半滑舌鳎家系构建及优良家系选育方法

摘要

一种半滑舌鳎家系构建及优良家系选育方法，它的技术内容包括半滑舌鳎群体选育，半滑舌鳎家系构建，半滑舌鳎抗病家系及生长快速家系的筛选，本发明采用群体选育和种内杂交技术建立家系，然后采用人工感染途径从大量的家系中筛选出抗鳗弧菌病的家系，通过生长比较筛选出生长快的家系，这些优良家系鱼苗可直接进行推广应用，或用于半滑舌鳎高产抗病优良品种的培育。本发明具有针对性强、选育效率高、操作简单、效果明显等特点，建立的半滑舌鳎优良家系筛选方法为半滑舌鳎高产抗病优良品种培育开辟了新的技术途径，适宜在其它养殖鱼类上进行推广应用，对养殖鱼类高产抗病良种培育具有重要意义和应用价值。

说明书

技术领域：

本发明属于水产养殖领域中的鱼类良种选育方法，是一种能在半滑舌鳎优良品系选育中应用的家系构建和选育方法。

背景技术：

半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海温水性底层鱼类，我国沿海均有分布，以黄海、渤海为多。半滑舌鳎由于其味道鲜美、肉质细嫩、营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。半滑舌鳎是目前海水鱼类养殖的主要品种之一，其养殖产量目前近万吨，价格昂贵，市场价达到200元/1000克左右，半滑舌鳎养殖业目前每年的产值约为20亿元人民币。

但是，随着半滑舌鳎养殖业的快速发展，一些问题相继出现。由于长期近亲繁殖，导致半滑舌鳎人工繁殖的苗种生长速率下降、抗病能力降低，病害发生频繁，导致半滑舌鳎养殖鱼苗和鱼种大量死亡。影响半滑舌鳎的主要病害目前发现的主要包括细菌性和病毒性疾病，而由鳗弧菌引起的细菌性疾病是危害半滑舌鳎较大的一种疾病。每年因病害导致半滑舌鳎养殖业损失数亿元人民币。尽管采取传统的防病措施如使用抗菌素类等药物有一定效果，但这些药物易于使病原菌产生抗药性，同时对养殖环境也产生污染，特别是在鱼体内积累，对人类的健康具有潜在危害，因而在实际生产中的应用越来越受到限制。因此，培育生长速度快、抗病能力强的半滑舌鳎优良品系成为半滑舌鳎养殖业中亟待攻克的重要课题。

鉴于半滑舌鳎的养殖潜力和潜在的经济社会效益，近年来，我国科技工作者对半滑舌鳎生殖调控、性别控制和养殖技术进行了大量研究，主要包括采用人工控制光照和水温的方法刺激半滑舌鳎亲鱼成熟和自然产卵，该项技术于2002年获得成功，并生产出了半滑舌鳎苗种。另外，研究表明，半滑舌鳎雌性个体和雄性个体，在生长速率上存在明显差别，其雌性个体比雄性个体大2-4倍(中国水产科学研究院黄海水产研究所，孟田湘等，1988)，半滑舌鳎鱼苗经过1年养殖后，雌性个体可长到500-750克，而雄性个体则只有50-150克。由于雄性个体生长过慢，影响了商品鱼的质量，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的发展，鉴于此，近年来，国内学者对半滑舌鳎雌核发育和性别控制技术进行了系统研究。如：筛选出半滑舌鳎雌性特异分子标记的研究(中国水产科学研究院黄海水产研究所，Chen SL et al.，2007)，建立了分子标记辅助性别控制技术(Chen SL et al.，2008)，将半滑舌鳎鱼苗的雌性比例由不到50％提高到70％左右；另外，还建立了半滑舌鳎人工雌核发育技术(Chen SL et al.，2009)，从而部分解决了半滑舌鳎雄性生长缓慢的问题。但通过这些技术难以解决半滑舌鳎种质退化和病害频发的问题，而家系选育则是进行抗病高产良种选育的主要手段之一。但到目前为止，有关半滑舌鳎家系建立及其快速生长和抗病力强优良家系筛选方面的研究尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种半滑舌鳎家系构建及抗病快速生长家系筛选的方法，为半滑舌鳎抗病及高产新品种培育提供技术方法，为鱼类养殖业提供抗病及高产新品种选育的技术手段。

本发明技术内容如下：包括：一、半滑舌鳎群体选育；二、半滑舌鳎家系构建；三、半滑舌鳎抗病家系及生长快速家系的筛选。

一、半滑舌鳎群体选育：包括：半滑舌鳎野生群体、人工养殖群体的选育。

野生群体的选育：是收集从渤海湾捕捞的半滑舌鳎鱼苗或鱼种，选择体表没有伤痕，健康活力强的鱼苗或鱼种作为野生群体，放养在水泥池中进行养殖，当鱼苗生长到12-18厘米时，鉴定鱼苗的性别后，将雌、雄鱼苗分开养殖。经过2-3年养殖后，再按照1％的比例分别从雌鱼群体和雄鱼群体中各选出个体大的40-50尾鱼作为雌、雄亲鱼，用于家系构建。

