来自“TULBAGHIA VIOLACEA”的提取物和化合物及其作为生物学植物保护剂的应用

摘要

本发明提供了基于Tulbaghia violacea(Harv.)(野生大蒜)种的提取物和制剂，它在体外和体内，甚至在田间和温室条件中表现出显著的抗微生物活性，优选抗真菌活性。此外，来源于土壤部分和植物地上部分的这些提取物引起通过尤其是支持种子生长的生长代谢增加表现出的显著生物刺激活性。此外，来自Tulbaghia violacea和百子莲属(Agapanthus)种的联合的提取物或制剂表现出高于单一物种的提取物或制剂的抗真菌和生物刺激功效，从而证实协同作用参与到了所涉及的生物过程中。

说明书

本发明的技术领域

本发明涉及植物提取物，尤其是基于物种Tulbaghia violacea(野生大蒜)的植物提取物及其与来源于其它植物的提取物的组合。本发明进一步涉及在这些提取物中的化合物的分离、纯化和鉴定。这些植物提取物和分离的物质在体外和体内施用于其它植物时，包括在田间条件下，表现出显著的抗微生物活性，尤其是抗真菌活性，和生物刺激功效。本发明的产品适合于用作许多农作物和经济植物的植物保护剂作为化学农药的替代品。

发明背景

全世界的农业，尤其是在发展中国家，诸如在非洲均存在因植物病害导致的每年一度的巨大农作物和其它经济植物损失。超过30％的在农作物生产系统中生产的食物、纤维、饲料和能量被全球范围的每年一度的害虫和病害所破坏。这些产量损失作为低投入生产系统的结果而极高，这是因为在发展中国家的农民买不起合成杀真菌剂所致，而这些国家依赖于通常提供难以确定结果的非常规病害控制实践。

相反，发达国家中的农作物和植物生产者主要依赖于合成农药控制植物病害。确立的事实为，合成化学农药的应用对作物生产者提供了许多益处。这些益处包括对始终增加的世界人口而言较高的农作物产率，改善的农作物质量和增加的食物产量。使用不同的配方研发广泛的化学药品已经能够使人控制广泛的植物病原体并且实质上增加农作物产量。在十年多以前，为控制害虫，全世界农作物生产者一般花费在农药方面的费用近似200亿美元，而花费在其它植物保护技术方面的费用为1亿5千万美元。单杀真菌剂世界市场份额在近年中为20％，而欧洲占该市场的30％。然而，相同水平的病原体控制在发展中国家尚未得到实现，部分是因农药技术无法被大部分资源匮乏的农民获得。在发展中国家的农民无法获得现代化手段、技术和化学药品仅是因与这些农民栽培的农作物价值相关的高成本所致。因此，农作物照常受广谱多样的病原体侵袭并且这些农民不断经历严重的农作物损害。此外，尽管农药的使用大量增加，但是产量损失却增加，甚至在发达国家也是如此。此外，控制植物病害并非使用单次施用杀真菌剂就易于实现，而是需要在农作物生长期过程中频繁施用。然而，合成的农药可能对环境形成成倍的威胁和危害，尤其是在发展中国家中缺乏操作它们的专业技术和难以轻易地适应该技术的农民不适当地使用它们时更是如此。这可能在食物，水和环境中产生不需要的残留物，并且可能对人和动物产生毒性，导致土壤和地下水污染且可能导致农作物害虫群体对使用农药处理发生抗性。尤其是含硫和铜的合成杀真菌剂对哺乳动物，野生生物和许多有益昆虫有毒性。此外，在非洲和近东，废弃的农药已经成为额外巨大的环境忧虑源。某些储存已经超过了30年以上并且因储存设施不足和缺乏保存管理中受过训练的人员而保持在差的条件中。废弃的农药储存是潜在的定时炸弹。涉及农药的泄漏，泄漏和各种事故十分普遍和广泛。另外，频繁施用杀真菌剂已经产生了真菌突变和随后的新抗性株(Khun，1989，PesticideScience 14：272-293)，与其作斗争通常需要更强的农药，并且会再次对环境产生更强的影响。

由于所有这些原因，所以尤其是在发达国家存在由绿色团体在政治上发动的相当大和逐步增加的消费者抵抗，尤其是对合成化学药品/农药的应用，从而为从化学农药施用到应用天然来源的植物保护剂的转换提供基础，以便减少由农药导致的污染和健康危害。

作为结果，已经极为关切对可能利用的生物资源及其在农业中的潜在应用的研究。在这方面有希望的手段为使用天然植物产品作为合成化学药品的有意义的替代品，因为它显然对环境的负面影响较少。

这尤其适用于寻找对环境温和的，具有例如广谱抗微生物活性的天然衍生的生物活性成分和药剂。

预计来自植物的天然产物具有窄靶标范围和高度特异性作用方式，以便展示出有限的田间持久性，具有较短的贮存期限并且不会存在残留的威胁。它们一般对人和环境比常用的合成化学农药安全并且易于被传统上使用植物提取物治疗人体疾病的发展中国家中的农民所采用。

可以在植物自身中发现更广泛地探察植物提取物或天然产物作为生物农药的应用的额外原理。植物已经进化出了高度特异性的化学化合物，它们对由导致病患的生物体侵袭，包括真菌侵袭，微生物侵害和病毒感染提供防御机制(Cowan，1999，Clinical MicrobiologyReviews 12：564-582)。这些生物活性物质作为次生代谢产物出现在植物中并且已经提供了可以用作新的农作物保护剂的生物活性化合物的丰富来源。实际上某些植物具有在极为恶劣的环境条件下存活的潜能。这一结果启动了如下推断：这类植物可以用作人研发应用于农业的天然产物的来源，作为天然除草剂、杀菌剂、杀真菌剂或粗或半纯化形式的产物。次生植物代谢产物不同于初级代谢产物的方面在于它们一般对基础代谢过程，诸如呼吸和光合作用而言是非必需的。它们是大量和分布广泛的，尤其是在高等植物中并且通常以比初级代谢产物(碳水化合物、蛋白质、脂质)少的量存在(1-5％)。次生代谢产物可能在植物系统中需要时产生和在特化细胞类型中合成。从生态学上说，次生代谢产物在吸引传粉者中起主要作用，作为对环境逆境的适应，并且用作抗昆虫和高级捕食者、微生物乃至其它植物的化学防御物(异种化感物)。

认为非生物逆境，诸如营养限制、光强度、水分逆境等引起次生代谢产物形成。植物-病原体相互作用的与生物逆境相关的类型包括代谢物产生作为抗微生物侵害的植物防御的组成部分并且认为是病害的决定因素。具有抗微生物特性的次生代谢产物包括萜类化合物(例如环烯醚萜类、倍半萜类化合物、皂甙类)、含氮和/或硫(例如生物碱类、胺类、酰胺类)、脂族化合物(尤其是长链烷类和脂肪酸类)和芳族化合物(例如酚类化合物、黄酮类、联苄类、呫吨酮类和苯醌类)。

有机耕作系统的另一个相关领域为作为植物生长调节剂或生物刺激剂施用天然植物提取物的潜能。已经鉴定了影响植物生长和发育的许多天然植物化合物。来自植物的次生代谢产物还可以表现出在植物中的生物刺激活性，包括其它植物。可能的情况是已经将提高农作物产量、农作物效能和种子活力的最有效化合物鉴定为油菜素类固醇(Mandava，1988，Plant Physiology Plant Molecular Biology39：23-52)。还将油菜素类固醇鉴定为来自来源于具体Pink物种和具体Alfalfa种的植物提取物混合物的生物刺激物质(EP1 051 075B1)。因此，存在对鉴定具有在短期，例如生长季节内操纵植物生长和发育的能力的天然植物化合物的升高的关注。额外的考虑在于可以将例如其提取物表现出抗微生物和/或生物刺激特性的植物作为备选农作物栽培以便用作生产天然农药或植物生长调节剂中的活性化合物的来源。

