用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片

摘要

本发明公开了一种用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片，是在玻片或硅片或尼龙膜等材料上固定检测细菌的DNA探针，所述探针为序列表SEQ ID NO.1－SEQ IDNO.66所述的核苷酸序列，所述探针所针对的OTU及其代表克隆子Genbank登录号、各OTU最近源菌株及其相似性的关系如表1；利用本发明的群落芯片分析活性污泥微生物群落结构及动态变化，具有适时、灵敏、快速、准确、高效且获得菌群变化信息量大等特点。本发明可以快速分析活性污泥微生物群落结构，同一张芯片可以同时检测代表不同分类层次(门、纲、目、科、属)的57种OTUs。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物芯片，特别是涉及用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片。

背景技术

活性污泥是一种十分复杂的环境样品，它是由细菌等微生物和原生动物、后生动物等微型动物组成的生态系统，因此，活性污泥具有菌群结构多样、菌群功能复杂等特点，而研究活性污泥群落结构及其动态变化对于了解活性污泥菌群分布与功能的关系、环境因素改变对其微生物生态的影响等则具有十分重要的意义。

传统的微生物分析测定方法，包括显微镜微生物形态观察、最可能计数法、选择性培养基计数、纯种分离和生理生化鉴定等，这些方法在环境样品研究中都存在选择性强，工作量大等缺陷且不是所有微生物都能在培养基上生长，因此，不能全面客观的反映复杂菌群的种类和数量，据调查，培养法只能分离培养到某复杂菌群0.1％-10％的菌株。近年来，人们开始应用微生物生物化学分类的一些生物标记包括呼吸链泛醌、脂肪酸等来进行纯种微生物分析，但由于环境样品的复杂性，该类技术仍不适合于由多种细菌组成的环境样品菌群分析。

目前，环境样品微生物菌群研究主要通过DNA指纹图谱技术来实现，包括：变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)、核糖体扩增DNA限制性片断分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)、随意扩增多态性DNA(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)、限制性片断长度多态性分析(Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP)等，这些技术各有优缺点，在不同环境样品微生物菌群分析中均有不同程度的应用，如Smit E.等利用ARDRA技术分析了铜污染对土壤菌群结构和多样性的影响；Susanne L.等则利用DGGE技术研究了脱氮生物反应器中污泥菌群的多样性；柴丽红等应用DGGE法对青海相邻两盐湖中细菌多样性进行了快速检测，Rima B.Franklin等利用RAPD比较区分了不同水样的微生物菌群。DNA指纹图谱技术相对培养的方法快速、简单，通过DNA指纹区别图谱分析可反映出环境样品菌群微生物的变化及其状态，但是该方法仍存在一定问题，主要有：不能提供菌群有关具体组成和变化的具体详细信息、重复性差等。

近年来，也有利用系统寡核苷酸芯片对堆肥、土壤、活性污泥、铀污染含水土层等环境样品进行了微生物检测、菌群动力学的报道，如DeSantis等利用含297,851个16S rDNA探针的高密度芯片对三种环境样品(水、土壤、气溶胶)的微生物种类进行了分析，结果表明该芯片技术虽然不能鉴定新菌种，但在分析环境样品时能比克隆测序方法获得更多的生物多样性。该技术虽在一定程度上克服了DNA指纹图谱技术和传统培养或克隆测序方法的缺陷，但由于有关研究都是建立在有限的可培养微生物的基础上，因此提供的菌群种类信息少，不能全面反映环境样品微生物菌群结构，更为关键的是，它不能及时反映菌群的变化。

操作分类单元(OTU，operational taxonomic units)属于一种分类，位于属和种之间，目前一般的分类标准是将克隆子序列相似性分别大于80％、85％、90％、92％、94％、97％分别归于同一个门、纲、目、科、属、OUT。

截止目前，尚未见利用16S rRNA文库构建获得的克隆子设计基因芯片探针并制备用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的活性污泥微生物群落结构及其动态变化分析技术的不足，提供一种信息量大的能敏感、快速用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片。