人工养殖群体的选育：人工养殖群体为半滑舌鳎养殖场人工繁殖的鱼苗，从山东等地半滑舌鳎养殖场培育的鱼苗中筛选出生长快的个体进行培育，选择比例为0.5-1％，即从人工养殖2-3年的10000尾半滑舌鳎雌性成鱼中选择最大个体50尾用作雌性亲鱼，从人工养殖2年的2500-5000尾半滑舌鳎雄性成鱼中选择个体大的25-50尾用作雄性亲鱼，经过强化培育后，作为繁殖用亲鱼，用于家系构建。

二、半滑舌鳎家系构建：

从半滑舌鳎野生群体和人工养殖群体中选取性成熟的健康亲鱼，在每年6-9月份通过控温控光诱导亲鱼性腺发育和成熟。当雌鱼腹部明显隆起、性腺长度达到体长的约一半时，对雌雄鱼进行人工催产，获得成熟雄鱼的精液和成熟雌鱼的卵子。利用来自1尾雄鱼的精液和来自1尾雌鱼的卵子进行干法授精，将交配产生的受精卵放在一个具有微流水及微充气的网箱中进行孵化，一个网箱只放一个家系的受精卵。在鱼苗即将孵化出膜时，将其转移到2-3立方米体积的育苗缸中进行培育，每个缸中只放一个家系的鱼苗，每立方米水体培育5000-8000尾仔鱼。每次应该建立20-40个家系，每个家系应该培育500-1000尾鱼苗用于抗病和高产家系的筛选。

三、半滑舌鳎抗病家系及生长快速家系的筛选。

1).半滑舌鳎抗病家系的筛选：

当半滑舌鳎各个家系鱼苗生长至10-12cm时，采用浸泡方法对各个家系鱼苗进行鳗弧菌感染，评价各家系鱼苗的抗鳗弧菌病能力，感染所用的鳗弧菌菌株的培养按照常规方法进行。首先进行预感染实验确定菌液半致死浓度，预感染实验用的鱼苗，为来自10个家系的相同数量鱼苗的混合群体，每个家系取50-100尾鱼苗混合在一起。预感染时，将培养好的菌液用生理盐水稀释成浓度为2.0-3.0OD的菌液，将上述菌液用新鲜海水稀释成不同的浓度(稀释50、100、200、300、400、600倍)，将混合鱼苗随机分成6组，每组80-150尾鱼苗，将每组80-150尾混合家系鱼苗放在一个浓度菌液的海水中浸泡3-5小时后，6组鱼苗放在6个不同菌液浓度的海水中浸泡感染，感染时水温控制在21-23℃，感染后将鱼苗转到微流水及微充气的海水中饲养，在随后的15-20天内计算各个浓度组的鱼苗死亡率，将引起40-60％鱼苗死亡的菌液浓度确定为半致死浓度。

按照半致死浓度进行正式感染实验，感染方法同预感染实验。不同家系分别进行感染，每个家系每次感染50-100尾鱼苗，重复实验1次。感染用鱼养殖在0.3-1m³的玻璃钢水槽中。感染后，每天对各个家系鱼苗的状态及死亡数量进行观察记录，测量死亡个体的全长及体重。在感染后20-30天，记录所有家系的鱼苗存活数量，测量存活鱼苗的全长和体重。根据参加感染鱼苗的数量以及感染后的存活数量，计算各个家系的鱼苗存活率，评价各家系的抗病性能。将成活率在55％以上的家系定义为抗病力强的家系，成活率在40-55％的家系定义为抗病力较强家系，成活率在20-40％的家系定义为抗病力一般的家系，成活率在20％以下的家系定义为抗病力差的家系。

2)、半滑舌鳎快速生长家系的筛选：

当半滑舌鳎各个家系鱼苗生长至全长为10-12cm时，从每个家系未感染的鱼苗中选取200尾，采用荧光颜料标记不同家系的鱼苗，标记后的鱼苗混养在35-40m³的水泥池中。在养殖8-15个月后收集各家系鱼苗进行全长和体重测量。每个家系的鱼苗采样60-100尾进行测量，计算各个家系全长和体重的平均数。利用日增重率(养殖期间增加的重量/实际养殖时间)评价不同家系的生长性能。日增重率越大，其生长速度越快、生长性能越好。将日增重率在0.25以上的家系确定为快速生长家系，日增重率在0.2-0.25之间的家系确定为较快生长家系；日增重率在0.2以下的家系确定为生长速度一般的家系。