尽管植物为研发具有用于有机农作物生产系统中的病害控制的潜能的新天然产物的有价值的来源，但是仅研究了少量可能用于农业中植物病害控制的植物。然而，与这一相对少量的研究植物相关，在最近几年中已经进行了相对大量的科学研究活动。其中的某些如下所列：

·证实(Pretorius等，2002，Annals of Applied Biology141：117-124)使用百合亚纲(Liliidae)的两个种，即Aristeaecklonii和Agapanthus inapertus的提取物获得了菌丝体生长抑制作用。A.ecklonii的粗提取物在所有提取物中表现的效果最佳，因为它总体上抑制所有七种植物致病测试生物体的菌丝体生长并且盛过广谱合成杀真菌剂(多菌灵(carbendazim)/苯醚甲环唑)的抑制作用。A.inapertus的粗提取物表现出对四种植物致病真菌的完全抑制作用和对剩余三种植物致病真菌的强抑制作用。

·植物种子也包含具有抗微生物特性的化合物。评价属于不同科的50种植物种子的种子提取物在体外抑制绿色木霉(Trichodermaviride)生长的能力(Bharathimatha等，2002，ActaPhytopathologica et Entomologica Hungarica 37：75-82)。在各种种子提取物中，属于无患子科(Sapindaceae)的假山萝(Harpulliacupanioides(Roxb.))的提取物展示出极高的抗真菌活性。

·提取自虎杖(Reynoutria sacchalinensis)的天然植物产物Milsana^可能是已知最佳的(Daayf，1995，Plant Disease79：577-580)。已经报导该产物在温室条件下控制长英国黄瓜中苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)导致的白粉病并且还表现出对番茄、苹果和秋海棠的白粉病以及葡萄藤的霜霉和大豆的锈病的广谱活性。

·Amadioha(2002，Archives of Phytopathology and PlantProtection 35：37-42)评价了A.indica的不同提取物的抗真菌活性。来自该植物的种子的油提取物和水和乙醇的叶提取物有效地减少培养物中宫部旋孢霉(Cochliobolus miyabeanus)的放射状生长并且控制稻中的褐斑病扩散。

·Kishore等(2002，International Arachis Newsletter22：46-48)报导了来自散茉花(Lawsonia inermis)和对洋金花(Daturametel)叶的水提取物对导致落花生(落花生(Arachis hypogaea))中的晚期叶斑病(late leaf spot)的Mycosphaerella berkeleyi的抗微生物活性。

·Cruz等通过用裸花紫珠(Callicarpa acuminate)的水浸出液处理大豆、玉米和番茄根进行了定向于鉴定植物提取物中的生物刺激特性的研究(2002，Acta Horticulurae 569：235-238)。裸花紫珠的水提取物抑制番茄的胚根生长，但对玉米或大豆的根生长无作用。

·来自某些苜蓿栽培品种的提取物在种子萌发以及根和下胚轴生长方面具有刺激作用，而其它的则表现出直接相反的作用，从而证实农作物植物也可以受到目的在于控制杂草生长的植物提取物的影响(Tran和Tsuzuki，2002 Journal of Agronomy and Crop Science188：2-7)。

·Leksomboon等(2001，Kasetsart Journal，Natural Sciences35：392-396)证实了玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)、番石榴(Psidiumguajava)、石榴(Punica granatum)、槟榔青(Spondias pinnata)和酸豆(Tamarindu sindica)的叶和其它部分的水提取物在实验室和田间条件下对地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)，即柑桔溃疡病原体的抗细菌作用。

·Morais等评价了45种药用植物对广泛细菌的抗细菌作用(2002Acta Hotticulturae 569：87-90.)。这些植物中5种的粗提取物显著抑制了Xanthomonas campestris pv.vesicatoria[X.vesicatoria]，Ralstonia solanacearum和Clavibacter michiganense subsp.michiganense[C.michiganensis subsp.michiganensis]生长，它们均为番茄的病原体。

·已经研发了另一种来源于莳萝和藏茴香籽的天然产物香芹酮，它抑制贮存病原体的生长并且抑制仓库中马铃薯的萌发(Moezelaar等，1999，In：Modern fungicides and antifungal compounds II；Intercept Limited，p.453-467)。香芹酮目前作为Talent^在荷兰销售。

·在欧洲专利EP1 051 075中，描述了Pink科物种和Alfalfa种的联用制剂(ComCat^)，它展示出特定比例下的协同生物刺激作用。ComCat^已经在可利用营养物在处理的植物利用中显示出一致性的植物生长促进和生理功效。促进蔬菜、花和农作物健康的ComCat^并非肥料替代品，而是刺激植物更适当地利用可利用的营养物的生物促进剂。此外，它活化并且诱导处理植物中的异种化感和病害抗性并且刺激更多糖类的产生，而这些糖属于纤维素和子实体的结构单元。结果是产生具有更强植物茎、开花更好且果实生物量更大的更多产的更健康植物(Agraforum：Germany，2002，Technical data sheet)。

发明概述

本发明提供了基于Tulbaghia violacea(Harv.)(野生大蒜)物种的提取物和制剂，它在体外和体内，甚至在田间和温室条件中，表现出显著的抗微生物活性，优选抗真菌活性。此外，来源于该植物土壤部分和地上部分的这些提取物引起尤其是通过支持种子生长的生长代谢增加表现出的显著生物刺激活性。此外，来自Tulbaghia violacea和百子莲属(Agapanthus)种的联合的提取物或制剂表现出高于单一种类的提取物或制剂的抗真菌和生物刺激功效，从而证实协同作用参与到了所涉及的生物过程中。

本发明还提供了不同植物种的提取物或制剂组合的组合物。这些组合包含来自Tulbaghia violacea(野生大蒜)和其它植物种，诸如百子莲属种，优选百子莲(A.africanus)的制剂。在优选的组合中，将T.violacea与百子莲属种，优选百子莲，按照1∶1(w/w)混合。或者，按照本发明，将来自T.violacea种的制剂与Pink科种和Alfalfa种的混合物的制剂优选按照特定比例组合。在本发明的另一个实施方案中提供了T.violacea种与百子莲属种以及Pink科种和Alfalfa种的混合物的组合。这些组合引起了比相应单一成分制剂增加的和协同的植物保护活性，优选抗真菌和生物刺激活性。本发明最后提供了分离和纯化自所述提取物/制剂的化合物，它们在体外和体内施用于其它植物，包括田间栽培，也表现出显著植物保护活性，特别是抗真菌活性。

根据生产方法的不同，可以将本发明的制剂制成粗提取物或干粉。这些制剂还可以包含本领域状态中的固体，优选粉状，填充剂或载体物质，尤其是用于田间栽培的。此外，本发明的制剂可以包含增加或调节该制剂作用的常规添加剂。

还可以将本发明的制剂制成液体，优选含水形式，它可以作为喷雾剂使用且由此可易于在栽培中的区域中喷雾。在这类溶液或混悬液中，本发明的提取物和制剂在0.2g(提取物/粉末)/升-2g/升，优选0.5g/升-1g/升的浓度范围内显示出其完全的植物保护活性。就这些制剂的抗真菌活性而言，术语″完全的植物保护活性″意指与标准参比农药相比100％抑制典型真菌性植物病原体的菌丝体生长。

本发明还提供了基于使用有机极性溶剂，诸如甲醇或乙醇或其混合物，提取植物或植物部分，制备粗提取物和干粉制剂的方法。本发明最后提供了分离，纯化和鉴定来自所述提取物的物质的方法，所述的物质在体外和体内对患病植物表现出显著的抗真菌和生物刺激活性。

