阿萨希毛孢子菌2-1及其在制备丙烯酸中的应用

摘要

本发明提供了一株丙烯酰胺酶的菌株——阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)2-1，及其在制备丙烯酸中的应用。所述阿萨希毛孢子菌2-1保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2010年01月19日，保藏编号CCTCC No：M2010017。本发明通过筛选得到一株产酰胺酶的新菌株，经过诱变改良得到酰胺酶酶活明显提高的诱变菌株，并以此突变菌株来生物法制备丙烯酸，代替化学合成的方法。具有转化率高，环境友好，过程绿色等优点。同时该菌株可以利用高毒的脂肪氰类化合物、丙烯酰胺水解成毒性较小酸类物质，为处理工业废水中脂肪睛、酰胺类化合物一种最经济、最有效的方法，因此本发明在环境治理上也具有重要的现实意义。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株丙烯酰胺酶的菌株——阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)2-1，及其在制备丙烯酸中的应用。

(二)背景技术

阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)为半知菌门，芽孢纲，隐球酵母目，隐球酵母科，丝胞酵母菌属。

酰胺酶(amidase，EC 3.5.1.4)能将酰胺水解成相对应的羧酸和氨。丙烯酰胺酶催化丙烯酰胺水解为丙烯酸和氨。丙烯酸(C₃H₄O₂)是无色，带有刺激性气味的液体，其具有高聚合性能，既可以自身均聚，又可以与其它乙烯基单体如苯乙酸、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯睛、丙烯酰胺、氯乙烯等共聚，可以制成各种不同性能的丙烯酸类树脂或聚丙烯酸盐类等系列产品，这些产品广泛应用于涂料、塑料、纺织、皮革、造纸、建材等工业，因此是重要的化工产品之一。

丙烯酸历史上曾经用氯乙醇法、氰乙醇法、高压Reppe法、烯酮法等，现今主要采用丙烯腈水解法和丙烯直接氧化法两种方法，其中丙烯直接氧化法产能占总产量的85％以上。

丙烯腈水解法制备丙烯酸是法国Ugine Kuhlamnn公司开发，工艺的反应过程是丙烯腈先经硫酸水解生成丙烯酰胺，再在酸性条件下生成相应的丙烯酸，该生产工艺过程简单，反应条件温和，设备投资少，同时该流程具有污染严重、副产品含有大量低值的硫酸铵等缺点。丙烯直接氧化法生产丙烯酸由公司率先建成，该生产工艺在合成中分两步进行：第一步，丙烯被氧化成丙烯醛；第二步，丙烯醛被进一步氧化成丙烯酸。该反应工艺丙烯酸的收率较高，单程收率能达到85％，但该反应能耗高、设备要求高、易污染。

目前报道的生物法生产主要有乳酸水解、丙烯腈水解法，但所采用的菌株主要为细菌，以酵母的酰胺酶来生产丙烯酸的研究未见报道。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供可将丙烯酰胺水解为丙烯酸的阿萨希毛孢子菌新菌株及其在制备丙烯酸中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种丙烯酰胺酶的菌株——阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)2-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2010年01月19日，保藏编号CCTCC No：M2010017。

阿萨希毛孢子菌2-1菌落形态为椭圆，乳白色半透明，表明光滑，周边有散射线状，中间有隆起。单个细胞椭圆至柱状，细胞大小为4.5～15×2～5um。

阿萨希毛孢子菌2-1由以下途经筛选得到：

所采用的富集培养基，其配方如下：丙烯酸20.0g，蔗糖20.0g，酵母膏10g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 1.0，MgSO4.7H₂O 0.2，FeSO₄ 0.01，pH 7.0。

用于筛选微生物的土样来自浙江省内各种可分离到微生物的样品，如果园、树林、农田、污水处理站等。

称取5g土样于50mL生理盐水中，用玻璃珠振荡打碎，取悬浊液5mL于装有30mL富集培养基的三角瓶中，置于摇床30℃、150r/min培养2天，1000rpm离心5分钟，取上清液稀释成10^-1、10^-2、10^-3三个梯度进行涂布，吸取各梯度稀释液涂平板(0.1mL/平板)。涂布完毕后置于生化培养箱中30℃培养，培养2-3后，待长出合适大小的单菌落后，根据形态上的差异随机挑取单菌落接种试管斜面并分别编号，置生化培养箱中30℃培养至长满整个斜面。

