一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生的方法

摘要

一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生的方法，它涉及一种云杉体细胞胚诱导植株再生的方法。它解决了红皮云杉常规育种周期长、繁殖率低的问题。方法：一、合子胚培养愈伤组织；二、培养体细胞胚至成熟并进行干燥；三、培养成熟体细胞胚至体细胞胚萌发；四、继续培养至根和茎的形成，即得到红皮云杉再生植株。本发明一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生的方法，以红皮云杉未成熟种子为外植体诱导体细胞胚，获得再生植株，使红皮云杉的育种周期缩短了，比扦插进行无性繁殖的周期提高了3～6倍，繁殖率高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种云杉体细胞胚诱导植株再生的方法。

背景技术

红皮云杉(Picea koraiensis Nakai)又名红皮臭，主要分布在中国的东北、朝鲜、和俄罗斯的远东地区，大量用于建筑业、装潢业、造纸业，是我国东北地区的重要造林用材树种之一。红皮云杉分布区生态条件复杂，为种子园营建造成困难，营建和运营成本高；红皮云杉的育种周期长达40年以上，繁殖率低，且由于生态环境破坏和长期过量采伐使其优质的种质资源严重流失，近年来营建了一些种子园并选育出了一些15～20年即可成材的优良无性系，但因受繁殖材料等因素限制在实际生产中还没有得到大量应用。目前红皮云杉可以通过扦插进行无性繁殖，但是，目前主要以3～6年生苗的插穗为材料生产扦插苗，培育周期长，另外，因为从每个幼树可采集的插穗的数量有限，扦插繁殖的繁殖率也低。

发明内容

本发明的目的是为了解决红皮云杉常规育种周期长、繁殖率低的问题，而提供的一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生的方法。

一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生的方法按以下步骤实现：一、取经过预处理的红皮云杉合子胚接种于额外添加6-苄基氨基嘌呤、激动素、萘乙酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖和胶立得的改良RJW培养基中，在温度为21±1℃的环境中进行暗培养至出现胚性愈伤组织；二、将胚性愈伤组织转培养接种于额外添加脱落酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖和胶立得的改良RJW培养基中，在温度为21±1℃的环境中进行暗培养至体细胞胚成熟，待体细胞胚子叶发育完全后，将培养瓶开盖，在超净工作台内选弱风档，用弱风吹5～7天进行干燥处理；三、干燥处理后的成熟体细胞胚转接到额外添加激动素、萘乙酸、胶立得和蔗糖的改良RJW培养基中培养，在温度为24±1℃、光周期是明16h/暗8h的环境中培养至体细胞胚萌发；四、将萌发的体细胞胚转接到额外添加活性炭的1/2改良RJW培养基中，在温度为24±1℃、明16h暗8h交替的环境中培养至根和茎的形成，即得到红皮云杉再生植株；步骤一改良RJW培养基中6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.0～1.0mg/L、激动素的浓度为0.0～1.0mg/L、萘乙酸的浓度为0.0～5.0mg/L、谷氨酰胺的浓度为450mg/L、水解酪蛋白的浓度为750mg/L、蔗糖的浓度为20g/L、胶立得的浓度为2g/L；步骤二改良RJW培养基中脱落酸的浓度为0.0～9.5mg/L、谷氨酰胺的浓度为450mg/L、水解酪蛋白的浓度为500mg/L、蔗糖的浓度为60g/L、胶立得的浓度为2g/L；步骤三改良RJW培养基中激动素的浓度为0.02mg/L、萘乙酸的浓度为0.05mg/L、胶立得的浓度为2g/L、蔗糖的浓度为25g/L；步骤四1/2改良RJW培养基中活性炭的浓度为3g/L。

