一株产甘露醇的短乳杆菌菌株及其生产甘露醇的方法

摘要

本发明提供一株产甘露醇的短乳杆菌菌株Lactobacillus？brevis3-A20，菌种保藏号为CGMCC？NO.8581。其特点为可利用含葡萄糖、果糖、蔗糖、低聚果糖及果聚糖水解液中的一种或多种碳源，发酵生产甘露醇。同时，本发明提供一种利用该菌株发酵生产甘露醇的方法。在厌氧或微有氧条件下，pH在3.0-7.0，温度在25-40度范围内，发酵利用含葡萄糖、果糖、蔗糖及果聚糖中的一种或多种碳源，生产20-300g/L的甘露醇。

说明书

技术领域

本发明涉及到一株产甘露醇的短乳杆菌菌株Lactobacillus brevis3-A20及 其发酵生产甘露醇的方法，属食品生物技术领域。

背景技术

甘露醇是一种天然存在的六元糖醇，在食品、医药、化工和轻工等领域具有 广泛应用。目前，甘露醇主要由化学法或海带提取法生产。由于，现有的甘露醇 生产方法成本及耗能较高。近年来，具有高选择性、低耗能等优点的微生物发酵 生产甘露醇的方法广受关注（参考文献[1]Ghoreishi SM,Shahrestani RG. Innovative strategies for engineering mannitol production. Trends in Food Science&Technology,2009,20:263–270）。

自然界中许多微生物可以利用碳水化合物合成甘露醇，如球拟酵母菌属 （Torulopsis）、假丝酵母菌属（Candida）、接合酵母菌属（Zygosaccharomyces）、 亮白曲霉（Aspergillus candidus）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、斜 卧青霉（Penicillium decumbens）、粗糙青霉（Penicillium scabrosum）、黑曲 霉（Aspergills niger）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、布氏乳杆菌 （Lactobacillus buchneri），发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），旧金山 乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis），中间乳杆菌（Lactobacillus  intermedius），肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和假肠膜明串珠菌 （Leuconostoc pseudomesenteroides）等（参考文献[2]，Saha BC,Racine FM. Biotechnological production of mannitol and its applications.Applied  Microbiology and Biotechnology.2011,89(4):879-91.）。

目前，采用短乳杆菌Lactobacillus brevis发酵进行甘露醇的研究并不多见。 朱豫等发现一株短乳杆菌M-1具有利用菊芋糖化汁发酵生产甘露醇的能力（参考 文献[3]朱豫，曹海龙，岳敏，李曙光，白雪芳，赵小明，杜昱光，以菊芋为 原料发酵生产甘露醇的研究，西北农业学报，2009，第5期，137-141。）。岳敏等 利用大气压等离子体诱变育种技术获得了一株短乳杆菌菌株Lactobacillus  brevis3-A5，采用pH调控技术初步研究了该菌株的发酵工艺（参考文献[4]Yue  Min,Cao Hailong,Zhang Jianping,Li Shuguang,Meng Yanyu,Chen Wei,Huang  Lishuxin,Du Yuguang.Improvement of mannitol production by Lactobacillus  brevis mutant3-A5based on dual-stage pH control and fed-batch  fermentations,World Journal of Microbiology&Biotechnology,2013,Vol 29(10):1923-1930）。然而，该菌株在高浓度底物条件下（180g/L总糖浓度以上）， 菌体生长受到抑制，无法有效将全部或绝大部分果糖转化为甘露醇，造成大量糖 的剩余，无法满足工业放大的需求。因此，能够在高浓度底物下，高效的转化果 糖产生甘露醇的菌株是实现发酵法生产甘露醇的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一株产甘露醇的短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A20。 该菌株属于短乳杆菌属，于2013年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编 号：CGMCC8581。

本发明获得的菌株根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版所描述并根据16S rDNA 序列对比分析，确定该菌株属于短乳杆菌。短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A20 是短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A5经诱变并在高糖浓度培养基下驯化培养 获得。相对于Lactobacillus brevis3-A5，Lactobacillus brevis3-A20初始 总糖耐受范围由0-180g/L扩大到0-260g/L；在批次培养条件下，Lactobacillus  brevis3-A20甘露醇产量比Lactobacillus brevis3-A5甘露醇产量提高5%-50%。

本发明的另一目的是提供利用短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A20进行发 酵生产甘露醇的方法。步骤如下：短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A20在25-40 度，经MRS培养基活化后，按接种量1%-20%接种到发酵培养基中，在25-40度范 围内，在0-100rpm转速条件下，初始pH在4.0-7.0条件下，进行发酵，当发酵 进行到12-16h，将发酵液pH控制在4.0-5.0之间，直到发酵过程结束。

发酵培养基成分如下：葡萄糖与果糖总浓度为：100-260g/L，葡萄糖与果糖 的质量比例在1:2-1:3，玉米浆干粉浓度在10-50g/L，一水硫酸锰浓度在10-50mg/L。

本发明的有益效果是：

1）本发明所获得的菌株为短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A20，菌种保 藏号为：CGMCC8581。初始总糖耐受浓度最高可达260g/L，且在批次培养条件，高 糖底物浓度下（总糖浓度大于200g/L），Lactobacillus brevis3-A20甘露醇产 量比亲本菌株Lactobacillus brevis3-A5甘露醇产量提高10%-100%。

