，为今后不产毒黄曲霉菌在田间的生物防治提供了生防菌来源，该菌分离自我国，在花生上具有较好的定殖能力，具有潜在的田间竞争优势，对抑制产毒黄曲霉菌侵染花生，降低花生中的黄曲霉毒素污染具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株及其在花生 黄曲霉毒素污染生物防治中的应用。

背景技术

黄曲霉毒素是危害我国食品安全的一种很重要的真菌毒素。在自然界中，一些农作物， 包括玉米和花生容易受黄曲霉菌侵染，导致籽粒遭受黄曲霉毒素的污染；其他植物，如坚果 类也容易受到黄曲霉毒素的污染。黄曲霉毒素的毒性很强，是目前已知的毒性最强的致癌性 真菌毒素，其对人和动物的肝脏和中枢神经系统具有极强的毒害，长期小剂量摄入可导致胚 胎畸形变异、基因和染色体变异、诱发原发性肝癌、胃癌等癌症，而一次性大量摄入可引起 急性中毒甚至死亡。

花生地上开花地下结果，这一生物学特性使荚果在花生生长期间易受到土壤中黄曲霉菌 的侵染而发生收获前黄曲霉毒素污染，尤其是破损的荚果更易被黄曲霉菌感染。防控花生黄 曲霉毒素污染的技术措施包括利用抗黄曲霉或抗旱的花生品种、改进栽培措施、控制收获及 贮藏过程的环境条件，但迄今国内外可用的高产优质的抗黄曲霉花生品种极少，栽培防控的 效果常因环境因素影响而降低，采用物理和化学方法对受污染的产品进行脱毒，不仅成本高 而且效果也不理想。利用生物防治技术是消除或减少毒素污染、保障花生食用安全性的重要 技术途径之一。

目前，黄曲霉毒素污染的生物防治技术最成功的手段是利用不产毒的黄曲霉菌株。20世 纪90年代以来，不产毒黄曲霉菌在花生、玉米和棉花等作物黄曲霉毒素污染防控中得到一 定的应用，在玉米田和花生田施用可使玉米、花生黄曲霉毒素减少74.3％-99％。田间施用不 产毒菌株不仅可降低收获前毒素污染，还可降低收获后储藏期间的毒素污染。世界上利用不 产毒黄曲霉生防最成功的国家是美国，在澳大利亚也得到了一定的应用。但总体上看，花生 黄曲霉毒素污染的生物防治由于多种因素的限制，生产应用仍然十分有限，而在我国几乎还 是一项空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株。

本发明的另一个目的在于提供一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株在花生黄曲霉毒素污染 生物防治中的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，该菌株命名为黄曲霉菌NAFFHN396， 已于2015年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为CGMCCNo:10927。

上述黄曲霉菌NAFFHN396的菌落形态为：30℃黑暗培养7d后，在CYA培养基上，黄曲 霉菌NAFFHN396为直径6.5cm的菌落，菌丝淡褐色，分生孢子黄褐色，菌落表面粉状；在AFPA 固体培养基上，菌落背面为亮橘色。

利用黄曲霉特异钙条蛋白基因设计的引物(CaMF和CaMR)扩增黄曲霉菌NAFFHN396 的DNA，并进行序列分析，分析结果显示，特异钙条蛋白基因序列长度为750bp，采用BLAST 分析法将序列与GenBank数据库进行比对分析，发现该菌株与黄曲霉菌的亲缘关系最接近， 同源性高达99％以上。利用甲醇法提取接种了黄曲霉菌NAFFHN396培养7天的CYA固体 培养基，利用高效液相色谱(HPLC)对提取液进行测定，测试结果显示：黄曲霉菌NAFFHN396 不产黄曲霉毒素。

利用黄曲霉毒素合成簇及其上、下游共30个基因核苷酸序列设计的引物，对黄曲霉菌 NAFFHN396的DNA进行PCR扩增，PCR扩增结果见图3，图3的结果显示：该菌的黄曲 霉毒素合成簇缺失12个基因(第5～16个基因)，黄曲霉菌NAFFHN396不产毒的机理是因 为在DNA水平上，黄曲霉毒素合成簇缺失12个基因，导致黄曲霉毒素合成中断。

