一种检测阿萨希毛孢子菌的DNA探针、基因芯片及其应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了一种检测阿萨希毛孢子菌的DNA探针。本发明所述检测阿萨希毛孢子菌的DNA探针具有序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其检测阿萨希毛孢子菌特异性强，灵敏度高达0.04ng。本发明还提供包含所述DNA探针的基因芯片。采用本发明所述基因芯片可实现对可能含阿萨希毛孢子菌的样品的高通量、自动化及快速检测，特异性强，可保证检测结果的精确性，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测阿萨希毛孢子菌的DNA探针、基因芯片及其应用。

背景技术

侵袭性真菌感染是真菌入侵人体而导致血液感染、各个脏器感染或全身播散的严重感染。近20年来侵袭性真菌感染的发病呈明显增长趋势，这与大量应用广谱抗生素、抗癌放疗、化疗以及其他免疫抑制剂、类固醇药物、器官移植、静脉插管和各种侵袭性操作有关。

侵袭性真菌感染主要的致病真菌有念珠菌属、曲霉属、隐球菌属等条件致病真菌，还有组织胞浆菌、皮炎芽生菌、孢子丝菌等地方流行性致病真菌。不同环境下，感染的真菌种类不同。侵袭性真菌感染早期没有特异性表现，所以很容易被掩盖，病死率很高。

目前临床常用的检测真菌的技术主要有：

(一)镜检及培养、鉴定：如六胺银染色、PAS染色、银氨G-S染色法、10％KOH法以及真菌培养法是临床最常用的鉴定手段，但直接镜检特异性差、敏感性不足，不能鉴定出真菌种类。真菌培养虽能鉴定真菌种类，但培养条件苛刻，培养时间长，假阴性高，敏感性不足，无法辅助临床治疗。

(二)免疫学方法：免疫学方法的基本原理是利用抗原与抗体的特异结合，来达到相互间的特异探察。该法主要用于检测真菌的抗原、抗体、代谢产物及细胞成分。能根据真菌抗原性的不同将真菌分类。但抗体的特异性限制了该项技术的发展。

免疫组化、酶联免疫吸附试验、免疫印迹法及凝集反应都是基于免疫学方法检测真菌的手段，但目前广泛应用于临床的仅有G试验，G试验检测的是真菌的细胞壁成分：(1，3)-β-D-葡聚糖，人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使血液及体液中含量增高(浅部真菌感染无类似现象)。适用于除隐球菌和接合菌外的所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种。临床应用中发现有诸多假阳性可能，例如：

(1)使用纤维素膜进行血透标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料；

(2)静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；

(3)链球菌血症；

(4)操作者处理标本时存在污染。

另外，使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性。

(三)分子生物学技术：

包括原位杂交、聚合酶链反应、DNA中G+C mol％含量测定、随机扩增多态性DNA(RAPD)分析、限制性内切酶多态性分析(RFLP)等，但上述技术均耗时耗力，不具有高通量的特点，不能用少量的样本快速同时检测多种可能存在的真菌，因此多局限于实验室研究，尚不能真正应用于临床。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测阿萨希毛孢子菌的DNA探针，具有SEQ ID No.1所示序列，其与阿萨希毛孢子菌DNA特异性结合，检测阿萨希毛孢子菌灵敏度高。

本发明所述DNA探针可广泛应用于生物学、医学领域，如与以PCR技术为基础的核酸杂交技术结合，进行生物学分析或临床诊断。

本发明结合基因芯片技术，可实现小样本、高通量、特异、快速、自动化检测阿萨希毛孢子菌的目的。本发明提供的一种用于真菌检测的基因芯片，通过将特异性寡核苷酸探针固定在固相载体表面形成，所述寡核苷酸探针包含具有SEQ ID No.1所示序列的DNA探针。探针、引物与真菌目的基因之间的关系如表1所示。

表1.本发明所述基因芯片所使用的引物及探针

作为优选，所述固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。

本发明的基因芯片所采用的固相载体选自任何可用于制备基因芯片的材料，包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚丙乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。所述的固相载体经不同的化学修饰后，在其表面带有可以固定核酸分子的活性基团，这些基团包括但不限于氨基(-NH2)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巯基(-SH)。

本发明所述基因芯片在所述固相载体上连接针对阿萨希毛孢子菌的特异性核酸探针，所述探针可以为单链或双链DNA分子，其在适当的条件下可以与阿萨希毛孢子菌基因特异性杂交。所述探针可以通过DNA自动合成或PCR扩增而获得。所述探针在其与载体连接的一端可以选择性地添加一个目的在于增加探针的空间活动性以利于杂交的连接臂。