从已长好的试管斜面上挑取一环菌体至装有30mL发酵产酶培养基的250mL三角瓶中，摇瓶培养均在30℃，摇床转速150r/min。培养20h后吸取3mL菌体加入诱导培养基中培养24h，诱导培养基成份为：丙烯酸3.0～10.0g，蔗糖10.0～20.0g，酵母膏0.0～15.0g，尿素0.0～5.0g，NaCl1.0～5.0g，KH₂PO₄ 0.0～1.0g，MgSO4.7H₂O 0.0～2.0g，FeSO₄ 0.0～1.0g，用去离子水配制，pH 6.5～8.5。培养完成后在6000r/min下离心5分钟收集菌体，并用生理盐水洗涤菌体2次，用灭菌蒸馏水制成1.0g/mL的菌悬液。

用终浓度为0.1M、pH 7.0的磷酸缓冲液20mL的反应终体系含有0.1M丙烯酰胺、0.8g的菌体(湿重)，反应在150mL的三角瓶中，150r/min、30℃条件下进行，5h后取样，离心取上清液进行微孔过滤(水性滤膜)，然后高效液相色谱检测是否有丙烯酸生成，有丙烯酸生成的菌株即为所要的菌株。液相检测条件为：Aglient 1100，C18反向柱(ZORBAX SB-AQ，5um，4.6×250mm)，流动相乙腈∶水＝35∶65，检测波长210nm。

所筛选得到具有很强水解丙烯酰胺能力的菌株阿萨希毛孢子菌ZZB-1菌落形态为椭圆，乳白色半透明，表明光滑，周边有散射线状，中间有隆起。单个细胞椭圆至柱状，细胞大小为4.5～15×2～5um。菌株2-1为阿萨希毛孢子菌ZZB-1的NTG诱变菌株，其酰胺酶酶活力提高了70％。

菌株2-1的18S rDNA序列分析：

以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物Upper primer(5′-AGCCAT GCA TGT CTA AGT ATA AGC-3′)，Lower primer(5′-ACA AAG GGCAGG GAC GTAATC AAC-3′)扩增菌株的18S rDNA基因；反应条件为95℃5min，35循环95℃ 40s，55℃ 60s，72℃ 2min，72℃ 8min；将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，经过PCR扩增成功获得了一条约1.6kb的片段，经过测序确认该片段实际长度为1591bp，其碱基序列如下：

att acaaagggca gggacgtaat caacgcgagc tggtgactca cgcttactag gtattcctcg ttgaagagca

ataattgcaa tgctctatcc ccagcacgac tgagtttcac aagattaccc aaacttctca gttaaggtta taaactcgct

ggctcagtca gtgtagcgcg cgtgcggccc agaacatcta agggcatcac agacctgtta ttgcctcaaa cttccaacag

ctaaacgctg ttagtccctc taagaagtcg acgaccagcc aaagccggcc tgactattta gcaggttaag gtctcgttcg

ttatcggaat taaccagaca aatcactcca ccaactaaga acggccatgc accaccaccc atagaatcaa gaaagagcta

tcaatctgtc aatcctcact atgtctggac ctggtgagtt tccccgtgtt gagtcaaatt aagccgcagg ctccacacct

ggtggtgccc ttccgtcaat tcctttaagt ttcagccttg cgaccatact ccccccagaa cccaaagact ttgatttctc

gtaaggtgcc gatccagtca aaaaataacg tggaccgatc cctagtcggc atagtttact gttaagacta caacggtatc

taatcgtttt tgatccccta accttcgttc ttgatcaatg aaaacgtcct tggcaaatgc tttcgcagtt gttagtcttc

cgtaaatcta agaatttcac ctctagcaac ggaatactaa tgcccccgac cgtccctatt aatcattacg gcgatcctag