本发明的技术方案概述如下：

一种用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片，其特征是在玻片或硅片或尼龙膜等材料上固定检测细菌的DNA探针，所述探针为序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.66所述的核苷酸序列，所述探针所针对的OTU及其代表克隆子Genbank登录号、各OTU最近源菌株及其相似性的关系如表1；

表1：

所述OTU为操作分类单元。

利用本发明的群落芯片分析活性污泥微生物群落结构及动态变化，具有适时、灵敏、快速、准确、高效且获得菌群变化信息量大等特点。本发明可以快速分析活性污泥微生物群落结构，同一张芯片可以同时检测代表不同分类层次(门、纲、目、科、属)的57种OTUs。

附图说明

图1为靶基因16S rDNA的基因结构示意图；

图2为本发明的探针矩阵排列示意图；

图3为各OTU的特异性图谱；

图4为不同C/N下的本发明芯片杂交图谱。

具体实施方式

本发明考虑到死亡细菌RNA的易降解性，因此通过提取RNA进行RT-PCR则更能及时而敏感的反映菌群的动态变化，并且避免死细菌核酸的干扰。为了更全面的反映活性污泥微生物菌群的组成，本发明利用活性污泥16S rRNA基因文库的克隆子设计各操作分类单元(OTU，operational taxonomic units)(属于一种分类，位于属和种之间，目前一般的分类标准是将克隆子序列相似性分别大于80％、85％、90％、92％、94％、97％分别归于同一个门、纲、目、科、属、OTU)代表克隆子的特异性探针，并且通过将各OTU的特异性DNA探针按照一定阵列固定在玻片或硅片或尼龙膜等材料组成本发明的群落芯片。

本发明的一种用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片的技术利用两对通用引物扩增并标记不同活性污泥样品中相应细菌的靶基因，扩增产物与正常成熟活性污泥的微生物群落芯片杂交后，可以检测和分析不同运行条件或功能状态污泥样品中细菌种类的变化。

下面结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。

实施例1

活性污泥RNA的提取

取一定量预处理后的污泥样品并加入溶菌酶(20mg/mL)于37℃作用10min后，加入1mL TRIzol(为商品名称)，漩涡振荡5min后，10000r/min离心10min；取上清加入200μL氯仿，漩涡振荡15s后，10000r/min离心10min；取上清并加入等体积异丙醇，-20℃放置20min；10000r/min离心10min，弃上清；加入75％乙醇洗涤沉淀后，10000r/min离心5min，弃上清并风干沉淀；经少量焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解核酸沉淀后，加入脱氧核糖核酸酶I(无核糖核酸酶污染)并于37℃作用15min；进一步采用RNA纯化试剂盒纯化RNA。其中，所有耗材都要经过DEPC处理及高压灭菌。

实施例2

活性污泥菌群待分析菌株16S rRNA基因片段的获得

(1)利用cDNA试剂盒(Tiangen，中国)获得活性污泥总cDNA；

(2)采用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R

(5’-TACCTTGTTACGACTT-3’)直接扩增总cDNA中的细菌16S rDNA片段；

(3)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara，中国)回收目的片段；

(4)通过TA克隆技术将扩增的16S rDNA片段转化到E.coli DH5α中，蓝白斑筛选挑取450个阳性克隆子，建立16S rDNA克隆文库；

(5)采用RFLP方法对克隆子进行分析，选出酶切带谱不同的重组子进行测序；

(6)根据测序结果，用Blast搜索程序从GenBank等公共数据库中调出相似性较高的相关菌株的16S rRNA基因序列。采用DNAMAN软件进行多序列比对，将克隆子序列相似性大于97％的归于同一个操作分类单元(OTU)并将不同OTU的代表序列提交到GenBank数据库并获得核酸序列注册登录号。