更具体地说，本发明提供了

●适合于生物学植物保护的、基于来自Tulbaghia violacea(野生大蒜)的植物或植物部分的、粗提取物形式的制剂，其能通过下列步骤获得：

(i)避开日光在30-40℃下干燥植物材料；

(ii)将干燥的植物材料研磨成0.2-2mm粒度大小(gritsize)；

(iii)将研磨的材料浸入选自甲醇和乙醇的极性有机溶剂，由此形成混悬液/溶液；

(iv)对所述的混悬液进行搅拌提取并且将上清液与固相分离；

(v)将步骤(iii)和(iv)再重复至少一次；

(vi)合并步骤(iv)的可溶性有机相并且通过在30-40℃下真空蒸发除去有机溶剂，由此获得粗提取物残渣。

●适合于生物学植物保护的、基于来自Tulbaghia violacea(野生大蒜)的植物或植物部分的、干粉形式的制剂，可通过下列步骤获得：

(i)避开日光在30-40℃下干燥植物材料；

(ii)将干燥的植物材料研磨成低于0.1mm粒度大小；

(iii)将研磨的材料浸入甲醇，由此形成混悬液/溶液；

(iv)对所述的混悬液进行搅拌提取；

(v)在不预先将固相与可溶性有机相分离的情况下蒸发溶剂；

(vi)将蒸发后的固相残余物浸入乙醇并且重复步骤(iv)和(v)；和

(vii)干燥蒸发后的固相残余物，由此获得干粉。

●相应的制剂，其中使用所述植物的不同地上部分中的一种或多种。

●相应的制剂，其中使用植物的土壤部分。

●相应的制剂，它包含下列化合物中的一种，多种或全部：

2，4，5，7-四硫杂辛烷；

2，4，5，6，8-五硫杂壬烷；

2，3，5，7，8-五硫杂癸烷；

2，4，6-三硫杂庚烷；和

2，4-二硫杂戊烷。

●相应的制剂，进一步包含粉状的固体载体物质或填充剂和/或增加或调节该制剂作用的添加剂。

●基于如上文说明的干制剂的含水溶液或混悬液形式的制剂。

●相应的制剂，其中粗提取物或干粉的浓度在0.2g/l-2g/l的范围，优选0.5g/l-1g/l的范围。

●组合物，包含如上文说明的第一种植物制剂和粗提取物、干粉或其含水混悬液或溶液形式的至少第二种植物制剂，所述的第二种植物制剂对使用该组合物处理的植物或其部分发挥外加的植物保护作用。    

●相应的组合物，其中所述第二种植物制剂来源于百子莲属的物种，优选百子莲并且通过与所述第一种植物制剂类似的工艺步骤获得。

●相应的组合物，其中第二种植物制剂来源于Pink科种和Alfalfa种的混合物，其中干燥的Pink种材料的重量比为80-99％，所述的第二种植物制剂通过与所述第一种植物制剂类似的工艺步骤获得。

●三成分组合物，包含：

(i)如上文说明的第一种植物制剂；

(ii)来源于百子莲属种的第二种植物制剂；和

(iii)来源于Pink科种和Alfalfa种的混合物的第三种植物制剂，其中干燥的Pink种材料的重量比为80-99％，每种制剂为粗提取物、干粉或其含水混悬液或溶液的形式，所述的第二种和第三种植物制剂对使用该组合物处理的植物或其部分发挥外加的植物保护作用。

●如上文说明的制剂/组合物作为生物学植物保护剂的应用。

●所述制剂/组合物的应用，其中所述的生物学植物保护剂为抗微生物剂，诸如抗细菌剂或抗真菌剂，优选抗真菌剂。

●所述制剂/组合物的应用，其中所述的抗真菌剂抑制真菌菌丝体生长。

●相应的应用，用于预防田间条件下真菌感染农作物。

●所述制剂/组合物的应用，其中所述的生物学植物保护剂为生物刺激剂，它优选在使用该活性剂处理的植物或植物部分中引起生长诱导作用和/或诱导系统性获得性抗性。

●相应的应用，其中所述的生物刺激剂引起对幼苗生长的刺激。

●分离自如上文说明的所述制剂的化合物，其选自：

¹CH₃S³CH₂SSS⁷CH₂S⁹CH₃(2，4，5，6，8-五硫杂壬烷)

¹CH₃SS⁴CH₂S⁶CH₂S⁸CH₂S¹⁰CH₃(2，3，5，7，8-五硫杂癸烷)

¹CH₃S³CH₂S⁵CH₂S⁷CH₃(2，4，6-三硫杂庚烷)

¹CH₃S³CH₂S⁵CH₃(2，4-二硫杂戊烷)。

●适合于植物保护的组合物，包含选择如下的化合物中的至少两种，优选全部：

2，3，5，7，8-五硫杂癸烷；2，4，5，6，8-五硫杂壬烷；2，4，6-三硫杂庚烷；2，4-二硫杂戊烷；2，4，5，7-四硫杂辛烷。

●所述制剂/组合物作为生物学植物保护剂的应用。

●所述制剂/组合物作为抗真菌剂的应用，优选抑制真菌菌丝体生长。

●制备如权利要求1-10中任意项所定义的粗提取物或干粉制剂或其含水混悬液或溶液的方法，其特征在于进行下列步骤：

(i)避开日光在30-40℃下干燥植物材料；

(ii)将干燥的植物材料研磨成0.2-2mm粒度大小，优选1mm；

(iii)将研磨的材料浸入极性有机溶剂，诸如甲醇或乙醇，由此形成混悬液/溶液；

(iv)对所述的混悬液进行搅拌提取并且将上清液与固相分离；

(v)将步骤(iii)和(iv)再重复至少一次；

(vi)合并步骤(iv)的可溶性有机相并且通过在30-40℃下真空蒸发除去有机溶剂，由此获得粗提取物残渣；

并且就含水制剂的制备而言：

(vii)将所得粗提取物以适宜的浓度悬浮于水中；

或者，作为备选方案，可采用下列步骤：

(ia)避开日光在30-40℃下干燥植物材料；

(iia)将干燥的植物材料研磨成低于0.1mm粒度大小；

(iiia)将研磨的材料浸入第一种极性有机溶剂，诸如乙醇或甲醇，由此形成混悬液/溶液；

(iva)对所述的混悬液进行搅拌提取；

(va)在不预先将固相与可溶性有机相分离的情况下蒸发溶剂；

(via)将蒸发后的固相残余物浸入第二种极性有机溶剂并且重复步骤(iva)和(va)；

(viia)干燥蒸发后的固相残余物，由此获得干粉；

并且就含水制剂的制备而言：

(viii)将所得干粉以适宜浓度悬浮于水中。

●相应的方法，其中步骤(iii)中的极性有机溶剂为90-100％甲醇或乙醇。

●相应的方法，其中步骤(iiia)中所述的第一种极性有机溶剂为90-100％甲醇并且步骤(via)中所述的第二种极性有机溶剂为90-100％乙醇。

●相应的方法，其中将各溶剂以1.0-3.0ml/g干重研磨植物材料的浓度用于提取。

●相应的方法，其中所述的粗提取物或干粉材料在含水溶液或混悬液中的浓度为0.2g/l-2g/l，优选0.5g/l-1g/l。

发明详述

(A)一般定义

使用的上述和下述术语和表达方式按照本发明的理解具有如下含义：

除非另外说明，否则术语″植物保护剂″或″植物防护剂″意指在广泛意义上对于植物防御体外和/或体内病原体感染和损害及植物健康有效的任意类型的合成或天然活性剂，产物，提取物，组合物。该术语包括可以表现出几种不同生物活性和/或特性的活性剂，产物，提取物，组合物或单一分离的提取物成分，所述的不同生物活性和/或特性诸如抗微生物、抗病毒、抗真菌和生物刺激活性/功效，生长诱导/促进活性(对于待被保护的植物而言)；生长抑制剂活性(就与被保护的植物竞争的植物而言)；诱导/促进系统性和/或免疫学获得性抗性的活性；和异种化感诱导/促进活性。

除非另外说明，否则本发明的术语″生物学植物保护″意指植物的保护通过优选来自植物的天然存在或天然来源的物质或来源实现并且不通过合成或化学方式或活性剂(它们在自然界优选植物或植物部分中不存在)实现。