aaaccaacaa aatagaaccg cacgtcctat tctattattc catgctaatg tattcgggcg attgcctgct ttgaacactc

taattttctc aaggtaaaat tcctggttcc actgcacact cagtaaagag catacagcct caccaagagg taagactcag

acaaacagtg cgtaccgtaa ggcagaccgt tcctccaagt ccgaagttcg actacgagct ttttaactgc aacaacttta

atatacgcta ctggagctgg aattaccgcg gctgctggca ccagacttgc cctccagttg ttcctcgtta agggatttaa

attgtactca ttccaattat aagacccaat agagccctat attgttattt attgtcacta cctccccgtg tcgggattgg

gtaatttgcg cgcctgctgc cttccttgga tgtggtagcc gtttctcagg ctccctctcc ggaatcgaac cctaattccc

cgttacccgt tgataccatg gtaggcctct atcctaccat cgaaagttga tagggcagat atttgaatga agcatcgccg

gcgcaaggcc atgcgattcg agaagttatt atgaatcacc aagaagaccg aagtcattgg ttttttatct aataaataca

ccccttccag aagtcggggc ttttcagcat gtattagctc tagaattacc acagttaccc atgtagcaag aaaccatcaa

ataaactata actgatttaa tgagccattc gcagtttcac agtatgaatt tgcttatact tagacatgca tggctaat

菌株2-1的ITS DNA序列分析：

以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物S1(5′-TCC GTA GGT GAACCT GCG G-3′)，S2(5′-TCC TCC GCT T A T TGC TAT GC-3′)扩增菌株的ITS DNA基因，反应条件为95℃ 5min，35循环95℃ 40s，55℃ 60s，72℃ 2min，72℃ 8min；将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，经过PCR扩增成功获得了一条约0.5kb的片段，经过测序确认该片段实际长度为512bp，其碱基序列如下：

GTGGCTGTGATGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACT

GTTCTACTACTTGACGCAAGTCGAGTATTTTTACAAACAATGTGTAATGAACGT

CGTTTTATTATAACAAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCAT

CGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTG

AATCATCGAATCTTTGAACGCAGCTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGC

CTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTCCTAATGGATTGGATTT

GGGCGTCTGCGATTTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTTTGACATT

AATGTCTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTAA

TCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGACTCTGGCCTGAAATCAGGTAGGACTACCC

GCTGAACTTAAGCATAGCAAAAGGCGG

将18srDNA序列与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，与阿萨希毛孢子菌属的同源性最高(homology，99％，based on 18srDNA)。同已知的真菌的18s rDNA序列进行对比，利用MegAlign software软件构建进化树(见图1)，确定菌株2-1的进化地位。将2-1菌株的ITS序列与将18srDNA序列与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，与阿萨希毛孢子菌PUMCHBY12、PUMCH8R5548、PUMCHBY26同源性最高(homology，99％，based on ITS sequence)。同已知的真菌的ITS序列进行对比，利用MegAlign software软件构建进化树(见图2)，确定菌株2-1种的名称为阿萨希毛孢子菌2-1。

本发明还涉及所述的阿萨希毛孢子菌2-1在制备丙烯酰胺酶中的应用。所述的阿萨希毛孢子菌2-1可进一步应用于制备丙烯酸。

具体的，所述应用为：以丙烯酰胺为底物，以阿萨希毛孢子菌2-1经发酵培养获得的丙烯酰胺酶为催化剂，进行水解反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到所述丙烯酸。

丙烯酰胺：英文名为acrylamide，结构式为CH₂＝CHCONH₂，分子量71.08，为无色片状晶体，沸点为125℃(3325Pa)，溶于水、丙酮、乙醇，不溶于苯。在熔点或紫外光照射下易聚合，受高热分解放出腐蚀性气味，对中枢神经有危害。

丙烯酸：英文名为acrylic acid，结构式为CH₂＝CHCOH，分子量为72.06，为无色液体，有刺激性气味，熔点13.5℃，沸点141℃(101.3kPa)。能溶于水、乙醇、乙醚等。有较强腐蚀性。

