单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法以及单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液或冻干粉针

摘要

本发明提供了一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，包括以下步骤：1)称取动物脑组织，用去垢剂的水溶液作为提取溶剂，搅拌提取，除去沉淀，得到提取液；2)将所述提取液浓缩，得到单唾液酸四己糖神经节苷脂粗提液。本发明还提供了包含该单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制剂。本发明在单唾液酸四己糖神经节苷脂的提取过程中不使用有机溶剂，且制备过程简化，适于大规模生产，更加环保，并且可以降低生产成本和生产周期。本发明还提供了一种包含由上述方法制备得到的单唾液酸四己糖神经节苷脂的注射剂，其具有较高的纯度，且不含有机溶剂，可提高临床用药的安全性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物药物的制备方法，特别是涉及神经节苷脂钠的制备方法。

本发明还涉及包含该神经节苷脂钠的制剂。

背景技术

神经节苷脂(ganliosides，GLS)又称N物质，是含有唾液酸残基结构复杂的膜糖脂，是神经细胞膜的主要脂质成分之一，是细胞表面负电荷的主要来源，参与细胞表面识别和信号传导。

神经节苷脂是促进中枢神经系统(CNS)损伤后修复的一种特效物质，在神经系统发生、生长和分化过程中具有重要作用，对损伤后的神经具有促进神经细胞再生、轴突生长和突触形成、恢复神经支配功能；改善神经传导、促进脑电活动及其它神经电生理指标的恢复；保护细胞膜、促进细胞膜各种酶活性恢复等作用。单唾液酸神经节苷脂(GM1)除具有上述神经节苷脂的共同作用外，还可以通过维持中枢神经细胞膜上的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，起到维持细胞内外离子平衡、减轻神经细胞水肿、防止细胞内Ca2+积聚的作用，具有对抗兴奋性氨基酸的神经毒性作用和减少自由基对神经细胞的损害等作用。

神经节苷脂的分子组成包括两个部分：即疏水的神经酰胺和亲水的唾液酸寡糖基团，而神经酰胺由氨基鞘胺醇与脂肪酸酯化而成。神经酰胺一端嵌入细胞膜磷脂双分子层中，寡糖链和唾液酸部分游离于细胞膜表面。依据神经节苷脂分子中所含唾液酸的数目(单唾液酸、双唾液酸、三唾液酸等)、糖残基的数目、连接位置以及亚基的不同，分别被命名为GM1，GM2，GM3，GD1a，GD1b，GT1b，GD3等。

GM1的分子结构式如下：

GM1--Gangliosidde

单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(GM1)是主要的神经节苷脂之一，临床上用于治疗中枢神经系统病变(包括脑脊髓创伤、脑血管意外)和帕金森氏病，疗效确切，安全性高，已在我国上市多年。

神经节苷脂的制备一般分为提取和纯化两个步骤：首先将细胞膜上的神经节苷脂用溶剂提取出来，得到粗提物或粗提液；再采用层析或其他生物技术手段进行分离纯化，得到单一组分的某一种神经节苷脂。

现有神经节苷脂的提取方法均基于J.Folch等人的文献(J.Folch.A simplemeyhod for the isolution and purification of total lipides from animal tissues.TheJournal of Biological Chemistry，1957，226(1)：497～509)，其主要方法是：首先制备动物脑组织匀浆液，加入20倍组织重量的氯仿-甲醇混合溶液(2∶1V/V)提取总脂；加入0.2倍体积的水或无机盐水溶液于总脂提取液中使其分层，神经节苷脂分配到上层，虹吸上层溶液，得到神经节苷脂的粗提液。后人在此基础上进行了一些改进，如先用丙酮将组织匀浆液制成丙酮干粉，再用一定比例的氯仿、甲醇、水混合溶液进行提取，萃取分层后神经节苷脂转入水相，得到神经节苷脂的粗提液。