术语″生物学植物保护(防护)剂″因此为植物提取物、植物制剂、基于植物或其部分的组合物或从植物提取物/制剂/组合物分离的活性剂，它们在体外和/或体内均表现出对植物病原体的显著功效。该术语还包括在结构和功能上与分离的天然来源的化合物相同的化学合成的化合物，但明确不包括不具有天然来源的对应物的化学合成的农药和相关化合物。

除非另外说明，否则本发明的术语″农药″意指非天然来源或存在的具有植物保护功效的合成化合物，活性剂或组合物。

术语″植物病原体″意指导致植物病害或损害的化合物或组合物或活物质，诸如微生物(包括病毒)。在本发明的一个较窄的范围中，该术语集中在致病微生物，包括这些微生物的代谢产物。

本发明的术语″抗微生物″包括对微生物，包括病毒、细菌和真菌的功效或活性，这种功效或活性可体外和/或体内减少或消除攻击被保护的植物或其部分的活动微生物的(相对)数量。因此，该术语包括术语″抗病毒″、″抗细菌″和″抗真菌″。本发明的″抗微生物剂″为如上文说明的生物学植物保护剂，它防止或减少因致病微生物导致的植物感染或损害。

本发明的术语″抗细菌″意指减少或消除活细菌(相对)数量的活性或功效(例如活性剂或提取物等的)。本发明的″抗细菌剂″为如上述说明的生物学植物保护剂，它可体外和/或体内防止或减少因致病细菌导致的植物感染或损害。

本发明的术语″抗病毒″意指减少或消除活动病毒(相对)数量的活性或功效(例如活性剂或提取物等的)。本发明的″抗病毒剂″为如上述说明的生物学植物保护剂，它可体外和/或体内防止或减少因致病病毒导致的植物感染或损害。

本发明的术语″抗真菌″意指减少或消除活动真菌(相对)数量的活性或功效(例如活性剂或提取物等的)。本发明的″抗真菌剂″为如上述说明的生物学植物保护剂，它可体外和/或体内防止或减少因致病真菌导致的植物感染或损害。这种抗真菌活性可以导致菌丝体生长和真菌孢子萌发的抑制。

除非另外说明，否则本发明的术语″生物刺激″意指刺激，增加或改善植物或植物部分中的许多不同过程的活性或功效，诸如改善的生长促进物质，如糖类和氨基酸的产生，改善的可利用营养物和生长调节剂向细胞的充足供给，强化的细胞代谢，改善的细胞净化，强化的免疫防御，生长和产量的提高，诱导系统性获得性抗性(SAR)，竞争性植物的生长和产量的抑制(异种化感)。生物刺激活性可以由包括植物合成的代谢化合物的活性剂、植物提取物和组合物导致，其中在所述生物刺激剂诱导该代谢化合物合成后所述植物得到保护。本发明的″生物刺激剂″为如上述的生物学植物保护剂，它在用该活性剂在体外和/或体内处理的植物中表现出上述的生物刺激特性。

″植物生长调节剂″为天然或合成的可以改变或控制植物中一种或多种特定生理学过程的化合物或物质混合物。如果该化合物在植物内产生，那么其称作植物激素，例如植物生长激素、赤霉素、脱落酸和乙烯。″SAR″(系统性获得抗性)可以出现在本发明植物或其部分中，只要它表现出对与防御或保护相关的酶(PR-蛋白)的活性的诱导或促进。这类酶包括：例如过氧化物酶、β-1，3-葡聚糖酶(glucanse)和NADPH氧化酶。

(B)植物描述

Tulbaghia violacea称作野生大蒜，该名称来源于这一事实，即尽管其味道接近真正的大蒜味道，但是推定并不会遗留下令人尴尬的口臭气味。种名″violacea″来源于″紫色″的拉丁语。它属于Alliaceae(Lilliaceae)科。Tulbaghia violacea原产于南非。它作为植物园和家庭花园中的观赏植物种植在整个南非并且在海外某些国家栽培，诸如美国和英国。Tulbaghia violacea已经作为大蒜的替代品用于食物中。野生大蒜在传统上用于发热和感冒，而且也用于哮喘和结核。其叶用于治疗食道癌。Tulbaghia violacea为具有草样叶和球茎样根茎、散在成簇状、生长旺盛的多年生草本植物。花序由3-40个开花的伞形花序组成。花头长在远高于叶的细长单生柄上。带柄的花很小并且在茎顶端上的伞形花序中成簇。该植物发育成熟的高度为30-60cm。花具有紫丁香的紫红色或紫色。Tulbaghia violacea极易生长并且可以多年不用照料。除非花表现出退化的征兆，否则植物形成无需分开的簇。该植物能够在十分差的土壤或普通的花园土壤中旺盛地生长，而在混合了丰富的堆肥的良好的沃土中生长得更成功。排水应良好，特别是在冬季降雨的区域。植物在全年中在定期间隔需要水分，而更特别在夏季期间。它们是强壮的并且可以生长在冷处。繁殖通过播种或分裂进行。

(C)微生物

选择7种常见南非植物真菌病原体测试植物提取物的毒真菌特性。这些真菌病原体包括灰色葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.Fr.)(丝孢纲(Hyphomycetes))、尖孢镰胞(Fusarium oxysporumSchlechtend.Fr.)(丝孢纲)、整齐小核菌(Sclerotinia rollfsiiSacc.)(无孢纲(Agonomycetes))、茄属丝核菌(Rhizoctonia solaniKühn)(无孢纲)、疖葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea(Moug.Fr.)Ces.&De Not.)(腔菌纲(Loculoascomycetes))、终极腐霉(Pythium ultimum Trow)(卵菌纲(Omycetes))和Mycosphaerellapinodes(Berk.+Blox.)。

用于本研究的植物致病细菌包括根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens(Smith和Townsend))、密执安棍状杆菌(Clavibactermichiganensis)(Smith)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜致病变种(Erwinia carotovora pv.Carotovora)(Jones)、Xanthomonascampestris Pammel pv.Phaseoli(Dawson)、Ralstoniasolanacearum(Smith)和人细菌粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatharrhalis(Frosch+Kolle))。

(D)来自Tulbaghia violacea的粗提取物在体外抗微生物和生物刺激活性中的筛选

1.一般说明

来自T.violacea某些植物的提取物具有抗微生物和生物刺激特性并且具有开发为控制植物病害或促进农作物生长的天然产物的潜能。

通过遵循对单一培养的酵母细胞的呼吸速率，水芹(Cress)种子萌发以及水芹幼苗的胚根和胚芽鞘生长的作用在体外评价所述提取物的生物刺激潜能。

T.violacea的地上部分(aerial part)和土壤下部分(below soilpart)的粗提取物显示出对酵母细胞呼吸速率以及水芹幼苗的胚根和胚芽鞘生长的显著生物刺激作用，但对种子萌发没有作用。

粗提取物还表现出对7种测试细菌中的4种有一些体外抗细菌活性。

粗提取物引起显著(P＜0.05)的对6种经济学上重要的致植物病害的真菌的抗真菌活性。粗提取物胜过用作阳性对照的标准杀真菌剂并且完全抑制6种真菌中5种，包括高度抗性的终极腐霉的菌丝体生长。

2.从干燥的植物材料中回收粗提取物

在干燥和研磨后，从采集的原始新鲜的T.violacea材料中可获得7.96％(w/w)地上部分干燥材料和26.1％(w/w)土壤下部分干燥材料(表1)。在提取后，可以从干燥的地上部分材料中回收14％(w/w)的干燥粗物质，而可以从干燥的土壤下部分干燥材料中回收6.7％(w/w)的干燥粗物质。

表1：从干燥的植物材料中回收粗提取物

  植物器官  新鲜  质量(g)  干燥后  质量(g)    研磨后质    量(g)    甲醇提取    物质量(g)    从干燥材料中回    收的粗提取物％  地上部分  16032.1  1284.8    1275.9    179.14    14  土壤下部分  16864.8  4529.0    392.8    293.46    6.7

3.T.violacea粗提取物的体外抗细菌活性

在用作测试生物体的6种致植物病害的细菌中，3种植物病原体(C.michiganensis(密执安棍状杆菌)、R.solanacearum、X.campestris)的生长受到土壤下部分和地上部分粗提取物的显著抑制，粘膜炎莫拉氏菌的结果未显示(表2)。