所述的应用是将阿萨希毛孢子菌2-1菌株接种到合适的培养基中进行发酵培养获得高产丙烯酰胺酶的微生物细胞，然后对发酵液进行离心或过滤，得到菌体，将菌体细胞或处理过的菌体细胞添加到含有丙烯酰胺的溶液中进行催化反应，最后对转化液进行分离，即得到所述丙烯酸的水溶液。所述处理过的菌体细胞是指经过处理后得到的粗酶、固定化细胞。

用于本发明的阿萨希毛孢子菌2-1菌种的培养基是一些含有可以被上述菌体利用营养物质，培养基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、无机盐等。作为碳源的有：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇等。作为氮源的有：酵母膏、酵母粉、大豆粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、氨盐(硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸铵等)。无机盐类有：Na、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Co、Ni等金属盐类和磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等有机酸盐类；另可加有：氨基酸类(如谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸等)、维生素(V_B1、V_B2、V_B12、V_C、V_E、烟酸等)、核酸类(如嘌呤、嘧啶及其衍生物等)。用无机酸或有机酸、碱类调节培养基的pH值。

所述发酵培养的发酵培养基终浓度组成如下：丙烯酸3.0～10.0g/L，蔗糖10.0～20.0g/L，酵母膏0.01～15.0g/L，尿素0.01～5.0g/L，NaCl1.0～5.0g/L，KH₂PO₄ 0.01～1.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.01～2.0g/L，FeSO₄0.01～1.0g/L，溶剂为水，pH 6.5～8.5。

所述水解反应条件如下：反应温度5～45℃，反应pH 5.0～10.0，反应时间2～20h。最适反应温度为32～35℃、pH 9.0～9.5，底物的转化率可达到98％。加入底物丙烯酰胺的方式有多种，可以一次性加入，也可以逐渐地，以可控制的方式连续加入丙烯酰胺，底物的浓度最大可达到50g/L。丙烯酰胺在细胞或处理过的细胞催化作用下转化为丙烯酸，转化体系中大约含有0.02～0.1％(重量比，以湿重计)的鲜细胞和大约0.5％～4.0％的丙烯酰胺。

本发明中作为生物催化剂的微生物细胞或处理过的细胞(粗酶、固定化细胞、固定化酶等)可以重复利用。

所述分离纯化方法如下：反应结束后，离心回收反应液中的菌体细胞，剩余清夜用乙酸异丁酯萃取，萃取液经过精馏塔精馏回收乙酸异丁酯，即得所述的丙烯酸。

具体的，应用方法如下：

(1)种子培养：取种子培养基，接种阿萨希毛孢子菌2-1，摇床转速150r/min，28℃培养20h作为种子液；所述种子培养基终浓度组成如下：丙烯酸1.0g/L，蔗糖15.0g/L，葡萄糖5.0g/L，酵母膏10g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.2g/L，FeSO₄ 0.01g/L，用去离子水配制，pH用氨水调至7.0；培养方式可以为：摇动培养、或通风搅拌培养等。大量生产菌体时宜采用深层通风搅拌培养。

(2)发酵培养：取发酵培养基，按照2～8％体积比接种种子液，25～45℃下培养18～48h，得到发酵液；所述发酵培养基终浓度组成如下：丙烯酸3.0～10.0g/L，蔗糖10.0～20.0g/L，酵母膏0.01～15.0g/L，尿素0.01～5.0g/L，NaCl 1.0～5.0g/L，KH₂PO₄ 0.01～1.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.01～2.0g/L，FeSO₄ 0.01～1.0g/L，溶剂为水，pH 6.5～8.5；

(3)催化水解：发酵液离心收集菌体，用pH 7.0～8.0磷酸盐缓冲液配制成菌悬液，加入丙烯酰胺，反应体系中丙烯酰胺初始浓度为1～50g/L，菌体浓度以湿重计为1～20g/L，20～40℃水浴中转化5～10h；