神经节苷脂的纯化一般采用层析技术，层析介质可采用离子交换介质、多孔硅胶或大孔吸附树脂等。例如：中国专利CN 1814610A公开了采用大孔树脂分离GM1的方法。中国专利CN 1353112A公开一种从动物脑组织中分离纯化高纯度GM1的工艺方法。该方法主要包括用有机溶剂混合物提取总神经节苷脂，酸水解总神经节苷脂，离子交换柱层析，反相柱层析等四步，所得GM1纯度大于98％。又如：中国专利CN 1158295C公开了结合使用超滤膜分离技术、Iatrobeads及DEAE Sephadex A-25柱层析、高效液相色谱层析技术，从猪脑中提取、纯化神经节苷脂GM1，纯度达95％以上。

动物组织中的神经节苷脂含量极低，每公斤脑组织约含有GM10.2g，上述公开的工艺均需要使用大量有机溶剂(丙酮、氯仿和甲醇)。大量使用有机溶剂有很多弊端，如污染环境，对操作人员的身体健康容易造成损害，易燃，有火灾隐患，要求有防爆设施，需要有回收溶剂的设备，并且最终产品中需要对使用的有机溶剂进行检查等等。

从理论上讲，药物制备过程中所使用的有机溶剂均有残留的可能。程速远等人测定了GM1的进口上市产品(阿根廷TRB Pharma 20011004，20021005，20011006)中有机溶剂残留量(程速远、徐康森.顶空毛细管气相色谱法测定单唾液酸神经节苷脂中有机溶剂残留量，海峡药学，2005，17(1)：33～35)，其甲醇、氯仿和丙酮的残留量分别为0.054％、0.003％、0.051％。

人用药物注册技术要求国际协调会(International Conference onHarmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals forHuman Use，ICH)颁布的残留溶剂研究指导原则ICH Q3C中说明了第二类溶剂的危害：第二类溶剂是指有非遗传毒性致癌(动物实验)、或可能导致其他不可逆毒性(如神经毒性或致畸性)、或可能具有其他严重的但可逆毒性的有机溶剂。此类溶剂具有一定的毒性，但和第一类溶剂相比毒性较小，建议限制使用，以防止对病人潜在的不良影响。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的制备方法。本发明在单唾液酸四己糖神经节苷脂的提取过程中不使用有机溶剂，且制备过程简化，适于大规模生产，更加环保，并且可以降低生产成本和生产周期。

进一步地，本发明提供了采用上述方法制备的GM1为原料药制造的制剂，特别是注射剂。由于如上所述，本发明在单唾液酸四己糖神经节苷脂的提取过程中不使用有机溶剂，因此，所制备得到的单唾液酸四己糖神经节苷脂没有有机溶剂残留，且纯度较高(能够达到98％以上)，从而能够有效地提高临床用药的安全性。

在本文中，有时将单唾液酸四己糖神经节苷脂简称为神经节苷脂。

由于神经节苷脂主要存在于细胞膜，神经酰胺一端嵌入细胞膜内，寡糖链一端伸出细胞膜外，因而提取神经节苷脂的关键在于破坏其与细胞膜的作用力，使其释放到溶液中。本发明人在采用去垢剂溶液提取膜蛋白的试验过程中，偶然发现同时可以将神经节苷脂提取出来。在此基础上，本发明人对去垢剂溶液提取神经节苷脂的方法进行研究，试验结果表明，采用一定浓度的除垢剂溶液提取神经节苷脂是可行的，并且提取率不低于原有方法，可减少或完全不使用有机溶剂，避免了大量使用有机溶剂的各种弊端，该法目前未见报道。

从理论上讲，药物制备过程中所使用的有机溶剂均有残留的可能。程速远等人测定了GM1的进口上市产品(阿根廷TRB Pharma 20011004，20021005，20011006)中有机溶剂残留量(程速远、徐康森.顶空毛细管气相色谱法测定单唾液酸神经节苷脂中有机溶剂残留量，海峡药学，2005，17(1)：33～35)，其甲醇、氯仿和丙酮的残留量分别为0.054％、0.003％、0.051％。