上述黄曲霉菌NAFFHN396在花生黄曲霉毒素污染生物防治中的应用。

本发明将不产毒的黄曲霉菌NAFFHN396与强产毒的黄曲霉菌AF2202以1：1比例混合 接种后分别在CYA固体培养基和花生仁上培养7天，结果显示：不产毒的黄曲霉菌 NAFFHN396在CYA上对产毒菌毒素产量的抑制率为94.1％，在花生仁上对产毒菌毒素产量 的抑制率达98％，显著降低强产毒的黄曲霉菌AF2202的黄曲霉毒素的产量。

本发明的有益效果如下：本发明获得一株黄曲霉毒素合成簇基因缺失的不产毒黄曲霉菌 株，该菌株对强产毒黄曲霉菌的毒素产量具有显著的抑制作用，为今后不产毒黄曲霉菌在田 间的生物防治提供了生防菌来源，该菌分离自我国，在花生上具有较好的定殖能力，具有潜 在的田间竞争优势，对抑制产毒黄曲霉菌侵染花生，降低花生中的黄曲霉毒素污染具有重要 意义。

附图说明

图1为黄曲霉菌NAFFHN396在CYA培养基上的菌落形态和分生孢子形态。

图2为黄曲霉菌NAFFHN396在AFPA培养基上的菌落背面的颜色。

图3为黄曲霉菌NAFFHN396和其他不产毒株系钙条蛋白的PCR扩增结果。

图4为黄曲霉菌NAFFHN396的系统发育树。

图5为黄曲霉菌NAFFHN396生长7d后的固体CYA培养基上毒素提取液的HPLC测定图谱。

图6为黄曲霉菌NAFFHN396中黄曲霉毒素合成簇上游基因及部分合成簇基因的扩增结 果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不 仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：菌株的分离、筛选和鉴定

(1)将花生籽仁利用70％乙醇表面消毒30s，随后利用1wt％NaClO浸泡籽仁2min， 无菌水洗涤3次，控干花生仁，将花生仁均匀排布于无菌的塑料培养皿中，10粒/皿，籽仁 间保持空隙，不紧挨；将装有籽仁的培养皿利用parafilm膜包好后，小心放置于底层添加水 分的整理箱中，盖好箱盖，30℃培养7d；

(2)利用灭菌的镊子蘸取少量籽仁上产生的黄绿色分生孢子，在含有0.1wt％的 Tween-20中充分悬浮并系列稀释后，取10^-4稀释度的分生孢子悬浮液涂布PDA平板，30℃ 培养2d，将生长的单菌落取少许转接到新鲜的CYA和AFPA固体培养基中心，培养基为自 然pH，30℃培养直至菌落长满平板，得到纯化的菌落，菌落的形态为：在CYA固体培养基 上培养7d后，NAFFHN396为直径6.5cm的菌落，菌丝淡褐色，分生孢子黄褐色，菌落表面 中心毛茸状，边缘粉状，菌落和分生孢子的形态见图1；在AFPA固体培养基上，菌落背面 为亮橘色，见图2。