本发明所述基因芯片的制备，是将所述核酸探针有序地点样到载体上，通过核酸探针末端修饰的活性基团与载体表面相应的活性基团反应，形成共价连接，将探针固定于载体上，从而制成基因芯片。同时，在本发明所述基因芯片上，按序与不同样品杂交后，通过对所捕获阳性信号的寻址即可明确对应的样品中是否有阿萨希毛孢子菌的存在。

作为优选，所述固相载体表面还固定有阳性对照探针、阴性对照探针。

更优选地，所述阳性对照探针其序列如SEQ ID No.4所示，其与阳性对照样品特异性结合，阳性对照样品片段序列如SEQ ID No.6所示，其中与阳性对照探针结合部位的序列为CCCATGGGTCTTGTCTGGA。

更优选地，所述阴性对照探针，其序列如SEQ ID No.5所示。

本发明还提供一种用于检测阿萨希毛孢子菌的试剂盒，包含：与阿萨希毛孢子菌特异性结合的探针，所述探针具有序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中。本发明所述试剂盒优选还包含用于对真菌基因扩增的引物，其具有序列表SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的序列。

本发明还提供一种对可能含阿萨希毛孢子菌的样品进行检测的方法，包含以下步骤：

步骤1：提取并扩增样品的核酸序列，所述扩增将信标分子标记到扩增产物；

步骤2：取步骤1所得扩增产物与固定于所述基因芯片上的探针进行杂交；

步骤3：根据所述信标分子采用相应的检测方法对基因芯片进行扫描分析。

作为优选，步骤1扩增步骤所用的5’引物为真菌18SrRNA通用引物，具有序列表SEQ ID No.2所示序列，3’引物为真菌28SrRNA通用引物，具有SEQ ID No.3所示的序列。

在所述的样品标记过程中，可以利用本领域已知各种核酸标记方法使标本中的目的基因标记信标分子，所述方法包括但不限于，PCR、RT-PCR、体外转录、随机引物标记、缺口平移以及末端转移标记等方法。所述信标分子可以为荧光素或同位素；所述荧光素包括但不限于，Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素、德克萨斯红；所述同位素包括但不限于32P。

在适当的温度和离子强度条件下，将所述标记产物与本发明所述基因芯片进行杂交。杂交条件和方法是本领域已知的。杂交后，根据所选用的信标分子采用相应的检测方法对基因芯片进行扫描分析，根据所捕获的阳性信号寻址，判断所述标本中是否含有阿萨希毛孢子菌。

本发明采用阿萨希毛孢子菌特异性寡核苷酸作为探针，在真菌检测过程中利用真菌通用引物对样品中真菌基因扩增进行标记。本发明所述基因芯片连接的探针和扩增所用的真菌通用引物列于表1中。需要说明的是，本发明所采用的寡核苷酸探针和真菌通用引物也可以用于对目的基因的普通PCR扩增，而扩增的PCR产物同样可以作为探针按照所述方法制备真菌检测基因芯片，因此所述PCR产物作为探针所制备的基因芯片也在本发明的保护范围之内。

分子生物学技术应用于真菌研究已显示出多方面的优点，医学真菌研究已逐渐形成了以基因分析为基础的鉴定和分类系统。我们基于分子生物学技术，利用芯片的高通量平台，设计完善了基于基因芯片特异性诊断阿萨希毛孢子菌感染的技术。

本发明所述DNA探针特异性强，灵敏度高，样品中含有2-3CFU以上阿萨希毛孢子菌经检测即可见阳性信号，阿萨希毛孢子菌PCR产物达0.04ng以上即可被检测出来。

本发明所述基因芯片以及利用所述基因芯片进行样品检测的方法所需样本量少，反应体积小，试剂消耗少，可实现样品的高通量、自动化及快速检测，分析过程客观，特异性强，通过本方法检测出的结果与分离培养或测序比对结果的一致率达100％，保证了检测结果的精确性，适于应用于临床。

附图说明：

图1示本发明所述基因芯片与阿萨希毛孢子菌菌株杂交的检测结果；

图2示不同数量阿萨希毛孢子菌孢子提取的DNA与本发明所述基因芯片杂交的检测结果；

图3示不同剂量阿萨希毛孢子菌PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

具体实施方式：

本发明公开了一种检测阿萨希毛孢子菌的DNA探针、基因芯片及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1：DNA的提取

可按照本领域常规方法进行提取，样本可以为新鲜组织、血液、尿液、脑脊液、分泌物(痰液、胸水、腹水、肺泡灌洗液等)等。在本实施例中使用Qiagen微量DNA提取试剂盒，以新鲜组织为例：

