免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体及其构建与应用

摘要

本发明公开了一种免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体，是由转录shRNA的DNA序列、转录ssRNA的DNA序列与pTZU6+1载体组成的重组载体，其序列如seq.1所示。本发明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体，转染HepG2.2.15细胞，经Northern blot鉴定能够在胞内表达；转染HepG2.2.15细胞，24h后检测，发现能够下调HBV的表达；转染HepG2.2.15细胞，24h后检测，发现能够下调上清中HBV抗原含量和胞内抗原含量；由此可见，本发明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体能够作为抗HBV的药物应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体，及其构建与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

HBV感染可引起急、慢性肝炎，并且与肝硬化、肝癌的发病密切相关。而且，作为一种能够逃逸免疫监视的病毒，在感染的早期不能引起免疫反应，从而不被机体抗病毒系统所清除。为HBV的治疗带来了挑战。RNAi技术用于抗HBV治疗，有望成为治疗乙型肝炎的革命性新方法。由于HBV复制具有以RNA为模板合成DNA的特点，只要阻断RNA的合成就能抑制DNA的复制，因此HBV感染特别适用于RNAi治疗。并且某些RNA序列能够激活免疫系统，诱导抗病毒反应。因此设计并构建能够表达靶向沉默HBV基因的RNA和能够激活免疫系统的RNA，是实现对HBV的治疗的有效手段。

发明内容

针对上述现有技术，针对HBV生命周期的特点，本发明提供了一种免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体，以及其构建方法，及在制备抗HBV的药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体，是由转录shRNA的DNA序列、转录ssRNA的DNA序列与pTZU6+1载体组成的重组载体，其序列如seq.1所示。

本发明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体是通过以下方法构建制得的：

(1)针对HBV x基因的序列，人工设计合成shRNA相对应的DNA序列，并在序列的两端添加双酶切位点Sal I和Xbal I，退火形成双链结构，得表1所示的序列；

表1人工设计合成shRNA相对应的DNA序列

  Name  Type  Sequence 5′-＞3  shRNA1-f  DNA  tcgacgcata cttcaaagac tgtttgtcaa gagcaaacag tctttgaagt atgct  shRNA1-r  DNA  ctagagcata cttcaaagac tgtttgctct tgacaaacag tctttgaagt atgcg  shRNA2-f  DNA  tcgacggtta aaggtctttg tactagtcaa gagctagtac aaagaccttt aacct  shRNA2-r  DNA  ctagaggtta aaggtctttg tactagctct tgactagtac aaagaccttt aaccg  shRNA3-f  DNA  tcgacggcat aaattggtct gttcactcaa gaggtgaaca gaccaattta tgcct  shRNA3-r  DNA  ctagaggcat aaattggtct gttcacctct tgagtgaaca gaccaattta tgccg  shRNA4-f DNA  tcgacgtttt tcccctctgc ctaatcaaga gttaggcaga ggggaaaaa  shRNA4-r DNA  ctagattttt cccctctgcc taactcttga ttaggcagag gggaaaaacg

(2)将pTZU6+1载体进行Sal I和Xbal I的双酶切，并回收载体骨架；

(3)将步骤(1)制得的序列与步骤(2)制得的pTZU6+1载体连接，构建pTZU-shRNA重组载体；

(4)利用阳离子脂质体Lipofectamine2000(购自invitrogen)将构建的pTZU-shRNA转染到HBV感染的人肝细胞系HepG2.2.15细胞，并检测HBV x基因的表达水平，筛选具有较好沉默能力的shRNA序列的DNA序列；然后将筛选得到的pTZU-shRNA重组载体进行EcoR I和Hind III双酶切，得到U6+shRNA的表达框，其序列如seq.2所示；

(5)根据能够激活免疫系统的RNA病毒序列，设计编码具有潜在免疫刺激作用序列的RNA的DNA序列，并在序列的两端添加双酶切位点序列EcoRI和BamHI，得表2所示的序列；

表2人工设计合成ssRNA相对应的DNA序列

  Name  Type Sequence 5′-＞3  ssRNA1-f  DNA gatcccgggc agacaacaca ctgagaaaaa ag  ssRNA1-r  DNA aattcttttt tctcagtgtg ttgtctgccc gg  ssRNA2-f  DNA gatcccatca cacacaaaaa ag  ssRNA2-r  DNA aattcttttt tgtgtgtgat gg  ssRNA3-f  DNA gatcccagac aacacacaaa aaag  ssRNA3-r  DNA aattcttttt tgtgtgttgt ctgg  ssRNA4-f  DNA gatccgatgt gtttagtcgc taaaaaag  ssRNA4-r  DNA aattcttttt tagcgactaa acacatcg  ssRNA5-f  DNA gatcctcgaa ttggacagga agttaaaaaa g  ssRNA5-r  DNA aattcttttt taacttcctg tccaattcga g

(6)将pSIREN载体进行EcoR I和BamH I双酶切，并回收载体骨架；

(7)将步骤(5)制得的序列与步骤(6)制得的pSIREN载体连接，构建pSIREN-ssRNA重组载体；

(8)利用阳离子脂质体Lipofectamine2000(购自invitrogen)将构建的pSIREN-ssRNA转染到小鼠巨噬细胞系RAW264.7、新鲜分离的小鼠肝淋巴细胞、人肝癌细胞系HepG2和HBV感染细胞系HepG2.2.15，并检测细胞因子IFN的RNA水平和蛋白水平，筛选能够激活免疫系统的表达载体，得到的具有刺激作用的序列，然后将筛选得到的pSIREN-ssRNA重组载体进行EcoR I单酶切，得线性片段；