表2：不同Tulbaghia violacea器官粗提取物对植物病原细菌的体外生长抑制

平均抑制区直径(mm)细菌提取物  密执安  棍状杆菌  (Clavibacter  michiganensis)  丁香假  单胞菌  (Pseudomonas  syringae)    胡萝卜软腐    欧文氏菌    (Erwinia    caratovora)    根癌土壤杆菌    (Agrobacterium    tumefaciens)    Ralstonia    solanacearum  野油菜  黄单胞菌  (Xanthomonas  campestris)地上部分  8.7±1.7a   0±0a    0±0a    0±0a    9.8±1.2ab  12.2±2.4ab土壤下部分  7.3±1.1a   0±0a    1±1.41a    0±0a    15.4±0.7a  18.2±0.23aDMSO对照品  0±0b   0±0a    0±0a    0±0a    0±0c  0±0c

其它3种细菌对使用粗提取物处理的抗性高得多并且完全不受提取物影响。

4.T.violacea粗提取物的抗真菌活性

T.violacea的土壤下部分完全抑制(100％)灰色葡萄孢、整齐小核菌和终极腐霉的菌丝体生长并且表现出对尖孢镰胞和茄属丝核菌极高的抑制作用(＞95％)。对疖葡萄座腔菌观察到了最低抑制(90％)(附图1)。地上部分提取物对灰色葡萄孢、整齐小核菌和终极腐霉的菌丝体生长的抑制作用也极高(＞95％)并且对茄属丝核菌和疖葡萄座腔菌的菌丝体生长的抑制作用＞80％。尖孢镰胞(75％抑制作用)对使用地上部分提取物处理最具抗性。从统计学上讲，T.violacea的地上和土壤下部分粗提取物在对6种测试真菌中的4种的菌丝体生长抑制方面均显著胜过标准杀真菌剂(P＜0.05)。不过，两种提取物在菌丝体生长抑制方面均比标准杀真菌剂有利。

附图2示例了在-20℃下储存1年后T.violacea的相同的两种粗提取物的体外抗真菌活性。与标准杀真菌剂相比，对在-20℃下的冰柜内储存1年的地上和土壤下部分粗提取物观察到抗真菌活性下降＞30％。

表3表示T.violacea的不同植物器官提取物(1mg/ml)的体外平均抗真菌活性(与标准fungizide Eria体外平均抗真菌活性相比)。

表3：来自T.violacea不同器官的粗提取物的体外抗真菌活性

植物Y根100a±0  100a±0  100a±0  100a±0  99a±1  100a±0地上部分99a±1  76c±3  100a±0  85bc±3  86bc±2  100a±3*标准品100a±0  76c±3  68c±4  38±2  87bc±3  4f±1

标准广谱杀真菌剂；多菌灵(carbendazim)/苯醚甲环唑(difenoconazole)(Eria^@)

数值后面的不同字母表示统计学显著性差异。

5.T.violacea粗提取物的生物刺激活性

T.violacea的地上和土壤下部分粗提取物在孵育的前90分钟内均比水和ComCat^对照品显著增加了单一培养的酵母细胞的呼吸速率(附图3)。然而，在孵育120分钟后，因为可能达到最大呼吸速率，所以呼吸速率的差异较不明显。尽管商品生物刺激剂ComCat^也对酵母细胞的呼吸速率具有增加的作用，但是它没有象T.violacea的两种粗提取物的作用那样明显。

在处理与未处理种子的水芹(Cress)种子萌发百分比之间未观察到统计学显著性差异(P＜0.Q5)(表4)。

表4：在25℃下96小时孵育期内用T.violacea地上部分和土壤下部分粗提取物处理的水芹(Cress)种子的萌发百分比平均值(％)。ComCat^和蒸馏水用作对照。

    萌发％平均值    地上部分  土壤下部分  ComCat^  水    68.33±8.5a  71.67±10.27a  71.67±6.24a  63.33±10.27a

然而，T.violacea的地上和土壤下部分粗提取物在与水对照品相比时对水芹幼苗的胚芽鞘和根具有显著刺激作用。在所述提取物与商品生物刺激剂ComCat^之间的生物刺激活性方面不存在显著性差异(附图4和5)。

(6)与来自Tulbaghia violacea的提取物联合的百子莲粗提取物的抗真菌活性

按照本文对T.violacea所述方法类似的方式制备百子莲属种，诸如百子莲的粗提取物或干粉。按照1∶1的比例混合提取物或干粉并且以0.25mg/ml至2mg/ml的不同浓度施用水溶液。

有意义的是注意到以0.5mg/ml施用的两种提取物的50∶50混合物表现出对6种测试真菌的完全控制作用(表5)，而迄今为止与之相比，单独施用2-倍浓度(1mg/ml)的百子莲制品或Tulbaghiaviolacea制品对测试真菌的菌丝体生长的抑制作用并不完全。甚至0.25mg/ml浓度的联合提取物/干粉制品(1∶1)也可以导致对相同真菌系统的全面抑制作用，高于90％，从而表明了在该联用系统中实际存在着显著的协同作用。使用其它植物保护剂可观察到相同的作用。

表5：以0.5mg/ml施用的、按1∶1的比率共同使用的来自T.violacea(X)和百子莲(Y)的地上部分的粗提取物的体外抗真菌活性

提取物混合物(50∶50)植物材料不同真菌的菌丝体生长抑制％真菌灰色葡萄孢 尖孢镰 胞整齐小核菌 茄属丝 核菌 疖葡萄 座腔菌 终极腐 霉植物X+植物Y(50∶50)地上部分100a±0 100a±0100a±0 100a±0 100a±0 100a±2标准品100a±0 70c±368c±4 38±2 87bc±3 4f±1

标准广谱杀真菌剂；多菌灵/苯醚甲环唑(Eria^)数值后的不同字母表示统计学显著性差异。

(7)概述结果

T.violacea地上和土壤下部分粗提取物的体外真菌毒性作用明显高于合成杀真菌剂的体外真菌毒性作用。所有测试真菌均对所述提取物敏感，从而强调了其广谱潜能。考虑到T.violacea易于生长并且可以多年不用照料这一事实，它是在考虑天然杀真菌剂产生过程中作为供体植物进行大规模栽培的强力候选物。

储存在-20℃下的1年年龄的T.violacea提取物的毒真菌性的下降对在田间条件下使用而言对环境理想。鉴于目前对有机耕作的强调，应强烈考虑从T.violacea提取物研发天然杀真菌剂。地上部分提取物就与土壤下部分提取物在抑制广谱植物病原体菌丝体生长方面同样有效这一事实表明可以按照无破坏性方式收获栽培的植物。土壤下部分由此可以保留在土壤内以便按照可持续的方式产生下一季节的收获。

此外，T.violacea的地上和土壤下部分粗提取物和商品生物刺激剂ComCat^在前90分钟内显著增加了单一培养酵母细胞的呼吸速率并且在孵育120分钟候后减缓。表明了显著的生物刺激作用。这意味着与水相比，两种提取物和ComCat^刺激了更多的二氧化碳生产，即增加了呼吸速率，从而制得更多可利用能量用于萌发和幼苗生长。因此，看起来在高呼吸速率与幼苗生长之间存在正相关性，因为两种器官粗提取物在96小时期限内均比水对照品显著刺激水芹(Cress)幼苗胚根和胚芽鞘生长。在本研究中，在粗提取物与ComCat^之间在刺激幼苗生长方面未观察到显著性差异，从而使得T.violacea提取物等同于商品生物刺激剂。从统计学上讲(P＜0.05)，与ComCat^和水对照品相比，水芹种子萌发对两种植物器官提取物未表现出显著性反应。本研究揭示出T.violacea提取物确实具有生物刺激特性，尤其是在促进幼苗生长方面。后者对这一问题的完整规模性研究提出了挑战，以便再评价在田间条件下施用的可能性。总之，T.violaceae粗提取物的高于平均值的广谱抗真菌活性以及较低的抗细菌活性和显著的生物刺激特性产生了如下结论：即来自T.violacea的粗提取物对这些植物在生物学植物保护中的应用是有利的。