(3)将步骤(2)得到的纯化的菌落接种到30mlPDA培养液中，30℃培养5d后，将 菌丝团取出，滤纸上控干水分，放入研钵中，倒入液氮充分研磨成粉末，利用CTAB法提取 菌丝DNA，利用分光光度计测定菌丝DNA的浓度，稀释浓度至20ng/μl；参照黄曲霉菌钙 调蛋白基因的核苷酸序列设计引物(CaMF，5’TTTTGCATCATGAGTTGGAC3’，CaMR，5’ GARTWCAAGGAGGCCTTCTC3’)对菌丝DNA提取液进行PCR扩增，20μl的体系中加入 10XTaqbuffer2μl、10pmol的CaMF和CaMR各1μl、菌丝DNA提取液2μl、1UTaqDNA polymerase1μl、2.5mMMgCl₂1μl、2mmol/LdNTPs1μl、补灭菌水至20μl；扩增条件为：扩 增条件为：94℃3min变性；94℃30s，51℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min延 伸。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，PCR扩增结果见图3，利用Takara琼脂糖凝胶试剂 盒回收目的片段，连接至载体pMD-18T上，转化感受态细胞DH5α，挑选阳性克隆进行序 列测定，序列测定结果显示：特异钙条蛋白基因序列总长为750bp，采用BLAST分析法将序 列与GenBank数据库进行比对分析，发现该菌株与黄曲霉菌的亲缘关系最接近，同源性高达 99％以上。采用MEGA程序对该菌进行了系统发育进化分析，并绘制系统发育树，如图4所 示。

将该菌株命名为黄曲霉菌NAFFHN396，已于2015年5月28日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保 藏号为CGMCCNo:10927。

(4)将黄曲霉菌NAFFHN396接种到新鲜的CYA固体培养基上，30℃培养7d后，利 用打孔器离中心1cm,2cm,3cm分别取菌丝块，置于离心管中，利用枪头捣碎菌丝块，加入1.5ml 的甲醇，超声波处理15min,12,000rpm/min离心5min，吸取上清，利用0.45μm的滤器进行过 滤后，将滤液收集于1.8ml的具盖测量瓶中，利用HPLC进行黄曲霉毒素的测定(利用C18 反向柱，流动相为45％甲醇/水，流速为0.7ml/min)，进样量为10μl，外标法定量(黄曲霉毒 素标准品B2的出峰时间为10.8min，B2的出峰时间为13.4min)，计算样品黄曲霉毒素的含 量，黄曲霉毒素的HPLC结果图谱见图5，从图5可以看出，黄曲霉菌NAFFHN396在10.8 和13.4min处都无峰值，表明该菌株不产黄曲霉毒素，黄曲霉毒素的含量为0ng/g。

(5)根据黄曲霉菌毒素合成簇及其上、下游共30个基因设计的特异引物(分别见表1)， 利用步骤(3)的方法对黄曲霉菌NAFFHN396DNA进行PCR扩增，部分基因的扩增结果见 图6，图6的结果说明了：该菌基因组上的黄曲霉毒素合成簇缺失12个基因(第5～16个基 因)。黄曲霉菌NAFFHN396不产毒的机理正是因为在DNA水平上，黄曲霉毒素合成簇缺 失12个基因，导致黄曲霉毒素合成中断。