(9)将步骤(3)制得的U6+shRNA表达框和步骤(6)制得的线性片段平端化，连接，即得到表达shRNA和ssRNA的双表达载体，其序列如seq.1所示。

本发明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体，转染HepG2.2.15细胞，经Northern blot鉴定能够在胞内表达；转染HepG2.2.15细胞，24h后检测，发现能够下调HBV的表达；转染HepG2.2.15细胞，24h后检测，发现能够下调上清中HBV抗原含量和胞内抗原含量；由此可见，本发明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体能够作为抗HBV的药物应用。

上述实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规实验方法，上述实验试剂均为市售产品。

本发明利用构建的shRNA和ssRNA的双表达载体能够诱导细胞因子的分泌，相较于shRNA的表达载体，双表达载体对HBV具有更好的抑制作用，能够明显的抑制HepG2.2.15细胞中的HBV水平，并且能够抑制利用HBV转染质粒引起的HBV高表达，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为表达载体在HepG2.2.15细胞中的表达示意图，A：ssRNA；B：shRNA；Northern blot检测shRNA和ssRNA在HepG2.2.15细胞中都有表达。

图2为双表达载体能够明显的下调HepG2.2.15细胞中HBV x基因的表达示意图。

图3为双表达载体能够明显的下调HepG2.2.15细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量示意图。

图4为双表达载体能够明显的下调HepG2.2.15细胞中HBV RNA水平示意图。

图5为双表达载体能够明显的下调HepG2.2.15细胞中HBsAg的含量示意图，其中，A、B、C、D依次为转染pSIREN组，shRNA3组，ssRNA5组，shRNA3+ssRNA5组。

图6为双表达载体能够长期的下调HepG2.2.15细胞HBV x基因的表达示意图，利用定量PCR检测转染不同天数后HBV x基因的表达。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。

实施例

1，一种双表达载体构建：

(1)针对HBV x基因的序列，设计针对HBV x基因的特异性沉默RNA及相对应的DNA序列，并且在序列的两端添加双酶切位点序列Sal I和Xbal I，退火形成双链结构，序列见表1所示；

(2)将pTZU6+1载体进行Sal I和Xbal I的双酶切，并回收载体骨架；

(3)将步骤(1)制得的序列与步骤(2)制得的pTZU6+1载体连接构建成pTZU-shRNA；

(4)利用阳离子脂质体Lipofectamine2000(购自invitrogen)将构建的pTZU-shRNA转染到HBV感染的人肝细胞系HepG2.2.15细胞，并检测HBV x基因的表达水平，筛选具有较好的沉默能力的序列。然后将筛选得到的pTZU-shRNA(shRNA3)进行EcoRI和Hind III双酶切，并回收U6+shRNA的表达框(电泳图谱的小片段)，其序列见seq.2所示；

(5)根据能够激活免疫系统的RNA病毒序列，设计编码具有潜在免疫刺激作用序列的RNA的DNA序列，并在序列的两端添加双酶切位点序列EcoRI和BamH I，退火形成双链结构ssRNA，序列见表2所示；

(6)将pSIREN载体进行EcoR I和BamH I双酶切，并回收载体骨架；

(7)将步骤(5)制得的ssRNA序列和步骤(6)制得的pSIREN载体链接，构建成pSIREN-ssRNA；

(8)利用阳离子脂质体Lipofectamine2000(购自invitrogen)将构建的pSIREN-ssRNA转染到小鼠巨噬细胞系RAW264.7，新鲜分离的小鼠肝淋巴细胞，和人肝癌细胞系HepG2和HBV感染细胞系HepG2.2.15，并检测细胞因子IFN的RNA水平和蛋白水平，筛选能够激活免疫系统的表达载体，得到具有刺激作用的序列(ssRNA5)；将表达载体EcoR I单酶切，回收片段；

(9)将步骤(4)制得的U6+shRNA表达框和步骤(8)制得的线性pSIREN-ssRNA5平端化，连接。筛选得到表达shRNA和ssRNA的双表达载体。序列见seq.1所示。

2.双表达载体的应用

①定量PCR：双表达载体转染HepG2.2.15细胞24h后，提取RNA，检测HBV x基因，c基因的表达，利用定量PCR检测目的基因的相对表达量，结果如图2所示，能够看到双表达载体相比于沉默序列或者刺激序列，具有更好的沉默作用和抑制效果。

②Northern blot：利用双表达载体转染HepG2.2.15细胞24h后，提取RNA，检测表达载体的表达，如图1所示，利用Northern blot检测表达载体在细胞中的表达，可以看出，表达载体构建是成功的。

③体外治疗，利用双表达载体转染HepG2.2.15细胞，能够检测到在RNA水平(如图2)所示，定量PCR检测ssRNA+shRNA能够明显降低HBV x基因和HBV s基因的水平，如图4所示，Northern blot检测HBV RNA的水平)和蛋白水平(如图3所示，ELISA检测培养上清中HBsAg，HBeAg的含量，相较于pSIREN组和shRNA组，ssRNA+shRNA能够明显降低二者的水平；如图5所示，免疫组化检测ssRNA+shRNA能够明显降低HBsAg的含量)对HBV都具有明显的抑制效果，并且这种抑制效果要好于沉默表达载体。