(1)将新鲜组织放入高温灭菌的研钵中，倒入液氮后研碎，将研碎的组织移入1.5ml的EP管中；

(2)加入1ml生理盐水冲洗，离心3000rpm 5min，弃上清；

(3)加入200μl NaOH(50mM)，95℃孵育10min，离心5000rpm10min，弃上清；

(4)加入500μl Lyticase溶壁酶溶液，37℃孵育30min；

(5)离心14000rpm 10min，弃上清；

(6)迅速加180μl ATL和20μl蛋白酶K 55℃15min；

(7)加100μl AL，震荡15s.充分混匀。70℃10min(100μl AL缓冲液中加1μg载体RNA)；

(8)50μl乙醇(96-100％)震荡15s.室温5min(15-25℃)；

(9)短暂离心；

(10)小心将所有溶胞产物移至柱，避免沾湿管壁，移液器勿触及膜，离心6000g(8000rpm)1min.将柱子放进2ml收集管，弃收集管。若溶胞产物未完全通过膜，再次用更高转速离心直至柱子空；

(11)往柱子里加500μl AW1(摇匀)，避免沾湿管壁。离心6000g(8000rpm)1min.将柱子放进2ml收集管，弃收集管；

(12)往柱子里加500μl AW2，避免沾湿管壁。离心6000g(8000rpm)1min.将柱子放进2ml收集管，弃收集管；

(13)14,000rpm，3min使膜完全干燥，确保没有乙醇；

(14)将柱子置于1.5ml离心管，弃收集管。加20-100μl AE蒸馏水(PH大于7)于膜中央。

(15)室温(15-25℃)1min.

(16)将柱子置于收集管上，20,000g(14,000rpm)离心1min，将收集管内液体保存备用。

实施例2：样品的PCR扩增

PCR反应体系：PCR反应总体积为25μl，含模板DNA(阿萨希毛孢子菌，烟曲霉，黄曲霉，黑曲霉，土曲霉，构巢曲霉，乳酒念珠菌，皱褶念珠菌，少根根霉，小孢根霉，微小根毛霉，伞状犁头霉，白念珠菌，克柔念珠菌，光滑念珠菌，热带念珠菌，近平滑念珠菌，季也蒙念珠菌，都柏林念珠菌或新生隐球菌DNA)5μl，10×Buffer2.5μl，2.5mM dNTP 1.25μl，25mM MgCl₂3μl，引物ITS1、ITS450pmol各0.25μl，Hotstart Taq酶(5U/μl)0.1μl，补超纯水至25μl。

PCR反应条件：95℃15分钟，扩增变性、退火、延伸的条件分别为94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环，最后72℃延伸10分钟。取8μl PCR产物于1.5％的琼脂糖中电泳30分钟，电泳后染色30分钟，于凝胶成像系统照相。剩余的PCR产物用于杂交(5μl PCR产物即可)。

实施例3：探针的标记以及基因芯片的制备

(1)用0.5M NaHCO₃(PH 8.4)稀释本发明所述探针至适宜浓度，取4ul探针溶液入微孔板中，每孔加入4ul点样液，充分混匀，空白对照为等量上述NaHCO₃与点样液的混合液。

(2)将BiodyneC尼龙膜裁剪至合适大小。

(3)室温下，16％w/v EDAC孵育Biodyne C尼龙膜10分钟。

(4)去离子水漂洗Biodyne C尼龙膜1分钟。

(5)用滤纸吸干尼龙膜。

(6)用点样仪取探针溶液及空白对照溶液点样于制备好的尼龙膜上。

(7)室温下孵育5分钟。

(8)吸除尼龙膜表面液体，将尼龙膜放入0.1M NaOH液中灭活9分钟。

(9)在摇床中用100ml 2×SSPE漂洗Biodyne C尼龙膜5分钟。

(10)在摇床中用60℃2×SSPE/0.5％SDS液漂洗Biodyne C尼龙膜5分钟。

(11)于室温下在摇床中用200ml 20mM EDTA液清洗Biodyne C尼龙膜20分钟。

(12)将Biodyne C尼龙膜放入洁净的塑料袋中，并加入10ml的EDTA，密封保存于4℃冰箱中，备用。

实施例4：利用本发明所述探针进行样品的检测

使用链亲和素-过氧化物酶(Roche Diagnostics Co.)用2×SSPE(SSPE is 0.18M NaCl，10mM NaH₂PO₄，和1mM EDTA[pH 7.7]-0.5％SDS)1∶4,000稀释；杂交温度为60℃；胶片(Hyperfilm；Amersham)的曝光时间为2分钟。具体步骤如下：