采用本发明方法可以完全避免有机溶剂的使用，制备的神经节苷脂残留有机溶剂检测气相色谱图见附图3，可见产品中未检出残留有机溶剂。

甲醇、氯仿为中国药典2005版中规定应限制使用的第二类有机溶剂，丙酮为第三类有机溶剂，中国药典2005版对甲醇、氯仿和丙酮的残留量有明确的要求，分别为0.3％、0.006％和0.5％。

去垢剂水溶液和有机溶剂两者相比较，去垢剂水溶液的作用较温和，得到的提取液中含有相对较少的杂质，从而在后继的纯化过程中可以得到纯度更高的GM1，例如，纯度大于97％，优选≥98.0％，更优选为98％～99.5％，最优选为98％～99％。

本发明产品与上市产品的纯度检测色谱图见附图1、2，从中可见上市产品施捷因的纯度为96.09％，本发明产品的纯度为98.45％。

本发明中，GM1的纯度提高表明有效成分的含量提高，杂质的含量减少，可以减少或避免由于杂质而引起的与治疗无关的其他作用，如副作用，从而能够有效地提高临床用药的安全性。

根据本发明的目的，本发明提供了一种单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1)的制备方法，其包括以下步骤：

1)称取动物脑组织，匀浆，用去垢剂的水溶液作为提取溶剂，搅拌提取，除去沉淀，得到提取液；

2)将所述提取液浓缩，得单唾液酸四己糖神经节苷脂粗提液。

上述制备方法可以进一步包括以下步骤：

将所述单唾液酸四己糖神经节苷脂粗提液制成干粉，即为神经节苷脂粗提物。

动物脑组织可以选自牛脑、猪脑、羊脑、马脑等，优选牛脑和猪脑等，最优选猪脑。

上述动物脑组织为离体的动物脑组织。

在上述步骤中，在用去垢剂水溶液提取动物脑组织之前，一般应先去除杂质。所述作为提取溶剂的去垢剂水溶液应当具有适宜的浓度，例如重量百分比为1％～10％，优选1％～5％。匀浆后的动物脑组织与提取溶剂的体积比应当能够保证提取的顺利进行，优选为1∶0.5～5。用含有一定浓度去垢剂的水溶液为提取溶剂，充分破坏细胞膜。在适宜温度条件下，搅拌提取。所采用的温度根据所选择去垢剂的不同而进行适宜的调整，一般在4℃～60℃的范围内。例如，当采用Triton x-100作为提取溶剂时，一般温度控制在4℃～20℃的范围内。除去沉淀的方法可以采用常规的去沉淀方法，例如离心或过滤。沉淀可同法进行多次提取，直至神经节苷脂提取完全。合并多次提取液，浓缩至小体积，得到神经节苷脂粗提液，其神经节苷脂含量按唾液酸计为0.1mg/ml～10mg/ml。或进一步制备成干粉，即为神经节苷脂粗提物。粗提物中神经节苷脂含量按唾液酸计为0.1％～25％(重量百分比)。

上述制备方法可以进一步包括以下步骤：

将所述单唾液酸四己糖神经节苷脂粗提液或粗提物进一步纯化，获得纯度大于95％，优选98％的单唾液酸四己糖神经节苷脂。

所述纯化方法可以为现有技术中已知的纯化方法，例如，采用T.Momoi等人报道的DEAE-Sephadex A-25及多孔硅胶Iatrobeads纯化技术(T.Momoi.High resolution preparative column chromatographic system for gangliosides usingDEAE-Sephadex and a new porus silica，Iatrobeads.Biochim Biophys Acta.1976，441(3)：488～497。)，得到纯度大于97％的GM1；也可以采用其他方法进行分离纯化，如夏霞娟等人报道的方法(夏霞娟等.水牛脑神经节苷脂的分离纯化.生物化学与生物物理进展.1985，12(5)：27～31)得到GM1。