(7)选择各OTU的代表克隆子为研究对象，以pMD18-T载体通用引物(BcaBEST PrimerRV-M：5’-GAGCGGATAATTTCACACAGG-3’与BcaBEST Primer

M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’)为上游引物和下游引物，利用PCR获得活性污泥菌群待分析菌株16S rRNA基因片段。

实施例3

通用引物的设计

以16S rRNA基因为靶基因(图1)

(1)采用DNAMAN软件，对活性污泥样品16S rRNA文库各OTU代表克隆子进行序列比对。得到碱基序列比对图；

(2)根据碱基序列比对图，在16S rRNA基因的保守区设计通用引物；

根据引物设计原则和活性污泥各OTU代表变异区域存在位点，分别选择含有V3可变区的410-600bp区域(A区域)和含有V5、V6可变区的860-1130区域(B区域)为PCR扩增区域。所述引物为2对，分别为：

  编号  序列(5′-3′)  所在区域  A1  ACTCCTACGGGACGCAG  407-423bp  A2  CTGCTGCTGGCACGGAGTTAG  576-596bp  B1  AGGATTAGATACCCTGGTAGTC  853-874bp  B2  CTGACGACAGCCATGCAG  1120-1137bp

实施例4

探针的设计

群落基因芯片技术是一种反相固相杂交技术，其菌群分析功能主要依赖芯片上所固定的特定探针，探针的序列和种类是制备基因芯片的关键。

1)采用DNAMAN软件，对活性污泥样品16S rRNA文库各OTU代表克隆子进行序列比对。得到碱基序列比对图；

2)根据碱基序列比对图，在16S rRNA基因的V3、V5和V6区域设计探针；

设计出各OTU探针后，将候选序列在GenBank数据库中进行比对，筛选出特异性较好的探针并在其5′端加入由15个T组成的断臂分子同时5′末端氨基化修饰。

实施例5

用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片的制备

在玻片或硅片或尼龙膜等材料上固定检测细菌的DNA探针，所述探针为序列表SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.66所述的核苷酸序列，所述探针所针对的OTU及其代表克隆子Genbank登录号、各OTU最近源菌株及其相似性的关系如表1；

1.探针排列

见图2，在图2中：

1，2 OTU2；3 OTU3；4，5 OTU5；6 OTU7，12；7 OTU8，9；8，9 OTU13；10 OTU 16；11，44 OTU17；12 OTU18；13 OTU22；14 OTU30，31，32；15 OTU35；16 OTU36；17，18 OTU37，39；19 OTU40；20 OTU43；21 OTU44，46；22 OTU45；23，24 OTU47；25，26 OTU48；27 OTU50；28，56 OTU51；29 OTU52；30 OTU53，54；31 OTU55；32 OTU59，60；33，59 OTU61；34，60 OTU62，65；35 OTU63；36 OTU66；37，63 OTU68；38，39 OTU69；40，64 OTU70；41 OTU11，71；42 OTU72；43 OTU73；45 OTU20；46OTU 23；47 OTU32；48 OTU 22，34；49，OTU38；50，51 OTU39；52 OTU41；53 OTU42；54 OTU 44，45，46；55 OTU49；57 OTU56；58 OTU57，58；61，62 OTU67；65，66阳性对照；67，阴性对照(50％DMSO).

2.基因芯片的制备过程

采用50％二甲基亚砜溶解探针，使其终浓度为1μg/μL，然后依次转移到384孔板中，将其置于基因芯片点样仪(Spotarray 72)上。启动Spotarray的控制软件，运行程序，按照图2所示的排布方式将各探针点在醛基化的玻片上的点样区内，点之间的距离为5mm，每种探针重复点样3次。将点好样的芯片室温下过夜干燥后，在45℃的烘箱内干燥2h，用交联仪(UVPcl-2000M ultraciolet Crosslinker)600J交联2次后即可使用。

