从红枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的方法

摘要

本发明涉及一种从红枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的方法，步骤是：将红枣清洗，经过常温浸泡、预煮打浆、果胶混合酶酶解、压滤、阴离子树脂结合、甲酸洗脱、纳滤膜纳滤截留、纯化、得到成品。本发明解决了现有工艺繁杂、周期长、产品纯度低等难题，具有原料来源丰富、工艺简单、处理量大、提取率高、成品纯度高等优点，产品属天然、无毒制品，成品环磷酸腺苷(cAMP)可用于医药原料或用作食品添加剂，提取后的副产物红枣汁可继续红枣深加工，以提升综合开发的产业链，实现无污染生产；本发明将现代纳滤技术应用于工业化生产，不但降低了成本，也给红枣原料的深加工提供了更好的途径，而且极大地减少了能源的消耗，不仅具有重要的经济效益，也具有明显的社会效益。

说明书

技术领域

本发明属于食品加工领域，涉及利用现代纳滤技术从天然植物中提取、浓缩、结晶、纯化得到有效成分的方法，尤其是一种从红枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的方法。

背景技术

环磷酸腺苷(cAMP)由腺嘌呤、核糖和磷酸组成，其分子中磷酸基与核糖的3’和5’位两个羟基构成两个酯键的环状结构，分子量：329.21。众所周知，环磷酸腺苷(cAMP)为某些激素第二信使，具有多种生理功能和药理作用，它能激活心肌细胞内依赖于环磷酸腺苷(cAMP)的蛋白激酶，使底物蛋白磷酸化；对体内某些参与物质氧化过程的酶类有活化作用，从而调节心肌的物质代谢和能量代谢；当机体心肌细胞环磷酸腺苷(cAMP)降低时可引起心肌的物质代谢和能量代谢改变，导致产生不同的心脏疾患。环磷酸腺苷(cAMP)水平下降还可引起血管壁一系列病理改变，包括血浆浸润，细胞增殖，血小板聚集与血栓形成等，同时环磷酸腺苷(cAMP)减少使葡萄糖和蛋白质代谢降低，造成心肌细胞坏死与钙化，引起动脉粥样硬化，心律失常和心肌梗死等心脏疾患。由于环磷酸腺苷(cAMP)对心肌细胞的作用，已经作为治疗心血管疾病的药物，在临床上推广使用。

研究表明，凡是能使细胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量下降的因素均能促进DNA合成和细胞过度生长，而使细胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量升高的因素则可降低细胞生长的速度，抑制细胞的过度增殖，使失去接触抑制的细胞又重新恢复控制性生长。目前认为环磷酸腺苷(cAMP)与肿瘤有相当密切关系：一是引起癌细胞膜通透性改变，当正常细胞在血清因子的调节下通过细胞膜对营养物质进入细胞内的控制而抑制其生长繁殖，而癌细胞环磷酸腺苷(cAMP)水平下降使细胞膜不受血清因子制约，营养物质不断进入细胞使之过度增殖；二是癌细胞膜生化改变，每一种改变最后都能使AC的活性降低，导致环磷酸腺苷(cAMP)水平降低，从而促进细胞分裂与分化而产生恶性变。因此环磷酸腺苷(cAMP)在肿瘤疾病上的应用也使环磷酸腺苷(cAMP)的需求越来越大。

环磷酸腺苷(cAMP)是有机体中广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，对蛋白质的生物合成具有调节控制作用，可广泛参与细胞功能的调节，能舒张平滑肌、扩张血管、改善肝功能、促进神经再生、抑制皮肤外层细胞分裂和转化异常细胞的功能、促进呼吸链氧化酶的活性、改善心肌缺氧等，国外对其生理活性、作用机理进行了大量研究，涉及疾病治疗、信号表达、基因复制等方面，环磷酸腺苷(cAMP)可以通过化学合成、生物发酵、天然产物分离提取等方法获得，而提取天然、无毒副作用的环磷酸腺苷(cAMP)并形成规模化生产势在必行。

我国红枣资源丰富，有700多个品种，其中量多质优、应用价值高的有20多个品种，黄酮类物质、环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)含量丰富而稳定。研究表明，红枣中含有大量的环磷酸腺苷(cAMP)样物质，它的醇提物可增加白细胞中的含量，因此，最大限度地利用高新技术提取红枣中的有效成分并实现工业化生产具有很大的实用价值，提取cAMP后的副产品还可进一步开发红枣饮料及枣纤维制品，做到物尽其用，进一步提升了红枣开发的科技含量和附加值。