(1)取5μl PCR扩增产物、与1μl阳性对照片段(序列如SEQ IDNo.6所示)样本同时加入150μl 2×SSPE/0.1％SDS混匀，加入EP管中。

(2)99℃加热10分钟，然后将EP管迅速放置于冰上至少5分钟。

(3)在杂交箱中用250ml 60℃的2×SSPE/0.1％SDS液体摇动漂洗已标记了探针的Biodyne C尼龙膜5分钟。

(4)吸除尼龙膜表面液体。

(5)用自制模具加入经2×SSPE/0.1％SDS溶液稀释后的PCR扩增产物150μl于对应位置。

(6)在杂交箱中，60℃杂交60分钟。

(7)用250ml 60℃2×SSPE/0.5％SDS溶液于摇床中洗Biodyne C尼龙膜两次，每次10分钟。

(8)加入15ml 2×SSPE/0.5％SDS和1/5000链亲和素-过氧化物酶结合物混合液，42℃孵育45分钟。

(9)用250ml 42℃2×SSPE/0.5％SDS液于摇床中洗Biodyne C尼龙膜两次，每次10分钟。

(10)室温下用250ml 2×SSPE液在摇床中洗Biodyne C尼龙膜两次，每次5分钟。

(11)加入20ml ECL显影剂于Biodyne C尼龙膜上，室温孵育1分钟。

(12)将Biodyne C尼龙膜放入暗盒中。

(13)在暗盒中放入X光片，曝光，洗片，观察结果。

(14)将Biodyne C尼龙膜用80℃250ml 1％SDS液摇动漂洗两次，每次30分钟。

(15)再用200ml 20mM EDTA液于摇床中清洗Biodyne C尼龙膜15分钟。

(16)将Biodyne C尼龙膜放入洁净的塑料袋中，并加入10ml的EDTA，密封4℃保存备用。

实施例5：结果的判定

在探针对应的底片位置上，出现黑点，表示结果为阳性。无黑点，表示结果为阴性。

图1示按照实施例1-4制备的标记了本发明探针的基因芯片杂交结果。基因芯片上标记的探针的顺序为：1阳性对照(如SEQ ID No.4所示)，2阴性对照(如SEQ ID No.5所示)，3空白对照，4-23本发明所述探针；

菌株PCR产物杂交顺序：1-4阿萨希毛孢子菌，5烟曲霉，6黄曲霉，7黑曲霉，8土曲霉，9构巢曲霉，10乳酒念珠菌，11皱褶念珠菌，12少根根霉，13小孢根霉，14微小根毛霉，15伞状犁头霉，16白念珠菌，17克柔念珠菌，18光滑念珠菌，19热带念珠菌，20近平滑念珠菌，21季也蒙念珠菌，22都柏林念珠菌，23新生隐球菌。

从图1可见，本发明所述特异性探针仅仅与阿萨希毛孢子菌的PCR产物杂交，未与其它真菌PCR产物发生非特异性杂交，证实其与阿萨希毛孢子菌结合特异性强。

实施例6：灵敏度及重复性检测

不同数量阿萨希毛孢子菌孢子提取DNA后，经本发明所述基因芯片检测，结果如图2所示，1-2.5ng(相当于100CFU)，2-1.25ng(相当于50CFU)，3-0.63ng(相当于25CFU)，4-0.31ng(相当于12.5CFU)，5-0.15ng(相当于6CFU)，6-0.08ng(相当于3CFU)，7-0.04ng(相当于1.5CFU)，8-0.02ng(相当于0.75CFU)，9-0.01ng(相当于0.4CFU)。

取不同剂量阿萨希毛孢子菌PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。Marker为750bp、500bp，C为阴性对照，1-1×10³ng，2-500ng，3-250ng，4-50ng，5-5ng，6-0.5ng，7-0.05ng，8-5×10-³ng。

以上结果说明，样品中含有2-3CFU以上阿萨希毛孢子菌经检测即可见阳性信号；真菌PCR产物达0.04ng以上即可被检测出来。而利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物时，至少要5ng以上PCR产物进行电泳方可见肉眼所见条带。说明本发明所述检测方案的敏感性明显高于单纯PCR检测。

重复性检测：本发明具有良好的重复性，取10份阳性阿萨希毛孢子菌进行重复检测，阳性率达100％。

实施例8：临床分离菌株检测结果

检测自临床标本中分离培养的菌株，利用本发明所述基因芯片检测出的结果经分离培养或测序比对验证，其检测结果一致率达100％，结果见表2。

表2.本发明所述方法进行临床病例检测

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。