实施例6

荧光待测样品的制备

1.cDNA第一条链的合成

采用随机引物获得活性污泥样品总cDNA。

RT反应体系：

5×AMV buffer          4μL

随机引物(10pmol/μL)   1μL

dNTP(10pmol/μL)       2μL

AMV(5U/μL)            1μL

Rnase抑制剂(40U/μL)   0.5μL

模板(RNA)              5μL

加入DEPC处理水至反应体系总体积为20μL。

反应条件：42℃延伸60min后，72℃处理10min。

2.样品的荧光标记方法

样品的荧光标记采用不对称PCR法。不对称PCR由两轮完成。

第1轮反应体系如下所示。待第1轮反应完成后，将200μLPCR产物采用PCR产物纯化试剂盒纯化并最后定容至50，具体方法按说明书进行。

PCR反应体系：

A1或B1(10pmol/μL )   1μL

A2或B2(10pmol/μL)    1μL

Taq mix               25μL

模板(总cDNA或各OTU的16S rRNA基因片段)    5μL或1μL

加入ddH₂O至反应体系总体积为50μL。

PCR反应条件：94℃，5min；94℃，25s，55℃，25s，72℃，25s，30个循环；72℃，5min。

第2轮反应条件同上。

PCR反应体系：

A2或B2(10pmol/μL)        2μL

Taq                       0.3μL

dNTP(10mmol/L)            0.25μL

Cy3标记的dUTP(25nmol)     0.3μL

5×PCR buffer             5μL

模板(纯化后的一轮PCR产物) 40μL

加入ddH₂O至反应体系总体积为50μL。

实施例7

芯片杂交和检测

将A、B区域二轮PCR扩增产物各1μL与8μL杂交液(Unihyb^TM Telechem公司)混合后，点到基因芯片上探针阵列区域(载玻片已放入杂交盒并盖上盖片)，注意盖片与载玻片之间不可留有气泡，同时向盒内加入100μL水以保持湿度。拧紧杂交盒并放入50℃水浴锅内保温60min后取出杂交盒，拿出玻片，依次将玻片分别放入WBA(1×SSC，10％SDS)、WBB(0.05×SSC，10％SDS)、WBC(0.05×SSC)洗脱液中各洗涤1min。

采用Genepix personal 4100A生物芯片扫描仪对杂交后的微生物群落芯片进行信号扫描和检测，结果分析软件及版本为Genepix Pro6.0，扫描分辨率为10μm，扫描结果分别保存为.giff和.jpg格式。各OTU特异的杂交图谱见图3。

实施例8

用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片的应用

将用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片与发生污泥膨胀之前不同阶段(通过改变进水水质C/N实现污泥膨胀，进水C/N分别为16(I)、41(II)、43(III)、49(IV)、52(V))的污泥PCR产物与同一张芯片上的不同阵列进行杂交，观察污泥膨胀过程中菌群变化情况。不同C/N下的本发明芯片杂交图谱结果见图4。

序列表：

<110>中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所

<120>用于分析活性污泥微生物群落结构及动态变化的群落芯片

<160>66

<210>1

<211>20

<212>DNA    

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(20)

<400>1

tcctttctcg caagagacac 20

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>2

gtgaccgttc cagagatg  18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>3

tatcgcggcc tcagagat  18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>4

ttagcgaccg actccgaa  18

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(20)

<400>5

agaaatgacg cgaaactagg 20

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(16)

<400>6

tgccacgacg acttcc  16

<210>7

<211>15

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(15)

<400>7

cggtcgcggt ttcca 15

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(20)

<400>8

gcgtgttacc cagagagatt 20

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(19)

<400>9

atttggggtc cacttcggt 19

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(23)

<400>10

gtgatcgtag gtttcagaaa tgt 23

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(19)

<400>11

tctaaatcct ggtgcgagc  19

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>12

ggaatcgtcc cagcaatg  18

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(22)

<400>13

tctggaatcc tgaagagatt tg  22

<210>14

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(17)

