一种双色竞争性荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种双色竞争性荧光定量共扩增聚合酶链反应试剂盒，首先根据21号染色体特异序列DSCR区段序列和2号染色体上的USC2序列分别合成其特异共用引物和特异性双色Taqman探针，然后在PCR扩增缓冲反应体系中在多色荧光定量热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环，实现两个DNA片段的竞争性扩增。在PCR扩增的同时检测扩增过程中由于降解Taqman探针获得的两个DNA片段扩增的荧光信号的强弱变化情况，获得扩增动力学曲线图，进而得出各个标本的上述两个DNA片段扩增的Ct值，从而计算它们的拷贝数比值，再根据两个基因拷贝数的比值进一步判断21号染色体的倍性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种双色竞争性荧光定量聚合酶链反应(dual color competitivefluorescence quantitative polymerase chain reaction，DCC-FQ-PCR)检测试剂盒，具体是涉及一种21号染色体倍性检测的双色荧光定量聚合酶链反应体外竞争性PCR试剂盒，属于分子生物学检测诊断领域。

背景技术

唐氏综合征(Down Syndrome，DS)，又称为先天愚型，是活产胎儿中最常见的染色体异常综合征之一，其发病率约为1/600-1/800。DS的体征非常多样，通常涉及多种组织器官的异常，但其最突出、最严重的临床表现为精神发育迟滞。该病的主要临床特征为：严重智力低下，且智力低下的表型随年龄增长逐渐明显，动作发育和性发育迟缓，基本无生活自理能力。具有独特的面部和身体畸形、先天性心脏病、消化道畸形等，白血病的发病率也比人群平均发病率高10-30倍。患者的平均寿命在30岁左右。

DS绝大多数都是偶发的，每个孕妇都有生患儿的可能，发病无明显的种族差异和家族聚积现象。世界各地大量群体调查的结果表明种族之间发病率几乎相同，唐氏综合征的每个体细胞中21号染色体为3条，而其它常染色体为2条，淋巴母细胞或羊水脱落细胞体外培养和染色体制备观察是其实验室检测的常规方法，该方法虽然准确度高，但技术复杂耗时长，不能实现自动化和高通量检测。由于唐氏综合征患者21号染色体上的单拷贝序列拷贝数是其它常染色体上的单拷贝序列拷贝数的1.5倍，而DSCR是唐氏综合征发病的关键单拷贝序列区段，因此可以选择21号染色体上的DSCR特异的单拷贝序列和常染色体上的特异单拷贝序列，通过荧光定量PCR技术来检测出它们的相对拷贝数的比值来判断21号染色体的倍性，从而对从微量DNA标本中检测出唐氏综合征具有重要现实意义。

实时荧光定量PCR技术是近年来发展起来的能够对特异DNA(基因)拷贝数进行精确定量的最先进的基因剂量定量新技术。其基本原理是在PCR反应体系中同时加入TaqMan探针(特异寡核苷酸探针)，该探针的5’端标记了一条荧光报告基团(R)，而在这条寡核苷酸探针的3’端标记了一条荧光淬灭基团(Q)。当这条探针处于完整状态或者没有反应时，R所产生的一部分荧光将被Q吸收或淬灭。在PCR反应过程中，该探针可与PCR目标基因特异性杂交，然后被Taq DNA聚合酶的5’外切活性降解，使R和Q分离，游离的R发出荧光信号被检测。随着PCR反应的进行，游离的R与PCR产物相对应的增加。因此，根据每个循环后R产生的荧光信号的强度，即可实时测量出PCR反应产物的数量。如果同时使用拷贝数已知的DNA标准品做标准曲线，即可对所检测的标本的靶DNA做精确定量。

发明内容

本发明目的在于建立一种操作简便，能够快速准确检测唐氏综合征患者的DCC-FQ-PCR试剂盒。

本发明的技术方案是：该种DCC-FQ-PCR试剂盒，含有扩增21号染色体特异单拷贝区段DSCR和2号染色体特异单拷贝序列USC2的荧光定量PCR试剂，其特征在于，首先根据21号染色体特异序列DSCR区段序列和2号染色体上的与之有一定的同源性的特异单拷贝序列USC2分别合成其共用PCR引物和特异性双色Taqman荧光探针，然后将0.2-0.4umol/LDSCR和USC2共用特异性引物、DSCR和USC2特异双色荧光Taqman探针加入同一个PCR扩增缓冲反应体系中，在FTC2000实时荧光定量PCR仪上进行96℃预变性2min，然后94℃变性10sec，50-55℃复性30sec，60℃延伸40sec，共45个循环，并在60℃延伸时检测荧光强度，使引物分别同时竞争性地引导DSCR和USC2两种特异单拷贝DNA区段的新链合成，实现DCC-FQ-PCR扩增和其拷贝数的定量检测。