在本发明中，所述去垢剂也被称作表面活性剂，是一类既具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，按其在水溶液中显示表面活性的离子基团，可分为非离子型去垢剂、离子型去垢剂以及兼性离子型去垢剂等多种类型。

所述去垢剂可以为选自非离子型去垢剂、离子型去垢剂以及兼性离子型去垢剂的一种或多种。所述去垢剂可以为两种或两种以上相同或不同类型去垢剂的混合物。

所述非离子型去垢剂可以选自但不限于：bigCHAP((3a，5b，7a，12a)-N，N-双[3-(D-葡萄糖酰氨基)丙基]-3，7，12-三羟基胆甾烷-24-胺)、Brij35(聚氧乙烯月桂醚)、C12E8(辛乙烯二醇单正十二烷基酯)、C12E9(聚乙二醇单月桂酸酯)、葵基-β-葡萄糖苷、葵基-β-麦芽糖苷、毛地黄皂苷、十二烷基-β-葡萄糖苷、十二烷基麦芽糖苷、辛基-β-葡萄糖苷、辛基-β-麦芽糖苷、Triton X-100(曲拉通X-100)、Tween-20(吐温20或聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯)、Tween-80(吐温80或聚山梨酯80或聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)等。

所述离子型去垢剂可以选自但不限于：胆酸盐、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、CTAB(即十六烷基三甲基溴化胺，别名溴化十六烷基三甲基胺，鲸腊基三甲基溴化胺)等。

所述兼性离子型去垢剂可以选自但不限于：CHAPS(3[(3胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐)、CHAPSO(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸)、Zwittergent(烷基磺酸甜菜碱)等。

优选离子型去垢剂，因为其临界胶束浓度适当，胶束分子量一般较小，容易通过超滤或透析的方法除去。

在本发明的具体实施方式中，本发明采用下述技术方案：

1)取动物脑组织，除去杂质，用含有一定浓度去垢剂的水溶液为提取溶剂，充分破坏细胞膜。在适宜温度条件下，搅拌提取，离心或过滤除去沉淀，沉淀可同法进行多次提取，直至神经节苷脂提取完全。合并多次提取液，浓缩至小体积，得到神经节苷脂粗提液，或进一步制备成干粉，即为神经节苷脂粗提物。

2)神经节苷脂粗提液或粗提物，可以采用T.Momoi等人报道的DEAE-Sephadex A-25及多孔硅胶Iatrobeads纯化技术(T.Momoi.Highresolution preparative column chromatographic system for gangliosides usingDEAE-Sephadex and a new porus silica，Iatrobeads.Biochim Biophys Acta.1976，441(3)：488～497。)，得到纯度大于96％的GM1；也可以采用其他方法进行分离纯化，如夏霞娟等人报道的方法(夏霞娟等.水牛脑神经节苷脂的分离纯化.生物化学与生物物理进展.1985，12(5)：27～31。)得到GM1。

由上述方法制备得到的GM1可以进一步制备成合适的制剂，优选注射剂，例如注射液或冻干粉针制剂。该注射剂包含由本发明的制备方法制备得到的单唾液酸四己糖神经节苷脂以及适宜种类和用量的药用辅料，例如缓冲盐、冻干赋形剂等。

本发明中，GM1的纯度提高表明有效成分的含量提高，杂质的含量减少。当采用该没有有机溶剂残留且纯度提高的GM1制备注射剂时，可以减少或避免由于杂质而引起的与治疗无关的其他作用，如副作用，从而能够有效地提高临床用药的安全性。

为了更好地理解本发明的本质，下面通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。

附图说明

图1：由本申请实施例10制得的GM1的纯度检查高效液相色谱图。

图2：进口上市产品施捷因的纯度检测液相色谱图。

图3：本发明制得的GM1残留有机溶剂检测气相色谱图。

图4：由本申请实施例11制得的GM1的纯度检查高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。实施例中的动物脑组织收购于定点屠宰厂，冷冻保存。其他试剂均为市售产品。