2）利用本发明所获得的菌株为短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A20在 温度为25-40度，初始pH在4.0-7.0，在转速条件为0-100rpm，且当发酵进行到 12-16h将发酵液pH控制在4.0-5.0之间的条件下，可利用浓度在0-260g/L的总 糖底物，并高效的进行甘露醇的生产，发酵液中甘露醇的浓度可达到100-260g/L， 发酵周期为2-4天，具有重要的工业应用价值。

附图说明

图1为高糖浓度下批次发酵产物生成及糖消耗曲线（葡萄糖与果糖的比例为 1:2.17）；

图2为高糖浓度下批次发酵产物生成及糖消耗曲线（葡萄糖与果糖的比例为 1:2.88）；

图3为1吨规模发酵罐中Lactobacillus brevis3-A20发酵产物生成及糖消 耗曲线。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明。下述实施例为说明性的，不是限定 性的，不能以下述实施例来限定本发明所保护的范围。

实施例1

发酵步骤如下：分别从MRS平板挑出短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A5 和Lactobacillus brevis3-A20各一单菌落，接入20mLMRS培养基中，30度培养 24h；将菌液按2%（v/v）接种量，接入300mL MRS培养基中，30度培养24h，作 为种子液。

以总糖浓度分别为180g/L和260g/L的葡萄糖与果糖的混合碳源（葡萄糖与 果糖的质量比例为1:2.17）作为发酵生产甘露醇的碳源，以浓度为42g/L的玉米 浆粉为氮源，一水硫酸锰浓度为0.04g/L，初始pH为5.5，温度为37度，搅拌速 度在100rpm条件下，加入10%（v/v）的种子液，进行发酵培养，当培养至16h， pH条件变换为4.5。用离子色谱法测定发酵上清液中葡萄糖、果糖及甘露醇的含 量。结果如表1所示，表明Lactobacillus brevis3-A20在高糖浓度下甘露醇生 产性能优于Lactobacillus brevis3-A5，在260g/L总糖浓度下发酵96h后， Lactobacillus brevis3-A20的甘露醇产量比Lactobacillus brevis3-A5的产 量高约80%。

Lactobacillus brevis3-A20与Lactobacillus brevis3-A5甘露醇生产特 性比较：

表1不同糖浓度下Lactobacillus brevis3-A20与Lactobacillus brevis 3-A5甘露醇生产特性

*菌体生长受到抑制，导致甘露醇生产能力显著收到影响。

实施例2

从MRS平板挑出一短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A20单菌落，接入 20mLMRS培养基中，30度培养24h；将菌液按2%（v/v）接种量，接入300mL MRS 培养基中，30度培养24h，作为种子液。

以总糖浓度为258g/L的葡萄糖与果糖的混合碳源（葡萄糖与果糖的质量比例 为1:2.17）作为发酵生产甘露醇的碳源，以浓度为42g/L的玉米浆粉为氮源，一 水硫酸锰浓度为0.04g/L，初始pH为5.5，温度为37度，搅拌速度在100rpm条 件下，加入10%（v/v）的种子液，进行发酵培养，当培养至16h，pH条件变换为 4.5。用离子色谱法测定发酵上清液中葡萄糖、果糖及甘露醇的含量。发酵过程中 葡萄糖、果糖及甘露醇浓度变化如图1所示。

结果表明，当发酵进行到60h，发酵液中甘露醇浓度达到最高，为168.82g/L。 容积生产强度达到2.81g/L/h。

实施例3

从MRS平板挑出一短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A20单菌落，接入 20mLMRS培养基中，30度培养24h；将菌液按2%（v/v）接种量，接入300mL MRS 培养基中，30度培养24h，作为种子液。

以总糖浓度为260g/L的葡萄糖与果糖的混合碳源（葡萄糖与果糖的质量比例 为1:2.88）作为发酵生产甘露醇的碳源，以浓度为42g/L的玉米浆粉为氮源，一 水硫酸锰浓度为0.04g/L，初始pH为5.5，温度为37度，搅拌速度在100rpm条 件下，加入10%（v/v）的种子液，进行发酵培养，当培养至16h，pH条件变换为 4.5。用离子色谱法测定发酵上清液中葡萄糖、果糖及甘露醇的含量。发酵过程中 葡萄糖、果糖及甘露醇浓度变化如图2所示。

结果表明，当发酵进行到96h，发酵液中甘露醇浓度达到最高，为172.74g/L。

实施例4

从MRS平板挑出一短乳杆菌Lactobacillus brevis3-A20单菌落，接入 30mLMRS培养基中，30度培养24h；将菌液按2%（v/v）接种量，接入1200mL MRS 培养基中，30度培养24h；将菌液按5%（v/v）接种量，接入60L MRS培养基中。

在1吨发酵罐中，以总糖浓度为170g/L的葡萄糖与果糖的混合碳源（葡萄糖 与果糖的质量比例为1:2.88）作为发酵生产甘露醇的碳源，以浓度为42g/L的玉 米浆粉为氮源，一水硫酸锰浓度为0.04g/L，初始pH为5.5，温度为37度，搅拌 速度在60rpm条件下，加入10%（v/v）的种子液，进行发酵培养。用离子色谱法 测定发酵上清液中葡萄糖、果糖及甘露醇的含量。发酵过程中葡萄糖、果糖及甘 露醇浓度变化如图3所示。

结果表明，当发酵进行到40h，发酵液中甘露醇浓度达到最高，为108.86g/L， 容积生产强度达到2.72g/L/h。