上述DSCR和USC2共用引物和特异双色Taqman荧光探针的序列分别为：共用上游引物5’-AAA GTT TCT TCT GGA TCT ACA G-3’(SEQ ID NO：1)；共用下游引物：5’-TCCTCT GTG CTC TGA GCT AAG-3’(SEQ ID NO：2)；DSCR TaqMan探针：5’-[FAM]ACA TTTTGG ATG CAC TGG GA[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：3)；USC2特异TaqMan探针：5’-[HEX]CAA AAC TCA CAG AGG GAC TC[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：4)。

所用扩增缓冲反应体系是由引物、探针、耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、PCR缓冲液、超纯水等组成的，各个成分的浓度含量分别如下：DSCR和USC2特异的引物、双色荧光Taqman探针各0.2-0.4umol/L、Taq DNA聚合酶1-3U/50ul、dNTPs底物0.2-0.5mmol/L、模板DNA若干、Mg++1.5-3.5mmol/L、缓冲液1-1.5XPCR；其中1XPCR缓冲液包括50mmol/L KCl、10mmol/L Tris.HCl PH8.3、0.01％明胶。

该种DCC-FQ-PCR试剂盒实现两个特异性单拷贝序列的竞争性扩增，通过检测扩增过程中由于降解Taqman探针获得的荧光信号的强弱，获得各自的扩增曲线图，进而得出各个基因的Ct值。根据样品的Ct值和标准曲线，利用以下公式计算分别计算DSCR区段序列和2号染色体上的USC2序列的拷贝数：Nx＝No*Y^Cto-Ctx；其中：Nx为样本x的靶基因的起始拷贝数，Y为扩增效率，相当于Ct值减少1个循环对应的模板DNA的增加的倍数，由公式Y＝10^1/ΔCt(ΔCt＝靶DNA每稀释10倍，平均增加的Ct值数)计算获得；Ctx为扩增管x的靶基因的Ct值；Cto为标准曲线上靶基因拷贝数为No时的Ct值；No为起始拷贝数。根据以下公式计算二者的比值R∶R＝Nd/Ng，其中Nd为DSCR拷贝数，Nu为USC2拷贝数；最后根据二者的比值R判断21号染色体的倍性。

该种DCC-FQ-PCR试剂盒与其它检测21号染色体倍性的方法相比，具有以下优点：1、操作简便快速，可以在2-3小时内获得准确的检测结果；2、闭管检测，不会造成扩增产物污染；3、自动化程度高，人工成本低，还可以高通量检测，每次可以检测90个以上标本；4、需要的检测样本材料微量，每个反应最低仅需要待检DNA 50-100ng，便于取材。

根据上述基因定量检测原理，将上述引物、探针和其他用于定量检测21号染色体倍性的PCR试剂混合后分装到PCR扩增管中，并配以系列稀释度的标准DNA模板组装成DCC-FQ-PCR试剂盒。

具体实施方式

实施例1：

1.引物和探针的设计

根据genebank中DSCR1[gi：7768679]的序列设计DSCR的引物如下：

上游引物：5’-AAA GTT TCT TCT GGA TCT ACA G-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物：5’-TCC TCT GTG CTC TGA GCT AAG-3’(SEQ ID NO：2)；

DSCR特异TaqMan探针DSCRTM：5’-[FAM]ACA TTT TGG ATG CAC TGG GA[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：3)；USC2特异TaqMan探针5’-[HEX]CAA AAC TCA CAG AGG GAC TC[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：4)。

DSCR扩增产物171bp，序列为：AAAAAATTTTTTTTTTT CAATCTAAAA ACTGGAAATT CTAGGGTTTT TGTACATTTTGGATGCACTG GGAATTTATT AGCACAAAAT CATTCTTTGC AACTCAAAATTCAGAAGGGA CTCTACCATAT(SEQ ID NO：5).

USC2扩增产物169bp，序列为：GAGTTTTTCATTTCCAAT CTAAAAACTA GAAGCTCTAG CATTTTGTACA TTTTTTGTTGTTGCACTGGAA GTTTAACTATT GGCACAAAAT CATTCTTCAAA ACTCACAGAGGGACTCTGCC ATTA(SEQ ID NO：6).

2.双色竞争性荧光定量PCR反应

混合50ul反应体系，内含两引物各10pmol，各探针10pmol，患者或正常人DNA 100ng，1X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶1u，Mg++终浓度1.5 mmol/L，dNTPs终浓度0.2mmol/L然后在FTC2000实时荧光定量PCR仪上96℃下预变性2min，然后94℃变性10sec，50℃复性30sec，60℃延伸40sec，共45个循环，并在60℃延伸时照相。每一个标本重复三次实验。

3.荧光定量PCR的标准曲线

将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR和USC2序列的标准曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。

4.结果

实验表明唐氏综合征患者的USC2与DSCR1的差值为0.83±0.12，而正常人的USC2与DSCR1的差值为0.05±0.07，用2^-ΔCT方法计算换成拷贝数的的比值(DSCR/USC2)，DS患者约为：1.55～1.41，正常人约为0.94～1.08，两者间的差异有统计学差异意义。

实施例2：

1.引物和探针的设计

上游引物：5’-AAA GTT TCT TCT GGA TCT ACA G-3’(SEQ ID NO：1)；下游引物：5’-TCC TCT GTG CTC TGA GCT AAG-3’(SEQ ID NO：2)；DSCR的TaqMan探针：5’-[FAM]ACA TTT TGG ATG CAC TGG GA[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：3)；USC2的TaqMan探针：5’-[HEX]CAA AAC TCA CAG AGG GAC TC[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：4).