目前，从枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的研究及专利申请已有报道。提取方法各异、纯化有别。如专利CN101108871A公开了一种从大枣中提取环磷酸腺苷的工艺方法，该专利用水或乙醇做溶剂渗漉或加热提取，采用大孔吸附树脂再解吸、浓缩、干燥得到含量大于1％的环磷酸腺苷；专利CN1948329A公开了一种从枣中提取环磷酸腺苷的工艺，该专利将红枣适当破碎加入浸提溶剂浸泡提取，浸提液通过阴离子交换柱，用甲酸洗脱，洗脱液再通过层析柱层析后加入无水乙醇结晶、过滤、真空干燥、粉碎得环磷酸腺苷粉；专利CN1702076A公开了从枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的工艺，该专利的大枣经过去核、匀浆、冷冻离心、浓缩、四次柱层析、冷冻干燥得到环磷酸腺苷冻干粉。综合以上三个专利的提取方法，第一：干燥得到含量大于1％的环磷酸腺苷；第二：原料没有充分粉碎，浸提不完全；第三：四次柱层析，使得工艺繁琐、周期较长，不利于工业化生产；第四：冷冻干燥得到冻干粉生产成本高，不适于工业化生产；第五：浸提后的枣汁得不到利用，造成浪费和污染。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从红枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的方法，以得到一种天然、无毒的环磷酸腺苷(cAMP)制品，解决现有工艺繁杂、周期长、产品纯度低等难题，适应大规模工业化生产的需要。

本发明实现目的的技术方案是：

一种从红枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的方法，其步骤是：

(1)将红枣清洗，经过浸泡、打浆，达到浆核分离，取浆液；

(2)将浆液转入浸提罐，加入果胶混合酶进行酶解、浸提、压滤得到红枣汁；

(3)将红枣汁转入搅拌罐中并与活化后的阴离子树脂进行特异性吸附、结合，连续搅拌，过滤后得到结合枣汁中环磷酸腺苷(cAMP)的树脂；

(4)将结合后的树脂充入层析柱，用甲酸溶液洗脱，取甲酸洗脱液；

(5)将甲酸洗脱液用800Da纳滤膜纳滤，以滤出分子量小于800的小分子组分，再经过200Da纳滤膜纳滤分子量小于200的水和甲酸，截留产物即包含环磷酸腺苷(cAMP)；

(6)浓缩得到的截留产物环磷酸腺苷(cAMP)，将该浓缩液经过乙醇结晶、纯化后即得到环磷酸腺苷(cAMP)的成品。

而且，所述果胶混合酶由果胶裂解酶、果胶甲酯化酶和聚半乳糖醛酸酶构成，其重量比例为6∶2∶2。

而且，所述果胶混合酶的用量为0.3-0.5g/L。

而且，所述步骤(4)中用甲酸溶液洗脱时，采用紫外扫描仪随时检测，当洗脱至258nm时，吸收峰＜0.3时结束洗脱。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明针对红枣中果胶质特征选用的果胶混合酶即含有果胶裂解酶、果胶甲酯化酶和聚半乳糖醛酸酶(比例为6∶2∶2)的混合酶对红枣酶解制汁，采用阴离子交换树脂与枣汁特异性结合再用甲酸洗脱，采用分子纳滤膜纳滤技术，选用800Da、200Da的纳滤膜纳滤洗脱液，分别将分子量大于800的大分子组分及分子量小于200的小分子组分滤出，被截留组分即为目标产物环磷酸腺苷(cAMP)及部分其它组分，经乙醇结晶、纯化后为环磷酸腺苷(cAMP)成品，整个工艺耗能量少、工艺简单，适于大规模工业化生产的从红枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)。

2、本发明采用酶法降低物料黏度并结合分子纳滤膜纳滤技术提取红枣中有效成分的一种方法，与现有制备工艺对比，具有原料来源丰富、工艺简单、处理量大、提取率高、成品纯度高等优点，产品属天然、无毒制品，可用于医药原料或用作食品添加剂；提取后的副产物红枣汁可实现红枣深加工，提升综合开发的产业链，实现无污染生产，解决了现有工艺繁杂、周期长、产品纯度低等难题，不但降低了成本，也给红枣原料的深加工提供了更好的途径，而且极大地减少了能源的消耗，更适用于工业化的生产和应用，不仅具有重要的经济效益，也具有明显的社会效益。

具体实施方式

以下将本发明的内容通过下列的较优的实施例作进一步的阐述，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1

一种从红枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的方法，其步骤是：

(1)将红枣50kg清洗，300L水常温浸泡16h；预煮30min，打浆机打浆，且达到浆核分离；

(2)浆液转入浸提罐，55℃加入6∶2∶2的果胶混合酶0.5g/L保温3h酶解、浸提，压滤机压滤得到红枣汁，滤渣用于循环生产；果胶酶的作用是将原果胶、果胶质等粘稠性杂质水解成低分子二聚体、单体等使之利于红枣中环磷酸腺苷(cAMP)的浸提和分离；又因果胶酶作用于果胶可以水解其为甲醇和果胶酸，因此要准确控制果胶酶的用量0.3-0.5g/L，减少生成甲醇的基质利于后续工艺。

(3)将红枣汁转入搅拌罐中与17kg的活化后的阴离子树脂进行特异性吸附、结合，并以40转/分连续搅拌6h，100目过滤得到结合上枣汁中环磷酸腺苷(cAMP)的树脂，并用约树脂2倍量的水清洗树脂将其所带的絮状物清洗干净；