实施例1～7为神经节苷脂的提取方法举例，实施例8、9为神经节苷脂粗提液浓缩干燥方法举例，实施例10、11为GM1分离纯化方法举例，实施例12～18为GM1制剂方法举例，实施例19为GM1纯度检测方法，实施例20为GM1定性检测法一唾液酸与间苯二酚-盐酸反应。

神经节苷脂的提取方法

实施例1

取猪脑组织，除去杂质后称重，加等量纯化水制备匀浆，匀浆液加入2倍量(V/V)2％Triton X-100溶液，4～20℃搅拌提取15小时，离心除去沉淀，沉淀用2倍量(W/W)的2％Triton X-100溶液再提取1次，提取时间5小时，合并提取液，用截留分子量为10KD的超滤膜进行浓缩，浓缩至原体积的五分之一左右，得到神经节苷脂粗提液。以唾液酸量计算，神经节苷脂含量为0.83mg/ml。

实施例2

取牛脑组织，除去杂质后称重，加等量纯化水制备匀浆，匀浆液用1倍量(V/V)的5％Tween-80溶液，40℃搅拌提取10小时，过滤除去沉淀，沉淀用1倍量(W/W)的5％Tween-80溶液再提取1次，提取时间4小时，合并提取液，减压浓缩至原体积的八分之一左右，得到神经节苷脂粗提液。以唾液酸量计算，神经节苷脂含量为3.02mg/ml。

实施例3

取猪脑组织，除去杂质后称重，加等量纯化水制备匀浆，匀浆液，用4倍量(V/V)的1％Brij35溶液，60℃搅拌提取4小时，离心除去沉淀，沉淀用2倍量(W/W)的1％Brij35溶液再提取2次，提取时间分别为2小时和1小时，合并提取液，用截留分子量为10KD的超滤膜进行浓缩，至原体积的四分之一左右，得到神经节苷脂粗提液。以唾液酸量计算，神经节苷脂含量为0.31mg/ml。

实施例4

取猪脑组织，除去杂质后称重，加等量纯化水制备匀浆，匀浆液用0.5倍量(V/V)的2％脱氧胆酸钠溶液，4～20℃搅拌提取20小时，离心除去沉淀，沉淀用0.5倍量(W/W)的2％脱氧胆酸钠溶液再提取1次，提取时间10小时，合并提取液，用截留分子量为10KD的超滤膜进行浓缩，浓缩至原体积的十分之一左右，得到神经节苷脂粗提液。以唾液酸量计算，神经节苷脂含量为5.64mg/ml。

实施例5

取牛脑组织，除去杂质后称重，加等量纯化水制备匀浆，匀浆液用3倍量(V/V)的4％十二烷基硫酸钠溶液，45℃搅拌提取12小时，离心除去沉淀，沉淀用2倍量(W/W)的4％十二烷基硫酸钠溶液再提取1次，提取时间6小时，合并提取液，减压浓缩至原体积的四分之一左右，得到神经节苷脂粗提液。以唾液酸量计算，神经节苷脂含量为0.15mg/ml。

实施例6

取羊脑组织，除去杂质后称重，加等量纯化水制备匀浆，匀浆液用1倍量(V/V)的2％CHAPS溶液，55℃搅拌提取8小时，离心除去沉淀，沉淀用1倍量(W/W)的2％CHAPS溶液再提取2次，提取时间分别为4小时和2小时，合并提取液，用截留分子量为10KD的超滤膜进行浓缩，浓缩至原体积的八分之一左右，得到神经节苷脂粗提液。以唾液酸量计算，神经节苷脂含量为1.33mg/ml。