基于来自具有植物保护特性的两种或多种植物的制剂的联合的提取物/干粉(其中至少一种为T.violacea)至少在体外基于协同作用表现出超过广谱的抗真菌和生物刺激功效。

(E)来自Tulbashia violacea的提取物对豌豆(豌豆(Pisum sativum))叶上的豌豆球腔菌(Mycosphaerella pinodes)的体内控制

1.一般说明

豌豆球腔菌导致的豌豆(Pisum sativum)褐纹病(Ascochytablight)在全世界发生并且导致产量损失达30％。它是具有经济重要性的病害并且可以导致为人和动物消耗种植的豌豆产量严重下降。它是对紫花豌豆产量的主要束缚并且在许多国家成为最具毁坏性的豌豆叶病害。在豌豆幼苗出现时，真菌感染它们，导致带状环茎损害。感染茎产生小的棕色条纹，随后在颜色上变蓝黑色，从而减少紫花豌豆种群并且增加倒伏。坏死性损害在由污染的种子生长出的豌豆植物的所有地上部分，包括豆荚上发生。豌豆球腔菌在整个季节中通过器孢子扩散。在孢子萌发后，真菌在植物表面上生长，此后形成apersorium并且穿透角质层。症状在最佳条件下早至感染后24小时出现并且特征在于在地上组织上棕色到淡紫色的聚集的损害。未萌发的孢子在干燥条件下保持活力达21天。感染和病害发展高度依赖于温度和叶潮湿。

对豌豆(豌豆)中的黑斑病或褐纹病的原因豌豆球腔菌测试T.violacea的粗甲醇地上部分提取物。在用所述提取物处理之前和之后给叶接种孢子时，该粗提取物防止了豌豆叶的豌豆球腔菌孢子感染，从而证实完全抑制了孢子萌发。这种粗提取物对叶未表现出毒害植物反应，甚至在最高施用浓度下也是如此。

2.T.violacea的制剂在温室条件下的体内抗真菌活性

首先使用粗提取物处理脱离的豌豆叶，随后在30分钟后进行孢子接种，上述过程在所有测试浓度下均完全抑制了叶上的损害形成(表6)。在接种前用标准杀真菌剂处理时也是这样的情况。然而，当给叶首先接种孢子，随后用不同浓度的粗提取物处理时，损害在使用0.25mg/ml和0.5mg/ml的低浓度提取物处理的叶上形成(分别为2.38和1.88mm；表6)。接种孢子，随后在两个相同低浓度下用地上部分的粗提取物处理表现出显著(P＜0.05)优于接种孢子、随后用标准杀真菌剂处理对损害发展的抑制作用(3.63mm)，而后者在与对照品相比时显著抑制了损害形成(仅接种孢子，9.44mm)。在1.0和2.0mg/ml浓度下，T.violacea的地上部分提取物完全抑制了豌豆球腔菌孢子对豌豆叶的感染(表6)。

使用在用植物提取物，即T.violacea的粗提取物处理之前或之后接种豌豆球腔菌孢子的豌豆叶进行的体内筛选试验在孢子接种前施用所述提取物时可以在使用的最低浓度(0.25mg/ml)下抑制100％豌豆球腔菌的孢子萌发。这一结果在与其它植物，诸如来自百子莲的提取物相比时具有极为有利的价值，百子莲并非在1mg/ml前的浓度下就表现出100％的抑制作用。

表6：来自T.violacea地上部分的粗提取物对豌豆叶上的豌豆球腔菌的体内活性

  植物Y首先在叶上喷雾提取物并且在30分钟后接种孢子    2mg ml^-1    1mg ml^-1    0.5mg ml^-1    0.25mg ml^-1    *杀真菌剂    标准品    仅孢子    0    0    0    0    0    9.44    100％    100％    100％    100％    100％    -首先给叶接种孢子并且在30分钟后给叶上喷雾提取物    2mg ml^-1    1mg ml^-1    0.5mg ml^-1    0.25mg ml^-1    *杀真菌剂    标准品    0    0    1.88    2.38    3.63    9.44    100％    100％    80％    75％    62％    -

*标准广谱杀真菌剂；多菌灵/苯醚甲环唑(Eria^)

(3)来自T.violacea的制剂在温室条件下对豌豆叶的毒害植物作用

T.violacea地上部分的粗提取物在其与豌豆叶相互作用和诱导豌豆叶坏死的潜能方面的体内植物毒性等级揭示出粗提取物甚至在最高测试浓度下也无毒害植物作用(表7)，并且所述提取物的无症状作用与水和标准杀真菌剂对照品的无症状作用类似。

表7：在6个等级的评分法中，使用不同浓度的Tulbaghia violacea地上部分提取物直接接种第四结节豌豆小叶后的平均叶植物毒性症状等级。

作为叶处理施用的植物提取物    提取物浓度    豌豆叶上的平均损害大    小(mm)单独的地上部分提取物单独的标准杀真菌剂水对照品仅孢子混悬液    2mg ml^-1    1mg ml^-1    0.5mg ml^-1    0.25mg ml^-1    0±0a    0±0a    0±0a    0±0a    0±0a    0±0a    4±0.29b

按照最小显著性差异(Least Significant Difference，LSD)统计学程序，使用不同字母命名的值具有显著性差异(P＜0.05)。

(4)一般讨论

T.violacea地上部分粗提取物的4种浓度(0.25，0.5，1.0和2.0mg/ml)没有任何一种对豌豆叶具有植物毒性。当首先用该提取物处理豌豆叶并且随后在30分钟后接种孢子时，该提取物以0.25mg/ml的最低浓度完全抑制了豌豆球腔菌孢子的萌发。这表明T.violacea地上部分粗提取物表现出用作对豌豆叶上豌豆球腔菌导致的褐纹病的防御措施而不导致损害植物的潜能。根据Benner(1993，Pesticide Science 39：95-102)所述，植物毒性为评价植物提取物作为农业中天然农药的应用潜能的决定性因素。

此外，当在使用T.violaceae地上部分粗提取物处理前30分钟给豌豆叶接种豌豆球腔菌时，1mg/ml浓度完全抑制了孢子萌发和随后的损害形成，表明该粗提取物还具有用作对褐纹病的纠正措施的潜能。

在本研究中获得的结果证实至少在受控条件下T.violaceae粗品控制农作物真菌感染的潜能。与作为防御措施所需的较低浓度相比，甚至纠正性抑制豌豆球腔菌孢子萌发所需的4倍以上浓度仍然属于经济上可行的1g/l等级。考虑到在农田条件下一般每公顷施用400升杀真菌剂溶液的平均值，所以该浓度与目前商购杀真菌剂一致。1g/l的最低抑制浓度(MIC)也远低于对Eucomis autumnalis的粗球茎提取物报导的MIC(Pretorius等，2002，Annals of Applied Biology141：125-131)。这些发现对评价T.violacea地上部分粗提取物在整合的害虫控制(IPM)系统中在将褐纹病导致的农作物损失减少到最低限度方面的潜在应用而言是有价值的。

(5)在Tulbaghia violacea田间条件下的地上部分粗提取物对高粱坚黑穗病和散黑粉病的控制

高粱(两色蜀黍(Sorghum bicolor L.Moench))是许多非发达国家中的重要食物来源并且用作大部分人的主食。它在广泛环境条件下主要生长在小规模生产系统中。然而，由于各种原因，高粱的产率低于1.0吨/ha。高粱坚黑穗病(covered kernel smuts)(Sporisoriumsorghi Link，G.P.Clinton)和散黑穗病(loose kernel smuts)(Sporisorium cruenta Kuhn，A.A.Potter)为引起产量低的主要因素。在高粱在未对这两种病原体处理种子情况下生长的地方两种病害频繁发生。