本发明一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生的方法，以红皮云杉未成熟种子为外植体诱导体细胞胚，获得再生植株，使红皮云杉的育种周期缩短了，且可利用的繁殖材料丰富，使繁殖率增大，比自然状态下红皮云杉的育种周期提高40倍以上，比扦插进行无性繁殖的周期提高了3～6倍。本发明实现了红皮云杉苗木的大规模、短周期、高繁殖率、低成本的工厂化生产，使一些优质的种质资源得到快速而广泛的应用，使丰富的种质资源得到保护，还可为该树种的基因工程改良工作奠定基础，从而培育出速生、丰产、优质、抗逆的红皮云杉新种质，使该树种的生态效益、经济效益和社会效益得到迅速、充分发挥。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式红皮云杉体细胞胚诱导植株再生的方法按以下步骤实现：一、取经过预处理的红皮云杉合子胚接种于额外添加6-苄基氨基嘌呤、激动素、萘乙酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖和胶立得的改良RJW培养基中，在温度为21±1℃的环境中进行暗培养至出现胚性愈伤组织；二、将胚性愈伤组织转培养接种于额外添加脱落酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖和胶立得的改良RJW培养基中，在温度为21±1℃的环境中进行暗培养至体细胞胚成熟，待体细胞胚子叶发育完全后，将培养瓶开盖，在超净工作台内选弱风档，用弱风吹5～7天进行干燥处理；三、干燥处理后的成熟体细胞胚转接到额外添加激动素、萘乙酸、胶立得和蔗糖的改良RJW培养基中培养，在温度为24±1℃、光周期是明16h/暗8h的环境中培养至体细胞胚萌发；四、将萌发的体细胞胚转接到额外添加活性炭的1/2改良RJW培养基中，在温度为24±1℃、明16h暗8h交替的环境中培养至根和茎的形成，即得到红皮云杉再生植株；步骤一改良RJW培养基中6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.0～1.0mg/L、激动素的浓度为0.0～1.0mg/L、萘乙酸的浓度为0.0～5.0mg/L、谷氨酰胺的浓度为450mg/L、水解酪蛋白的浓度为750mg/L、蔗糖的浓度为20g/L、胶立得的浓度为2g/L；步骤二改良RJW培养基中脱落酸的浓度为0.0～9.5mg/L、谷氨酰胺的浓度为450mg/L、水解酪蛋白的浓度为500mg/L、蔗糖的浓度为60g/L、胶立得的浓度为2g/L；步骤三改良RJW培养基中激动素的浓度为0.02mg/L、萘乙酸的浓度为0.05mg/L、胶立得的浓度为2g/L、蔗糖的浓度为25g/L；步骤四1/2改良RJW培养基中活性炭的浓度为3g/L。

本实施方式改良RJW培养基中药品的浓度是150.0mg/L的NH₄NO₃、709.9mg/L的KNO₃、120.0mg/L的KH₂PO₄、236.2mg/L的Ca(NO₃)₂·4H₂O、246.5mg/L的MgSO₄·7H₂O、256.5mg/L的Mg(NO₃)₂·6H₂O、101.7mg/L的MgCl₂·6H₂O、4.15mg/L的KI、15.5mg/L的H₃BO₃、10.5mg/L的MnSO₄·2H₂O、14.68mg/L的ZnSO₄·7H₂O、0.125mg/L的Na₂MoO₄·2HO、0.125mg/L的CuSO₄·5H₂O、0.125mg/L的CoCl·6H₂O、13.9mg/L的FeSO₄·7H₂O、18.65mg/L的Na₂EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)、10000mg/L的Inositol(肌醇)、2.0mg/L的Vitamin B₁、0.5mg/L的Vitamin B₆、2.0mg/L的Nicotinic acid(烟酸)和2.0mg/L的Glycine(甘氨酸)；改良RJW培养基的pH值为5.8。

本实施方式红皮云杉未成熟种子用质量浓度为0.05％的高锰酸钾溶液消毒20min，然后用无菌水冲洗3遍，装入塑料袋中封口放于4℃的冰箱中保存。

本实施方式步骤一中将选择未成熟的红皮云杉种子剥去外种皮，用质量浓度为75％酒精消毒30s，再将酒精消毒过的种子转入质量浓度为1％的次氯酸钠溶液中消毒10min，之后再用无菌水冲洗5次，即得到经过预处理的红皮云杉合子胚。

本实施方式经过预处理的红皮云杉合子胚培养15～20天时下胚轴部位诱导出了透明、有粘性、丝状的胚性愈伤组织；大约40天后获得能萌发的成熟体细胞胚，待体细胞胚子叶发育完成后，体细胞胚由浅白色变为浅黄色时进行干燥处理；干燥后在额外添加活性炭的1/2改良RJW培养基中进行体细胞胚萌发，培养约3天就可见有绒状萌发根生成，15～20天根长达2.0～2.5cm，这时生长点有新的针叶生成，约25天后有分根生成。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤二中在超净工作台内选弱风档，用弱风吹6天进行干燥处理。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。