(4)产物分离：转化液离心回收菌体，离心上清液经乙酸异丁酯萃取，萃取液经过精馏塔精馏去除溶剂，剩余液即为所述的丙烯酸。

可以用高效液相色谱(HPLC)等的分析方法对转化液中的丙烯酰胺和丙烯酸进行分析。高效液相色谱(HPLC)分析方法如下：HPLC1100，C18反向柱(ZORBAX SB-AQ，5um，4.6×250mm)，流动相为乙腈∶水＝35∶65，检测波长为210nm。

本发明的有益效果主要体现在：通过筛选得到一株产酰胺酶的新菌株，经过诱变改良得到酰胺酶酶活明显提高的诱变菌株，并以此突变菌株来生物法制备丙烯酸，代替化学合成的方法。具有转化率高，环境友好，过程绿色等优点。同时该菌株可以利用高毒的脂肪氰类化合物、丙烯酰胺水解成毒性较小酸类物质，为处理工业废水中脂肪睛、酰胺类化合物一种最经济、最有效的方法，因此本发明在环境治理上也具有重要的现实意义。

(四)附图说明

图1为基于18S rDNA序列的进化树；

图2为基于ITS序列的进化树。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

种子培养基配方：丙烯酸1.0g，蔗糖15.0g，葡萄糖5.0g，酵母膏10g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，FeSO₄ 0.01g，用去离子水配制，pH用氨水调至7.0，总量为1L。

发酵培养基：丙烯酸10.0g，蔗糖20.0g，酵母膏5.0g，NaCl 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO4.7H₂O 0.2g，FeSO₄ 0.1g，用去离子水配制，pH用氨水调至7.0，总量为1L。

取120mL上述种子培养基，平均分装在4个250mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种阿萨希毛孢子菌2-1，摇床转速150r/min，30℃摇床培养20h作为种子液，备用。

取1L上述发酵培养基，平均分配装入10个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为2％(V/V)，进行培养，培养温度为30℃，培养时间为20h，摇床转速为150r/min。

培养完成后，将发酵液在5000r/min，15℃离心5min收集菌体，并将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，进行转化反应。反应体系为100mL，包含有：底物终浓度为0.1M(7.1g/L)、pH为7.0磷酸缓冲液(终浓度为50mM)、4.3g菌体细胞(湿重)，30℃、摇床培养5h后，离心除去转化液中的细胞，用高效液相色谱检测。得到丙烯酰胺的转化率为95％，将转化液离心除去细胞，上清液采用150ML的乙酸异丁酯(3∶1发酵液)萃取发酵液2次，萃取液混合于精馏塔中精馏，除去乙酸异丁酯，剩余液即是丙烯酸。丙烯酰胺转化的最终产率在89.5％。

实施例2：

种子培养基组成及种子培养同实施例1。

发酵产酶培养基配方：丙烯酸5.0g，蔗糖15.0g，酵母膏5.0g，尿素1.0g，NaCl 1.0g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，FeSO₄ 0.1g，用去离子水配制，pH用氨水调至7.0，总量为1L；

取1L上述发酵培养基，平均分配装入10个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为2％(V/V)，进行培养，培养温度为30℃，培养时间为20h，摇床转速为150r/min。

培养完成后，将发酵液在5000r/min，15℃离心5min收集菌体，并将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，进行转化反应。反应体系为100mL，包含有：底物终浓度为0.1M(7.1g/L)、pH为8.0磷酸缓冲液、4.3g菌体细胞(湿重)、30℃、摇床培养5h后，离心除去转化液中的细胞，用高效液相色谱检测。得到丙烯酰胺的转化率为96％，将转化液离心除去细胞，上清液采用150ML的乙酸异丁酯(3∶1发酵液)萃取发酵液2次，萃取液混合于精馏塔中精馏，除去乙酸异丁酯，剩余液即是丙烯酸。丙烯酰胺转化的最终产率在89.9％。

实施例3：

种子培养基组成及种子培养同实施例1。

发酵产酶培养基配方：丙烯酸3.0g，蔗糖15g，酵母膏5.0g，尿素2.0g，NaCl 1.0g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，FeSO₄ 0.2g，用去离子水配制，pH用氨水调至8.0，总量为1L。