可以在田间条件下评价抗高粱坚黑穗病(Sporisorium sorghiLink)和散黑穗病(Sporisorium cruentum)的Tulbaghia violacea地上部分的粗提取物。以2.0mg/ml的比率将该粗提取物施用于每批90.0g的高粱种子批次，以0.5％(w/w)的比率给分开的各组高粱种子人工接种黑粉菌孢子。将标准杀真菌剂塞仑(Thiram)(65w)以0.25％/kg高粱种子比例处理种子并且用作阳性对照。将在收获过程中观察到的病害发生率表示为受感染的植物百分比。两种处理均显著性地(P＜0.05)减少了散黑穗病和坚黑穗病的发病率并且比未处理的对照组产量显著增加。坚黑穗病和散黑穗病的发病率和产量可以明显相关(R²＝0.92，P＜0.05)和(R²＝0.75，P＝75)。从这些结果中可以预计T.violacea的粗提取物具有研发成经济上有意义的生物杀真菌剂的潜能，从而应用于一般维持生存的的农民无法获得合成化学品的小规模的耕作系统。

在种植前，使用T.violacea的地上部分粗提取物处理高粱种子比相应未处理的对照组完全(100％)(P＜0.05)减少了坚黑穗病的发病率(表8a)并且显著减少了散黑粉病(表8b)发病率，并且在控制坚黑穗病方面比合成杀真菌剂塞仑有利。

表8a：T.violacea的地上部分粗提取物对田间条件下高粱坚黑穗病发病百分比的作用

处理    平均植物群体  平均坚黑穗病发病率％    产量(吨ha^-1)地上部分提取物塞仑    191±6a    188±12a  0±0a  0±0a    5.0±1a    4.8±0.6a对照品    174±12a  9±0b    2.9±2.1b

表8b：T.violacea的地上部分粗提取物对田间条件下高粱散黑穗病发病百分比的作用

  处理  平均植物群体  平均散黑穗病发病率％    产率(吨ha^-1)  地上部分提取物  塞仑  对照品  175±0a  175±0a  175±0a  14±3a  0±0b  32±8c    4±1.7a    3.9±1.3a    2.5±1b

按照邓肯氏最小显著性差异(LSD)统计学程序，使用不同字母命名的值具有显著性差异(P＜0.05)。

使用坚黑穗病或散黑粉病孢子接种预种植的高粱种子，但还不使用塞仑或T.violacea粗提取物处理种子(未处理的对照组)显著降低了最终的产率(表7a和7b)。就坚黑穗病而言，产率降低为46.7％，而就散黑粉病而言为55.2％。然而，在两种情况中，在使用塞仑或T.violacea粗提取物处理的批次之间在产率方面无显著性差异。在塞仑处理的与未处理的对照组之间在两种情况中也观察到显著性差异。

坚黑穗病和散黑粉病发病百分比与高粱谷粒产率成负相关(分别为R²＝-0.92和-75)，表明两种黑粉病对产率具有负面影响。

使用T.violacea地上部分粗提取物以2g/l的比例预处理高粱种子在田间条件下完全防止了坚黑穗病感染并且显著减少了散黑粉病发病率。这一结果可以有利地与标准合成杀真菌剂塞仑导致的病害发生率减少相比拟并且证实了该粗提取物的功效。尽管在未处理的对照组中坚黑穗病发病率(9％)相对低于散黑粉病发病率(25％)，但是所有(100％)从接种种子生长的植物可以完全防止坚黑穗病感染，而在使用T.violacea地上部分粗提取物处理种子后散黑粉病的发生率显著下降。从处理和未处理的种子生长的植物之间获得的谷物产率上的显著性差异证实了两种病害均对产率具有影响，也证实了粗提取物在控制两种病害中的功效。

用T.violacea地上部分粗提取物处理高粱种子对种子萌发或幼苗生长无明显的抑制作用。后者与在本研究中证实的T.violacea地上部分粗提取物对广谱真菌病原体的体外和体内抗真菌活性一起，证实了其应用潜能和可靠性。

一般而言，尽管合成杀真菌剂塞仑极为有效地控制高粱中的坚黑穗病和散黑粉病感染，但是施用包括T.violacea的粗植物提取物看起来给买不起合成化学品的大部分维持生存的农民提供了便利、有效和经济的替代品。

(6)Tulbaghia对植物防御机制的作用(SAR)

在根据本发明用Tulbaghia violacea和另一种参比植物(百子莲)的提取物处理时，植物(例如小麦和向日葵)引起PR-蛋白，诸如NADPH氧化酶、过氧化物酶和β-1，3-葡聚糖酶显著活化。使用T.violacea提取物处理的小麦植物在NADPH氧化酶活性方面表现出2个峰。在处理后6小时达到第一个峰，其中与未处理的对照组相比，在先前采样时间内活性被诱导增加36％。在处理后12小时达到第二个更高的峰，其中在先前取样时间内活性被诱导增加100％(附图8)，此后活性下降。使用T.violacea提取物处理的向日葵在处理后的前6小时过程中表现出NADPH氧化酶活性增加88.5％。这一活性水平的升高在处理后维持48小时，随后急剧下降至处理后的96小时(附图9)。使用T.violacea提取物处理小麦在24小时后导致460％的过氧化物酶活性的巨大诱导。这一活性在测试期内也保持较高(附图10)。就向日葵而言，T.violacea提取物尤其是在48小时和96小时后显著诱导过氧化物酶活性(附图11)。就T.violacea而言，48小时后诱导为112％并且在96小时后诱导为150％。然而，向日葵对照品在96小时期限内表现出过氧化物酶活性的轻微增加，表明存在一定的天然抗性。Tulbaghia提取物诱导了小麦和向日葵植物中的防御机制。这些提取物诱导了局限性获得性抗性，通过基因活化蓄积PR-蛋白和最终的系统性获得性抗性。该提取物在小麦和向日葵样品中诱导防御反应这一事实表明所述的提取物导致诱导一般性广谱防御反应。提取物诱导的与防御相关的酶活性增加程度较低，但与使用抗性栽培品种在感染过程中获得的增加相当。

(F)从Tulbaghia violacea的土壤和地上植物部分提取物中分离、纯化和鉴定抗真菌化合物

(1)从粗甲醇提取物中回收液-液半纯化提取物

地上和土壤下部分提取物中的大部分化合物与所用更具极性的溶剂相比更易溶于己烷。与在更具极性的溶剂中远低的收率相比，可以从己烷中回收来自地上植物部分的多至9.20g(14.6％)的化合物和来自土壤下部分的7.43g(8.4％)的化合物(表9)。

表9：使用液-液提取程序通过DC-值渐增顺序的溶剂从Tulbaghiaviolacea中回收化合物

    有机溶剂    地上部分提取物    土壤下部分提取物    质量(g)    回收％    质量(g)    回收％    己烷    9.20    14.6    7.43    8.4    乙醚    1.57    2.5    1.74    1.9    乙酸乙酯    0.56    0.9    1.07    1.2    二氯甲烷    0.10    0.1    0.12    0.14

(2)T.violacea的液-液地上和土壤下部分提取物的抗微生物特性

尽管所有来自T.violacea地上部分中液-液提取物均表现出对测试生物体中大部分或多或少程度的抗真菌活性，但是己烷和乙醚的液-液提取物显著(P＜0.05)更高(附图6)。除众所周知对杀真菌剂存在抗性的终极腐霉以及茄属丝核菌(61％)外，己烷和乙醚提取物中的一种或两种对所有测试真菌的菌丝体生长抑制作用均超过80％。两种提取物与用作阳性对照的标准杀真菌剂相比更佳。T.violacea土壤下部分中的抗真菌化合物(附图7)表现出与地上部分情况(附图6)相同的在液-液提取后蓄积在己烷和乙醚级分中的趋向。然而，就疖葡萄座腔菌而言，所有提取物均例外地表现出高度抗真菌活性。

3)最具活性的己烷提取物的柱色谱分级分离(CCF)