(4)将结合后的树脂充入层析柱，用0.5N的甲酸溶液洗脱，控制流速350ml/h，并利用紫外扫描仪随时检测，当洗脱至258nm时，吸收峰＜0.3时结束洗脱；

(5)将甲酸洗脱液经过800Da纳滤膜纳滤，控制流速40l/h，滤出了分子量小于800的小分子组分包括目标产物环磷酸腺苷(cAMP)等小分子组分，再经过200Da纳滤膜纳滤分子量小于200的大部分水和甲酸等组分而被截留组分即为目标产物环磷酸腺苷(cAMP)及部分其它组分。

本步骤选用800Da、200Da的纳滤膜纳滤洗脱液，可分别将分子量大于800的大分子组分及分子量小于200的小分子组分滤出，被截留组分即为目标产物环磷酸腺苷(cAMP)及部分其它组分，经过乙醇结晶、纯化后目标产物环磷酸腺苷(cAMP)的成品被得到。200Da纳滤膜纳滤其压差为1MPa，能够截留相对分子质量200以上的包括目标产物环磷酸腺苷(cAMP)等大分子的组分；800Da纳滤膜纳滤其压差为1.5MPa，能够截留相对分子质量800以下分子的组分，此时目标产物环磷酸腺苷(cAMP)在浓缩液中。

(6)纳滤浓缩得到的目标产物环磷酸腺苷(cAMP)浓缩液，经过乙醇结晶、纯化后得到环磷酸腺苷(cAMP)的成品3.9g，可用于医药原料或用于食品添加剂。

实施例2

一种从红枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的方法，其步骤是：

(1)将红枣50kg清洗，400L水常温浸泡12h；预煮30min，打浆机打浆，且达到浆核分离；

(2)浆液转入浸提罐，60℃加入6∶2∶2的果胶混合酶0.3g/L保温2h酶解、浸提，压滤机压滤得到红枣汁，滤渣用于循环生产；

(3)将红枣汁转入搅拌罐中与8.5kg活化后的阴离子树脂进行特异性吸附、结合，并以40转/分连续搅拌6h，100目过滤得到结合上枣汁中环磷酸腺苷(cAMP)的树脂，并用约树脂2倍量的水清洗树脂将其所带的絮状物清洗干净；

(4)将结合后的树脂充入层析柱，用0.5N的甲酸溶液洗脱，控制流速300ml/h，并利用紫外扫描仪随时检测，当洗脱至258nm时，吸收峰＜0.3时结束洗脱；

(5)将甲酸洗脱液经过800Da纳滤膜纳滤，控制流速30l/h，滤出了分子量小于800的小分子组分包括目标产物环磷酸腺苷(cAMP)等小分子组分，再经过200Da纳滤膜纳滤分子量小于200的大部分水和甲酸等组分而被截留组分即为目标产物环磷酸腺苷(cAMP)及部分其它组分。

(6)纳滤浓缩得到的目标产物环磷酸腺苷(cAMP)浓缩液，经过乙醇结晶、纯化后得到环磷酸腺苷(cAMP)的成品3.95g，可用于医药原料或用于食品添加剂。

实施例3

一种从红枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的方法，其步骤是：

(1)将红枣50kg清洗，350L水常温浸泡14h；预煮30min，打浆机打浆，且达到浆核分离；

(2)浆液转入浸提罐，60℃加入6∶2∶2的果胶混合酶0.4g/L保温3h酶解、浸提，压滤机压滤得到红枣汁，滤渣用于循环生产；

(3)将红枣汁转入搅拌罐中与10kg活化后的阴离子树脂进行特异性吸附、结合，并以40转/分连续搅拌6h，100目过滤得到结合上枣汁中环磷酸腺苷(cAMP)的树脂，并用约树脂2倍量的水清洗树脂将其所带的絮状物清洗干净；

(4)将结合后的树脂充入层析柱，用0.5N的甲酸溶液洗脱，控制流速300ml/h，并利用紫外扫描仪随时检测，当洗脱至258nm时，吸收峰＜0.3时结束洗脱；

(5)将甲酸洗脱液经过800Da纳滤膜纳滤，控制流速35l/h，滤出了分子量小于800的小分子组分包括目标产物环磷酸腺苷(cAMP)等小分子组分，再经过200Da纳滤膜纳滤分子量小于200的大部分水和甲酸等组分而被截留组分即为目标产物环磷酸腺苷(cAMP)及部分其它组分。

(6)纳滤浓缩得到的目标产物环磷酸腺苷(cAMP)浓缩液，经过乙醇结晶、纯化后得到环磷酸腺苷(cAMP)的成品4.0g，可用于医药原料或用于食品添加剂。

产品性能测定：

1、紫外扫描仪测定洗脱液环磷酸腺苷(cAMP)的含量(参照中国药典一部2005版)方法如下：取样品3ml在200-400nm扫描，检测到样品在258nm处与环磷酸腺苷(cAMP)标准品相似的峰。

2、高压液相色谱法(HLPC)测定成品环磷酸腺苷(cAMP)的含量(参照中国药典一部2005版)条件：色谱柱：ODS-C₁₈；流动相0.02mol/LKH₂PO₄-甲醇；检测波长258nm。