2.双色竞争性荧光定量PCR反应

混合50ul反应体系，内含两引物各15pmol，各探针15pmol，患者或正常人DNA 500ng，1X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶2u，Mg++终浓度2mmol/L，dNTPs终浓度0.4mmol/L然后在FTC2000实时荧光定量PCR仪上96℃下预变性2min，然后94℃变性10sec，52℃复性30sec，60℃延伸40sec，共45个循环，并在60℃延伸时照相。每一个标本重复三次实验。

3.荧光竞争性定量PCR的标准曲线

将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR1和USC2序列的标准曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。

4.结果

实验表明唐氏综合征患者的USC2与DSCR的差值为0.78±0.15，而正常人的USC2与DSCR的差值为0.03±0.13，用2^-ΔCT方法计算换成拷贝数的的比值(DSCR/USC2)，DS患者约为：1.58～1.45，正常人约为0.92～1.14，两者间的差异有统计学差异意义。

实施例3

1.引物和探针的设计

上游引物：5’-AAA GTT TCT TCT GGA TCT ACA G-3’(SEQ ID NO：1)；下游引物：5’-TCC TCT GTG CTC TGA GCT AAG-3’(SEQ ID NO：2)；DSCR的TaqMan探针：5’-[FAM]ACA TTT TGG ATG CAC TGG GA[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：3)；USC2的TaqMan探针：5’-[HEX]CAA AAC TCA CAG AGG GAC TC[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：4).

2.双色竞争性荧光定量PCR反应

混合50ul反应体系，内含两引物各20pmol，各探针20pmol，患者或正常人DNA 1ug，1.5X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶3u，Mg++终浓度3.5mmol/L，dNTPs终浓度0.5mmol/L然后在FTC2000实时荧光定量PCR仪上96℃下预变性2min，然后94℃变性10sec，55℃复性30sec，60℃延伸40sec，共45个循环，并在60℃延伸时照相。每一个标本重复三次实验。

3.荧光竞争性定量PCR的标准曲线

将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR1和USC2序列的标准曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。

4.结果

实验表明唐氏综合征患者的USC2与DSCR的差值为0.88±0.09，而正常人的USC2与DSCR的差值为0.05±0.12，用2^-ΔCT方法计算换成拷贝数的的比值(DSCR/USC2)，DS患者约为：1.61～1.48，正常人约为0.95～1.09，两者间的差异有统计学差异意义。

SEQUENCE LISTING

<110>山东亚大药业有限公司

<120>一种双色竞争性荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒

<130>0

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据PCR反应要求设计，用于扩增人基因组21号染色体DSCR DNA

     AL163300.2和2号染色体USC2的DNA NW_001838769.1左端引物

<400>1

aaagtttctt ctggatctac ag    22

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据PCR反应要求设计，用于扩增人基因组21号染色体DSCR DNA

     AL163300.2和2号染色体USC2的DNA NW_001838769.1右端引物

<400>2

tcctctgtgc tctgagctaa g    21

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据FQ-PCR反应要求设计，用于检测人类基因组21号染色体DSCR DNA

     AL163300.2的特异性探针

<400>3

acattttgga tgcactggga    20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据FQ-PCR反应要求设计，用于检测人类基因组2号染色体USC2的DNA

     NW_001838769.1的特异性探针

<400>4

caaaactcac agagggactc    20

<210>5

<211>171

<212>DNA

<213>人类基因组21号染色体DSCR DNA AL163300.2序列之146797-146967

<400>5

aaagtttctt ctggatctac agaaaaaatt tttttttttc aatctaaaaa ctggaaattc   60

tagggttttt gtacattttg gatgcactgg gaatttatta gcacaaaatc attctttgca  120

actcaaaatt cagaagggac tctaccatat cttagctcag agcacagagg a           171

<210>6

<211>169

<212>DNA

<213>人类基因组2号染色体USC2 DNA NW_001838769.1序列之25131-25299

<400>6

aaagtttctt ctggatctac aggagttttt catttccaat ctaaaaacta gaagctctag   60

cattttgtac attttttgtt gttgcactgg aagtttaact attggcacaa aatcattctt  120

caaaactcac agagggactc tgccattact tagctcagag cacagagga              169