本发明与已有技术对比其特点是：

本发明采用群体选育和种内杂交技术建立家系，然后采用人工感染途径从大量的家系中筛选出抗鳗弧菌病的家系，通过生长比较筛选出生长快的家系，这些优良家系鱼苗可直接进行推广应用，或用于半滑舌鳎高产抗病优良品种的培育。

本发明具有针对性强、选育效率高、操作简单、效果明显等特点，建立的半滑舌鳎优良家系筛选方法为半滑舌鳎高产抗病优良品种培育开辟了新的技术途径，适宜在其它养殖鱼类上进行推广应用，对养殖鱼类高产抗病良种培育具有重要意义和应用价值。

具体实施方式：

下面通过半滑舌鳎家系的构建及快速生长和抗病家系的筛选，对本发明的技术内容进行详细叙述：

本发明技术内容如下：包括：一、半滑舌鳎群体选育；二、半滑舌鳎家系构建；三、半滑舌鳎抗病家系和生长快速家系的筛选。

一、半滑舌鳎群体选育：包括：半滑舌鳎野生群体、人工养殖群体的选育。

野生群体的选育：是收集从渤海湾捕捞的半滑舌鳎鱼苗或鱼种，选择体表没有伤痕，健康活力强的鱼苗或鱼种作为野生群体，放养在水泥池中进行养殖，当鱼苗生长到12-18厘米时，鉴定鱼苗的性别后，将雌、雄鱼苗分开养殖。经过2-3年养殖后，再按照1％的比例分别从雌鱼群体和雄鱼群体中各选出个体大的40-50尾鱼作为雌、雄亲鱼，用于家系构建。

人工养殖群体的选育：人工养殖群体为半滑舌鳎养殖场人工繁殖的鱼苗，从山东等地半滑舌鳎养殖场培育的鱼苗中筛选出生长快的个体进行培育，选择比例为0.5-1％，即从人工养殖2-3年的10000尾半滑舌鳎雌性成鱼中选择最大个体50尾用作雌性亲鱼，从人工养殖2年的2500-5000尾半滑舌鳎雄性成鱼中选择个体大的25-50尾用作雄性亲鱼，经过强化培育后，作为繁殖用亲鱼，用于家系构建。

本发明是从2003年10月开始，大量收集从渤海湾捕捞的半滑舌鳎鱼苗或鱼种进行养殖，共收集和养殖了8000多尾野生鱼苗，当这些鱼苗生长到13厘米以上时，鉴定鱼苗的性别后，将雌、雄鱼苗分开养殖，经过3-4年的人工养殖，于2007年从中筛选出快速生长的雌性成鱼40多尾和雄性成鱼40多尾，放养在不同水泥池中进行养殖，用于人工催产和家系构建。人工养殖群体为从山东等地半滑舌鳎养殖场养殖的人工繁殖的10000多尾雌性鱼苗中筛选出生长最快的雌性成鱼50多尾，和从5000多尾雄性鱼苗中筛选出雄性成鱼50多尾，用于人工催产和家系构建。经过强化培育后达到性成熟，挑选个体大、无外伤、性腺发育良好，具有活力的个体作为繁殖用鱼。

二、半滑舌鳎家系构建：

利用筛选出的半滑舌鳎野生群体和人工养殖群体作为基础群体，采用种内杂交的方法建立半滑舌鳎家系。从半滑舌鳎野生群体和人工养殖群体中选取性成熟的健康亲鱼，在每年6-9月份通过控温控光诱导亲鱼性腺发育和成熟。当雌鱼腹部明显隆起、性腺长度达到体长的约一半时，对雌雄鱼进行人工催产，获得成熟雄鱼的精液和成熟雌鱼的卵子。利用来自1尾雄鱼的精液和来自1尾雌鱼的卵子进行干法授精，将来自一尾雄鱼和一尾雌鱼交配产生的受精卵(即一个家系)放在一个具有微流水及微充气的网箱中进行孵化，一个网箱只放一个家系的受精卵。在鱼苗即将孵化出膜时，将其转移到2-3立方米体积的育苗缸中进行培育，每个缸中只放一个家系的鱼苗，每立方米水体培育5000-8000尾仔鱼。每次应该建立20-40个家系，每个家系应该培育500-1000尾鱼苗用于抗病和高产家系的筛选。

本发明中的半滑舌鳎家系建立于2008年9月和10月，主要在山东省莱州明波水产有限公司进行家系构建和养殖。采用野生群体和养殖群体2个繁殖群体中可以挤出精液和催产出卵子的鱼作为建立家系的亲本。用于建立家系的野生雄性半滑舌鳎亲鱼为27尾；养殖群体雄性半滑舌鳎亲鱼4尾；雌性半滑舌鳎亲鱼共35尾。人工采集精卵干法授精，共建立半滑舌鳎半同胞和全同胞家系35个。将这些家系鱼苗分别进行养殖，其养殖按照常规方法进行。