表1特异引物序列

基因 上游引物 下游引物 C1 CGTTCCAGTAGTTCGTATCG CATCGTAAACGTTGACACAG C2 TCGCCTTGTTCTCGCTATAC ACACCTGATAGCGAGAGTTC C3 GCGATCTGTAACACTACACA GCCATACGATTCCCAAGTCT norB-cypA GTGCCCAGCATCTTGGTCCA AGGACTTGATGATTCCTCGTC aflT ATGACATGCTAATCGACGAG AGGCGCATGCTACGGATC pksA(pksL) ACTTTGAGGGCGTTCTGTGC CTTTCGGTGGTCGGTGATTC nor1 AGCACGATCAAGAGAGGCTC GATCTCAACTCCCCTGGTAG fasA(hexA) TCCTATCCAGTCCACCTCGTA CACATCTTTGTCTTGCCCGC fasB(hexB) ACAATCGAATGACAACACTGC CCACCGAATCCACTACCTACA aflR ATGGTCGTCCTTATCGTTCTC CCATGACAAAGACGGATCC aflJ CTTCAACAACGACCCAAGGTT AGATGAGATACACTGCCGCA adhA CCTCGTGGGAGAGCCAAATC GGAGCAAGAAGGTTACAGCG estA CGATGGGACTGACGGTGATT ACCACGCCGCTGACTTTAT norA GTGTTCGTGTGTCGCCCTTA GTCGGTGCTTCTCATCCTGA ver1 CATCGGTGCTGCCATCGC CCTCGTCTACCTGCTCATCG verA CCGCAACACCACAAGTAGCA AAACGCTCTCCAGGCACCTT avnA GCGATAGAACTGACAAAGGCA GAATGAGTCTCCAAAGGCGAG verB TTCAGTGACAAAGGTCTTCGC GGCAGCGTT ATTGAGCATCT avfA ATTCAAATCCTCGTTCGGTCG TAGCCCGTTGGTTGTGTTCC omtB ACAGACGATGTGGGCAAACG ACGCAGTCCTTGTTAGAGGTG omtA CAGGATATCATTGTGGACGG CTCCTCTACCAGTGGCTTCG ordA AAGGCAGCGGAATACAAGCG ACAAGGGCGTCAATAAAGGGT vbs AACGAGCAGCGTAAGGGTCT TCAGCCAGAGCATACACAGTG cypX GGAGCCTACCATTCGCAACA GGCTTTGACGAACAGATTCCG moxY TGCTACTGGAACGAAGACCG CGACGACAACCAAACGCAA ordB GCTGCTACTGGAATGAAGACC ATGCGACGACAACCAAACG hypA CGCAAGACGGCAGAGATACT GCTCCTTCAGTTCCACACCA nadA TGACGAGGCCTGCGAGCTGT AAGCCTCTTCAGAACGGTCA

hexA TGTCCTCACCTCTGGCGTAT AGACCAACCACTCTTATGGGC glcA AGACACAGTCATCGCCTGTT GGTGCGAATAGGTGCAGGTA sugR TCAGCTGAAGCGCTCGAGAG GTATTGCCGCACTATGTATG

实施例2：黄曲霉菌NAFFHN396在花生黄曲霉毒素污染生物防治中的应用

将不产毒的黄曲霉菌NAFFHN396和产毒的黄曲霉菌AF2202在PDA固体培养基上 30℃培养7d后，0.1wt％Tween-20水悬浮分生孢子，血球计数板统计分生孢子的数量，将不 产毒菌和产毒菌的浓度调节一致1*10⁴，比例为1:1，等量混合后接种在CYA固体培养基的 中央，或者是接种到表面消毒的花生籽仁表面，充分摇动籽仁，使分生孢子均匀黏附在籽仁 的表面，同时设立只接种AF2202的CYA固体培养基或者花生籽仁作为对照，30℃保湿培养 7d。采用实施例1步骤(4)所述方法提取CYA固体培养基上的黄曲霉毒素；花生籽仁中黄 曲霉毒素的提取方法为：在通风橱中对接种的花生籽仁表面喷洒酒精，随后在110℃烤箱中 烘烤1h，充分灭活籽仁中的黄曲霉菌，随后在通风橱中利用高速粉碎机磨碎样品，其后参照 国标NY/T1286-2007的方法提取花生籽仁中的黄曲霉毒素(50ml55％体积浓度的甲醇水溶 液，15ml100％的石油醚)，并浓缩，反向C18柱分离，柱后衍生，在激发波长365nm，荧光 波长440nm检测，外标法定量，计算样品黄曲霉毒素的含量，获得不产毒黄曲霉菌 NAFFHN396对产毒菌AF2202的毒素含量的抑制率。黄曲霉菌NAFFHN396在CYA上对产 毒菌毒素产量的抑制率为94.1％，在花生仁上对产毒菌毒素产量的抑制率达98％，可以显著 降低强产毒的黄曲霉菌AF2202的黄曲霉毒素的产量。黄曲霉菌NAFFHN396为今后黄曲霉 菌田间生物防治提供了生防菌的来源，该菌分离自我国，在花生上具有较好的定殖能力，具 有潜在的田间竞争优势，对抑制产毒黄曲霉侵染花生，降低花生中的黄曲霉毒素污染具有重 要意义。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所 属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。 这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于 本发明创造的保护范围之内。