<400>14

tcgttcggag cagcaat  17

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(22)

<400>15

ataggcaaga aaagtacgag aa 22

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(21)

<400>16

cagagatgcc tttcttcagt t  21

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(21)

<400>17

ctagaaaatg caggaacctg g  21

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(22)

<400>18

gtcgaaaggt cggggtgctc tt  22

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>19

gtatcgaccc ctgctgtg    18

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(20)

<400>20

tagacccttt ccggggttta 20

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(22)

<400>21

actcgtgcta ttcctaggga ta 22

<210>22

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(17)

<400>22

tcgtaagagg cctgtgg  17

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(19)

<400>23

aaactattcc gtcggttcg  19

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(24)

<400>24

taggtattgg aatttaattt cagt 24

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(23)

<400>25

gggaatgatt ttgaaagaag tca 23

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(21)

<400>26

gctgctagga ggtaactttt a 21

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(20)

<400>27

agaaggtgtc tgcggaaatg 20

<210>28

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(19)

<400>28

ggccgtaagg tcagagtcc  19

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(20)

<400>29

tgggtacaga gatgtatcgt 20

<210>30

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>30

cgtgggtgaa agctcatt  18

<210>31

<211>15

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(15)

<400>31

cgagtgccga taccg 15

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(21)

<400>32

tcacacacga acttttcaga g 21

<210>33

<211>15

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(15)

<400>33

cccatgaccg gtcca  15

<210>34

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(22)

<400>34

gtgagtggat atatcggaaa cg 22

<210>35

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>35

caaccggaag tgatgtga  18

<210>36

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(19)

<400>36

tgtagattga caggactgg 19

<210>37

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(17)

<400>37

gcgtctgaca gcttctg 17

<210>38

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(23)

<400>38

ggtttgacat ataccggaaa cat 23

<210>39

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>39

ggggacttcc acgttctc 18

<210>40

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>40

ctcattccac gagatccg  18

<210>41

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>41

cgcaaggaaa ctgtgaga  18

<210>42

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(23)

<400>42

cagggattaa ctctatgaaa gta 23

<210>43

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(22)

<400>43

gaaagggtaa ttccgatcgt ct 22

<210>44

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(21)

<400>44

ataagtcgtg gtgaacatcc a  21

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(20)

<400>45

cagtctctcc taatacgggg 20

<210>46

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(19)

<400>46

caggataata ctctgcgtg  19

<210>47

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>47

aatctcccgg gtgaatac  18

<210>48

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(20)

<400>48

cctttgggtt aatacctcgg 20

<210>49

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(21)

<400>49

tcagggggga atataatgac t 21

<210>50

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(17)

<400>50

gctaatatcc ggcgcga  17

<210>51

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(21)

<400>51

ataagtgccg gctaatatcc g 21

<210>52

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(25)

<400>52

gggtatattg gttaagagct gatat 25

<210>53

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(19)

<400>53

atccagccgg ctaatacct  19

<210>54

<211>

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(25)

<400>54

atgttgatta gagtggaaaa ttaat 25

<210>55

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>55

gtctttctag atcgtctg 18

<210>56

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(19)

<400>56

tacgtgtaga agcctgatg 19

<210>57

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(21)

<400>57

aactagagaa aacccccctt c  21

<210>58

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>58

ctgcggggaa aattgaag 18

<210>59

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(20)

<400>59

aacggttctg cggaactaat  20

<210>60

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(19)

<400>60

acgggattta tcctggact  19

<210>61

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(18)

<400>61

cctacgtgta ggagcttg  18

<210>62

<211>

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(20)

<400>62

agaagcatct atggtgtgta  20

<210>63

<211>16

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(16)

<400>63

tcctgcgggg gggtat  16

<210>64

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(17)

<400>64

gaagaagcgc aagtgac  17

<210>65

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(17)

<400>65

actcctacgg gacgcag  17

<210>66

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(22)

<400>66

aggattagat accctggtag tc 22