取1L上述发酵培养基，平均分配装入10个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为2％(V/V)，进行培养，培养温度为30℃，培养时间为20h，摇床转速为150r/min。

培养完成后，将发酵液在5000r/min，15℃离心5min收集菌体，并将菌体悬浮于缓冲液中，进行转化反应。反应体系为100mL，包含有：底物终浓度为0.1M(7.1g/L)、pH为9.0甘氨酸-NaOH(50mM)缓冲液、4.3g菌体细胞(湿重)、30℃、摇床培养5h后，离心除去转化液中的细胞，用高效液相色谱检测。得到丙烯酰胺的转化率为99％，将转化液离心除去细胞，上清液采用150ML的乙酸异丁酯(3∶1发酵液)萃取发酵液2次，萃取液混合于精馏塔中精馏，除去乙酸异丁酯，剩余液即是丙烯酸。丙烯酰胺转化的最终产率在92.0％。

实施例4：

种子培养基组成及种子培养同实施例1。

发酵产酶培养基配方：丙烯酸5.0g，蔗糖10.0g，酵母膏2.0g，尿素4.0g，NaCl 1.0g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO4.7H₂O 0.5g，FeSO₄ 0.2g，用去离子水配制，pH用氨水调至8.0，总量为1L。

取1L上述发酵培养基，平均分配装入10个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为2％(V/V)，进行培养，培养温度为30℃，培养时间为20h，摇床转速为150r/min。

培养完成后，将发酵液在5000r/min，15℃离心5min收集菌体，并将菌体悬浮于缓冲液中，进行转化反应。反应体系为100mL，包含有：底物终浓度为0.1M(7.1g/L)、pH为9.5的甘氨酸-NaOH缓冲液(50mM)、4.3g菌体细胞(湿重)、30℃、摇床培养5h后，离心除去转化液中的细胞，用高效液相色谱检测。得到丙烯酰胺的转化率为99％，将转化液离心除去细胞，上清液采用150ML的乙酸异丁酯(3∶1发酵液)萃取发酵液2次，萃取液混合于精馏塔中精馏，除去乙酸异丁酯，剩余液即是丙烯酸。丙烯酰胺转化的最终产率在91.5％。

实施例5：

种子培养基组成及种子培养同实施例1。

发酵产酶培养基配方：丙烯酸10.0g，蔗糖20.0g，酵母膏1.0g，尿素5.0g，NaCl 1.0g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，FeSO₄ 0.2g，用去离子水配制，pH用氨水调至8.0，总量为1L。

取1L上述发酵培养基，平均分配装入10个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为2％(V/V)，进行培养，培养温度为30℃，培养时间为20h，摇床转速为150r/min。

培养完成后，将发酵液在5000r/min，15℃离心5min收集菌体，并将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，进行转化反应。反应体系为100mL，包含有：底物终浓度为0.1M(7.1g/L)、pH为9.5甘氨酸-NaOH(50mM)、4.3g菌体细胞(湿重)、30℃、摇床培养5h后，离心除去转化液中的细胞，用高效液相色谱检测。得到丙烯酰胺的转化率为99％，将转化液离心除去细胞，上清液采用150ML的乙酸异丁酯(3∶1发酵液)萃取发酵液2次，萃取液混合于精馏塔中精馏，除去乙酸异丁酯，剩余液即是丙烯酸。丙烯酰胺转化的最终产率在91.6％。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江工业大学

 

<120>阿萨希毛孢子菌2-1及其在制备丙烯酸中的应用

 

<130>

 

<160>6

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>Unknown

 

<220>

<223>人工序列

 

<400>1

agccatgcat gtctaagtat aagc                                            24

 

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>Unknown

 

<220>

<223>人工序列

 

<400>2

acaaagggca gggacgtaat caac                                            24

 

<210>3

<211>1591

<212>DNA

<213>Trichosporon asahii

 