实施例7

取马脑组织，除去杂质后称重，加等量纯化水制备匀浆，匀浆液加入1倍量(V/V)的含2％Triton X-100、1％Brij35的溶液，50℃搅拌提取10小时，离心除去沉淀，沉淀用1倍量(W/W)的上述溶液同法再提取1次，提取时间为4小时，合并提取液，用截留分子量为10KD的超滤膜进行浓缩，浓缩至原体积的八分之一左右，得到神经节苷脂粗提液。以唾液酸量计算，神经节苷脂含量为2.14mg/ml。

神经节苷脂粗提液的浓缩干燥方法

实施例8

取实施例1得到的神经节苷脂粗提液，进行喷雾干燥，得到神经节苷脂粗提物，其神经节苷脂含量为7.6％(重量百分比)。

实施例9

取实施例4得到的神经节苷脂粗提液，对40倍体积的水透析三次，每次12小时，取透析后的神经节苷脂粗提液装入料盘中，置于冻干机内，进行冷冻干燥，得到GM1粗提物，其GM1含量为24.6％(重量百分比)。

GM1的分离纯化方法

实施例10GM1的纯化方法

离子交换层析将DEAE-Sephadex A-25悬于5倍体积的氯仿/甲醇/0.8mor/L NaAc(30∶60∶8，V/V)溶液中，用力振摇片刻，放置30分钟，过滤。上述过程再重复3次。将如上活化的树脂过滤，再以氯仿/甲醇/水(30∶60∶8，V/V溶液A)溶液洗3次，以除去过剩的Ac-离子。将活化的树脂悬于A液中，加到层析柱中。将按照实施例1所述方法制备得到的GM1粗提液对溶液A充分透析，离心除去少许不溶物，得到上样液，将此上样液流加到柱上；再以3倍柱体积的溶液A流洗，除去未被吸附的中性脂类，再以1倍体积的甲醇洗柱；最后用醋酸铵甲醇溶液进行线性梯度洗脱，收集含有GM1的组分。

吸附层析将离子交换层析得到的含有GM1的组分对去离子水充分透析，冷冻干燥后溶于氯仿/甲醇/水(60∶40∶2V/V溶液B)溶液中，将此溶解液流加到用溶液B平衡的Iatrobeads层析柱上，然后用3倍柱体积的溶液B洗去未吸附的杂质，再用溶液B和氯仿/甲醇/水(30∶70∶4V/V溶液C)进行线性梯度洗脱。收集含有GM1的组分，对去离子水透析后除菌过滤，滤液冷冻干燥得到GM1纯品。

经HPLC法测定纯度大于96％。每1Kg脑组织可以得到GM1约120mg。

实施例11 GM1的纯化方法

DEAE-Spharose琼脂糖层析：层析柱垂直固定在支架上，预先加入1500ml0.02mol/L pH 7.4 Tris-HCl起始缓冲液排除管道中的气泡，接上恒流泵。将用0.02mol/L pH 7.4 Tris-HCl起始缓冲液平衡好的DEAE-Spharose凝胶平分为两份。取一份凝胶搅匀后，沿着层析柱内壁缓缓加入，待层析柱下端凝胶沉积2cm高时，打开恒流泵，将流速调至15ml/min，均匀地将第二份凝胶加至胶面高度达45cm处停止装柱。沿柱壁缓慢加入上述缓冲液，注意保持液面平整，安装好上盖，以每分钟15ml的速度平衡10小时以上。

取按照实施例2所述方法制备得到的GM1粗提液，对起始缓冲液透析3次后搅拌均匀，即可上样，控制流速15ml/min，直至全部进样完成，再将进液管接至起始缓冲液，用3倍柱体积洗去未吸附的杂质。用含有1.0mol/LNaCl的起始缓冲液进行直线梯度洗脱，洗脱速度同上。记录分离组分，用唾液酸与间苯二酚盐酸反应法对分离组分进行定性检测，收集阳性反应组分。合并阳性组分于透析袋内用水透析3次除盐即为GM1初步纯化液，冰箱保存备用。