三、半滑舌鳎优良家系的筛选

1).半滑舌鳎抗病家系的筛选：

当半滑舌鳎各个家系鱼苗生长至10-12cm时，采用浸泡方法对各个家系鱼苗进行鳗弧菌感染，评价各家系鱼苗的抗鳗弧菌病能力，感染所用的鳗弧菌菌株的培养按照常规方法进行。首先进行预感染实验确定菌液半致死浓度，预感染实验用的鱼苗，为来自10个家系的相同数量鱼苗的混合群体，每个家系取50-100尾鱼苗混合在一起。预感染时，将培养好的菌液用生理盐水稀释成浓度为2.0-3.0OD的菌液，将上述菌液用新鲜海水稀释成不同的浓度(稀释50、100、200、300、400、600倍)，将混合鱼苗随机分成6组，每组80-150尾鱼苗，将每组80-150尾混合家系鱼苗放在一个浓度菌液的海水中浸泡3-5小时后，6组鱼苗放在6个不同菌液浓度的海水中浸泡感染，感染时水温控制在21-23℃，感染后将鱼苗转到微流水及微充气的海水中饲养，在随后的15-20天内计算各个浓度组的鱼苗死亡率，将引起40-60％的鱼苗死亡菌液浓度确定为半致死浓度。

按照半致死浓度进行正式感染实验，感染方法同预感染实验。不同家系分别进行感染，每个家系每次感染50-100尾鱼苗，重复实验1次。感染用鱼养殖在0.3-1m³的玻璃钢水槽中。感染后，每天对各个家系鱼苗的状态及死亡数量进行观察记录，测量死亡个体的全长及体重。在感染后20-30天，记录所有家系的鱼苗存活数量，测量存活鱼苗的全长和体重。根据参加感染鱼苗的数量以及感染后的存活数量，计算各个家系的鱼苗存活率，评价各家系的抗病性能。将成活率在55％以上的家系定义为抗病力强的家系，成活率在40-55％的家系定义为抗病力较强家系，成活率在20-40％的家系定义为抗病力一般的家系，成活率在20％以下的家系定义为抗病力差的家系。

本发明于2009年对2008年建立的半滑舌鳎家系进行了感染实验。共感染了18个家系。按照上述标准，我们从18个家系中筛选出抗病力强的家系2个(家系2号和12号)，其感染后平均存活率分别为79.25％和56.85％，高于其它家系。从18个家系中还获得抗病力比较强的家系4个(3号，10号，14号和19号)，抗病力一般的家系5个(家系6号，7号，15号，16号和30号)，以及抗病力差的家系1个(表1)。

表1：半滑舌鳎不同家系鱼苗抗鳗弧菌病能力比较

2).半滑舌鳎快速生长家系的筛选：

当半滑舌鳎各个家系鱼苗生长至全长为10-12cm时，从每个家系中选取200尾鱼苗，采用荧光颜料标记不同家系的鱼苗，标记后的鱼苗混养在35-40m³的水泥池中。在养殖8-15个月后收集各家系鱼苗进行全长和体重测量。每个家系的鱼苗采样60-100尾进行测量，计算各个家系全长和体重的平均数。利用日增重率(养殖期间增加的重量/实际养殖时间)评价不同家系的生长性能。日增重率越大，其生长速度越快、生长性能越好。将日增重率在0.25以上的家系确定为快速生长家系，日增重率在0.2-0.25之间的家系确定为较快生长家系；日增重率在0.2以下的家系确定为生长速度一般的家系。通过这种方法就可以筛选出快速生长的家系。

本发明中进行了18个家系的生长比较实验。经过一年多的培育，对2008年建立并混合养殖的的18个家系鱼苗的体重和全长进行了测量，获得了各个家系鱼苗的全长、体重等性状的平均值和标准差(表2)。其中，15号家系的平均体重和平均体长最高，28号家系平均体长和平均体重最低。多重比较结果表明15号家系体重明显大于其它家系。考虑到家系建立的时间先后，利用日增重率评价不同家系的生长性能。从日增重率来看，15号家系的日增重率最高，为0.260，按照上述标准，将15号家系确定为快速生长家系；而6号、7号、16号和30号等4个家系的日增重率分别为0.217，0.229，0.246和0.208，应该为生长较快家系；而1号、3号、4号、10号、12号、14号19号、24号、27号，28号、33号和34号家系的日增重率均在0.2以下，被确定为生长速度一般的家系。

表2半滑舌鳎不同家系鱼苗的体长、体重平均值、标准差和日增重率

采用上述方法，我们构建了半滑舌鳎家系，并从中筛选出抗病力强和生长快速的家系，这些优良家系鱼苗可以直接进行推广应用，也可以用于高产抗病优良品种培育。