<400>3

attacaaagg gcagggacgt aatcaacgcg agctggtgac tcacgcttac taggtattcc     60

tcgttgaaga gcaataattg caatgctcta tccccagcac gactgagttt cacaagatta    120

cccaaacttc tcagttaagg ttataaactc gctggctcag tcagtgtagc gcgcgtgcgg    180

cccagaacat ctaagggcat cacagacctg ttattgcctc aaacttccaa cagctaaacg    240

ctgttagtcc ctctaagaag tcgacgacca gccaaagccg gcctgactat ttagcaggtt    300

aaggtctcgt tcgttatcgg aattaaccag acaaatcact ccaccaacta agaacggcca    360

tgcaccacca cccatagaat caagaaagag ctatcaatct gtcaatcctc actatgtctg    420

gacctggtga gtttccccgt gttgagtcaa attaagccgc aggctccaca cctggtggtg    480

cccttccgtc aattccttta agtttcagcc ttgcgaccat actcccccca gaacccaaag    540

actttgattt ctcgtaaggt gccgatccag tcaaaaaata acgtggaccg atccctagtc    600

ggcatagttt actgttaaga ctacaacggt atctaatcgt ttttgatccc ctaaccttcg    660

ttcttgatca atgaaaacgt ccttggcaaa tgctttcgca gttgttagtc ttccgtaaat    720

ctaagaattt cacctctagc aacggaatac taatgccccc gaccgtccct attaatcatt    780

acggcgatcc tagaaaccaa caaaatagaa ccgcacgtcc tattctatta ttccatgcta    840

atgtattcgg gcgattgcct gctttgaaca ctctaatttt ctcaaggtaa aattcctggt    900

tccactgcac actcagtaaa gagcatacag cctcaccaag aggtaagact cagacaaaca    960

gtgcgtaccg taaggcagac cgttcctcca agtccgaagt tcgactacga gctttttaac   1020

tgcaacaact ttaatatacg ctactggagc tggaattacc gcggctgctg gcaccagact   1080

tgccctccag ttgttcctcg ttaagggatt taaattgtac tcattccaat tataagaccc   1140

aatagagccc tatattgtta tttattgtca ctacctcccc gtgtcgggat tgggtaattt   1200

gcgcgcctgc tgccttcctt ggatgtggta gccgtttctc aggctccctc tccggaatcg   1260

aaccctaatt ccccgttacc cgttgatacc atggtaggcc tctatcctac catcgaaagt   1320

tgatagggca gatatttgaa tgaagcatcg ccggcgcaag gccatgcgat tcgagaagtt   1380

attatgaatc accaagaaga ccgaagtcat tggtttttta tctaataaat acaccccttc   1440

cagaagtcgg ggcttttcag catgtattag ctctagaatt accacagtta cccatgtagc   1500

aagaaaccat caaataaact ataactgatt taatgagcca ttcgcagttt cacagtatga   1560

atttgcttat acttagacat gcatggctaa t                                  1591

 

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>Unknown

 

<220>

<223>人工序列

 

<400>4

tccgtaggtg aacctgcgg                                                  19

 

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

 

<220>

<223>人工序列

 

<400>5

tcctccgctt  attgctatgc                                                20

 

<210>6

<211>512

<212>DNA

<213>Trichosporon asahii

 

<400>6

gtggctgtga tgcctttata ggcttataac tatatccact tacacctgtg aactgttcta     60

ctacttgacg caagtcgagt atttttacaa acaatgtgta atgaacgtcg ttttattata    120

acaaaataaa actttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag aacgcagcga    180

attgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcagct    240

tgcgctctct ggtattccgg agagcatgcc tgtttcagtg tcatgaaatc tcaaccacta    300

gggtttccta atggattgga tttgggcgtc tgcgatttct gatcgctcgc cttaaaagag    360

ttagcaagtt tgacattaat gtctggtgta ataagtttca ctgggtccat tgtgttgaag    420

cgtgcttcta atcgtccgca aggacaatta ctttgactct ggcctgaaat caggtaggac    480

tacccgctga acttaagcat agcaaaaggc gg                                  512