DEAE-Sephadex葡聚糖层析

层析柱垂直固定在支架上，预先加入1500ml 0.02mol/L pH 7.4Tris-HCl起始缓冲液排除管道中的气泡，接上恒流泵。将平衡好的凝胶平分为两份，分别置于两个抽气瓶中。第一瓶加入起始缓冲液200ml，第二瓶加入起始缓冲液350ml，分别抽气20min。取一份凝胶搅匀后，沿着层析柱内壁缓缓加入，待层析柱下端凝胶沉积2cm高时，打开恒流泵，将流速调至1.0ml/min，均匀地将第二瓶凝胶加至胶面高度达160cm处停止装柱。沿柱壁缓慢加入起始缓冲液，注意保持液面平整，安装好上盖，以每分钟1ml的速度平衡50小时以上。将冰箱备存的GM1初步纯化液装入截留分子量10KD的透析袋，用聚乙二醇作为反渗透剂浓缩至约500ml。对起始缓冲液透析三次，搅拌均匀。上样，控制流速1.5ml/min，直至全部进样完成，用灭菌注射用水配制的起始缓冲液进行平衡洗脱，流速每分钟1.5ml。再用含有1.0mol/L NaCl灭菌注射用水配制的起始缓冲液进行直线梯度洗脱，洗脱速度同上。用紫外吸收仪监测并记录分离组分，用唾液酸与间苯二酚盐酸反应法进行定性检测，收集阳性反应组分于透析袋内用水透析3次除盐即为GM1精制纯化液，再用聚乙二醇浓缩至约1500ml左右，冰箱保存备用。

取上述GM1浓缩液，除菌过滤后，分装，冷冻干燥，即得单唾液酸四己糖神经节苷脂原料药。

每1Kg脑组织可以得到GM1约200mg，经HPLC法检测纯度大于98％。

GM1的制剂方法

实施例12 GM1注射液的制备(2ml∶20mg)

取实施例10制备的GM1，检验合格后，称取21.5g，加入NaH₂PO₄·H₂O2.56g，Na₂HPO₄0.48g，NaCl 17.2g，加注射用水至2150ml，搅拌溶解后除菌过滤，滤液分装入棕色安瓿瓶中，每只装2.15ml，熔封后于121℃湿热灭菌15分钟。检验合格后即为GM1注射液。

实施例13 GM1注射液的制备(5ml∶50mg)

取实施例11制备的GM1，检验合格后，称取53.0g，加入NaH₂PO₄·H₂O6.31g，Na₂HPO₄1.18g，NaCl 42.4g，加注射用水至5300ml，搅拌溶解后除菌过滤，滤液分装入棕色安瓿瓶中，每只装5.30ml，熔封后于121℃湿热灭菌15分钟。检验合格后即为GM1注射液。

实施例14 GM1注射液的制备(10ml∶100mg)

取实施例11制备的GM1，检验合格后，称取105g，加入NaH₂PO₄·H₂O12.5g，Na₂HPO₄ 2.34g，NaCl 84.0g，加注射用水至10500ml，搅拌溶解后除菌过滤，滤液分装入棕色安瓿瓶中，每只装10.5ml，熔封后于121℃湿热灭菌15分钟。检验合格后即为GM1注射液。

实施例15GM1注射液的制备(20ml∶200mg)

取实施例10制备的GM1，检验合格后，称取206g，加入NaH₂PO₄·H₂O24.53g，Na₂HPO₄ 4.60g，NaCl 164.8g，加注射用水至20600ml，搅拌溶解后除菌过滤，滤液分装入棕色安瓿瓶中，每只装20.6ml，熔封后于121℃湿热灭菌15分钟。检验合格后即为GM1注射液。

实施例16GM1冻干粉针的制备(20mg)

取实施例11制备的GM1，检验合格后，称取20g，加入冻干赋形剂(如乳糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖醇、低分子右旋糖苷、水解明胶等)30g，加注射用水至1000ml，搅拌溶解后除菌过滤，滤液分装入管制抗生素瓶中，每只装1ml，置于冷冻干燥机隔板上进行冷冻干燥，冻干结束后压塞，扎盖。检验合格后即为注射用GM1。

实施例17GM1冻干粉针的制备(50mg)

取实施例11制备的GM1，检验合格后，称取50g，加入冻干可接受的赋形剂(如乳糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖醇、低分子右旋糖苷、水解明胶等)100g，加注射用水至2500ml，搅拌溶解后除菌过滤，滤液分装入管制抗生素瓶中，每只装2.5ml，置于冷冻干燥机隔板上进行冷冻干燥，冻干结束后压塞，扎盖。检验合格后即为注射用GM1。

实施例18GM1冻干粉针的制备(100mg)

取实施例10制备的GM1，检验合格后，称取100g，加入冻干可接受的赋形剂(如乳糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖醇、低分子右旋糖苷、水解明胶等)250g，加注射用水至5000ml，搅拌溶解后除菌过滤，滤液分装入管制抗生素瓶中，每只装5ml，置于冷冻干燥机隔板上进行冷冻干燥，冻干结束后压塞，扎盖。检验合格后即为注射用GM1。

GM1的纯度检测

实施例19GM1的纯度检测-HPLC法

色谱条件用氨基键合的硅胶为填充剂，以乙腈-四氢呋喃-0.1mol/L磷酸溶液(66∶8∶34)为流动相；流速为1.0ml/min；进样量20μl；检测波长为205nm。

系统适用性试验量取对照品溶液(1)、对照品溶液(2)、对照品溶液(3)和供试品溶液等量混合，摇匀，作为系统适用性溶液，精密量取40μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按照单唾液酸四己糖神经节苷酯峰计，理论板数不得低于1000；主峰与前后相邻杂质峰的分离度均应大于1.5。

有关物质对照品溶液：精密称取唾液酸对照品适量，加水溶解并稀释制成每1ml含10μg的溶液，摇匀即得有关物质对照品溶液(1)；精密称取杂质1(简称GD1a)对照品适量，加水溶解并稀释制成每1ml含40μg的溶液，摇匀即得有关物质对照品溶液(2)；精密称取杂质2(简称GD3)对照品适量，加水溶解并稀释制成每1ml含20μg的溶液，摇匀即得有关物质对照品溶液(3)。

供试品溶液：取供试品，精密称定，加水制成每1ml中含GM12mg的溶液。

有关物质对照溶液：精密量取供试品溶液2ml，置于50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀(每1ml中含GM1 80μg)。

测定法量取有关物质对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高为满量程的20～30％。再精密量取供试品溶液、有关物质对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的5倍。在供试品溶液记录的色谱图中如出现保留时间与有关物质对照品溶液(1)、(2)、(3)主峰保留时间一致的峰，其主峰峰面积不得大于如下规定：有关物质对照品溶液(1)游离唾液酸不得过0.5％，有关物质对照品溶液(2)GD1a不得过2.0％，有关物质对照品溶液(3)GD3不得过1.0％；且上述各杂质峰(溶剂峰不计)面积总和不得大于有关物质对照溶液主峰面积(4.0％)。

图1为实施例10得到的GM1的纯度检查高效液相色谱图。图2为进口上市产品施捷因的纯度检测液相色谱图。从中可见上市产品施捷因的纯度为96.09％，本发明产品的纯度为98.45％。

GM1的定性检测

实施例20GM1定性检测法-盐酸间苯二酚反应

取供试品约2.0ml，加入间苯二酚-盐酸试液(取2％间苯二酚溶液10ml、2.5％硫酸铜溶液0.25ml、盐酸80ml，加水至100ml)2ml，摇匀，置沸水浴中反应15分钟出现蓝色反应。图4为实施例11得到的GM1的纯度检查高效液相色谱图。

以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。