就T.violacea的地上和土壤下部分而言，仅可以通过柱色谱法进一步纯化活性己烷液-液提取中的化合物。做出这一判断的原因在于，就地上部分而言，可从己烷提取物中回收比乙醚活性提取物多6倍的化合物，而就土壤下部分而言，可从己烷提取物中回收比乙醚活性提取物多4倍的化合物。就地上和土壤下部分每一种而言，可以从己烷提取物中获得1500个以上的柱色谱级分。在使它们进行Q-TLC后，合并那些具有类似图谱的级分。按照这种方式，对地上部分可以获得28个合并的柱级分并且对土壤下部分可以获得20个合并的柱级分。结果如表10中所示。仅来自地上部分的4个合并的柱级分(A₅、A₆、A₇和A₈)分别展示出高于平均值的抗真菌活性(100，95，52.6和60.5％)，而仅来自土壤下部分的2个合并级分(B₂和B₃)具有活性(分别为87和97％)。剩余的级分无法有效地抑制尖孢镰胞的菌丝体生长(表10)。可以通过制备型薄层色谱法(P-TLC)只进一步纯化对测试真菌表现出平均超过50％菌丝体生长抑制的合并的柱级分。取50％抑制作用作为标准的原因在于补偿活性物质可能协同起作用、而在分开时活性可能下降的可能性。

表10：T.violacea的地上和土壤下部分提取的合并柱色谱级分对测试生物体尖孢镰胞菌丝体生长的抑制百分比(％)(B＝土壤下部分而A＝地上部分)。

  来自A的级  分编号  回收的质  量(mg)  来自A的化  合物的菌丝  体生长抑制％    来自B的    级分编号    回收的质    量(mg)    来自B的化    合物的菌丝    体生长抑制％  1  2  3  4  A₅/5  A₆/6  A₇/7  A₈/8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21-28  杀真菌剂  对照品  19.9  28.9  105.8  97.9  316.5  460.7  430.6  353.5  120.4  121.3  426.0  848.4  53.9  210.2  59.3  294.7  288.7  196.9  218.0  78.1  2201.5  1.5  11.7  11.7  25.9  100.0  95.0  52.6  60.5  34.7  0.3  10.9  -10.3*  -1.4*  -3.3*  5.8  1.6  30.1  40.5  8.2  15.8  -23.4*  78.0  0    1    B2/2    B3/3    4    5    6    7    8    9    10    11    12    13    14    15    16    17    118    19    20    147.4    411.1    109.8    947.3    10.7    17.7    22.7    26.1    3.1    33.6    155.8    24.3    478.0    590.2    73.8    197.1    114.4    213.6    110.3    447.2    24.0    87.0    97.0    12.0    12.7    11.6    12.4    12.0    11.9    20.0    9.6    14.3    3.5    27.5    16.5    27.8    11.7    34.8    19    37.9    78.0    0

带负号(-)值的数值表示菌丝体生长刺激。

仅将表10中显示的6个合并的柱色谱活性级分(A₅、A₆、A₇、A₈、B₂和B₃)通过P-TLC进行进一步纯化。

(4)合并的活性柱色谱级分的活性定向的制备型薄层色谱(P-TLC)纯化

通过P-TLC对6个合并的柱级分进行活性定向的化合物纯化，从地上部分级分中产生4种化合物(A_5.2，A_6.1，A_7.1和A_7.2)，它们表现出高于50％的抗真菌活性(分别为100，85，87和50％)，并且从土壤下部分级分中产生2种化合物(B_2.2和B_3.2)，它们表现出高于50％的抗真菌活性(分别为87和72％；表11)。鉴定了这6种化合物并且可以通过核磁共振(NMR)光谱测定阐明其化学结构。有意思的是，在以半纯化形式一起使用时表现出60.5％菌丝体生长抑制作用(表10)的地上部分柱色谱级分8(A₈)中的化合物在P-TLC纯化后分开时失去了其抗真菌活性(表11)。

表11：P-TLC分离后T.violacea的不同化合物对尖孢镰胞的菌丝体生长抑制百分比(％)

  地上部分化  合物序号    质量(mg)    抑制％    土壤下部分    化合物序号    质量(mg)    抑制％  A_5.1    94.9    0    B_2.1    26.2    0  A_5.2    44.1    100    B_2.2    110.3    87  A_6.1    25.3    85    B_3.2    15.8    72  A_6.2    34.1    48    B_3.3    5.9    0  A_6.3    10.5    37  A_7.1    9.3    87  A_7.2    24.5    52  A8_.1    7.1    0  A_8.2    6.2    5  A_8.3    9.1    0

(5)通过核磁共振(NMR)光谱法和质谱法鉴定纯化自T.violacea地上和土壤下部分提取物的活性化合物

为了获得可接受水平的纯度，使T.violacea地上和土壤下部分的复杂的半纯化己烷提取物进行色谱分级分离，随后进行P-TLC分离。通过使用己烷-丙酮(95∶5)作为洗脱液的以30ml/小时流速的硅胶柱色谱法对己烷提取物进行分级分离，随后用己烷-丙酮(9.5∶0.5)进行几次P-TLC纯化，得到6个相当纯的级分(参见上文)。对所述级分进行生物测定显示仅来自土壤下部分的2个级分和来自地上部分的4个级分表现出富有希望的与本研究相关的结果。

在所有级分中存在三亚油酸甘油酯阻碍了分离并且使得结构阐明变得困难。通过P-TLC进一步纯化级分得到相当纯的化合物(来自土壤下部分的B_2.2和B_3.2和来自地上部分的A_5.2、A_6.1、A_7.1和A_7.2)，可以通过标准NMR分光镜法和质谱法测定其结构。强烈的大蒜香味提示化合物属于硫醇(thiol)(硫醇(mercaptan))类。在所有化合物的¹H NMR光谱中不存在芳族化合物和alkenoid质子(δ5-8之间)消除了其结构中的芳香特性。然而，所有化合物的单一¹H NMR光谱仅展示出在δ2.0-4.5之间产生共振的单峰。所有化合物的所有相应¹³C NMR光谱均未表现出高于45ppm的共振，从而进一步消除了结构中的C＝S和C＝O键特性。这些发现限制了化合物属于硫代或氧代脂族类的可能性。进一步评价¹³C NMR光谱证实在～45ppm处出现最具去屏蔽的信号，这是硫键(C-S)的特征。本发明已经发现并且鉴定了如下6种具有抗真菌活性的化合物：

化合物(1)

实验式：¹CH₃S³CH₂SS⁶CH₂S⁸CH₃2，4，5，7-四硫杂辛烷

可以通过P-TLC纯化(己烷∶丙酮：9.5∶0.5)从不纯的柱级分B₂中分离化合物(1)或B_2.2，为黄色油状物。化合物(1)的¹H NMR光谱显示在δ_H 4.00处有对4个质子积分的单峰(δ_C 45.2ppm)并且在δ_H 2.21处有对6个质子积分的单峰(δ_C 17.3ppm)，从而提示了1个硫代亚甲基(thiomethylene)和2个硫代甲基(thiomethyl)。δ_H 4.00处的亚甲基质子和δ_H 2.11处的甲基质子分别与存在的CH₂-S和CH₃-S基团一致。(1)的电子电离质谱分析(EIMS)显示在m/z 186处有基峰，与分子式C₄H₁₀S₄一致，并且这一结果与提示的结构(1)相符，即一种Burton和Kaye(1992)在先分离的化合物。

化合物(2)

实验式：¹CH₃S³CH₂SSS⁷CH₂S⁹CH₃2，4，5，6，8-五硫杂壬烷

在P-TLC分离(己烷∶丙酮：9.5∶0.5)后，可以从合并的柱级分B₃中将化合物(2)或B_3.2分离为黄色油状物。在化合物(2)(板6.3)的¹HNMR光谱中，仅可以观察到分别对2个质子和6个质子积分的在δ_H4.15和δ_H 2.29处的两个单峰。(2)的¹H NMR数据与(1)的¹H NMR数据极为类似，从而提示了极为类似的结构。对峰进行积分(intergrals)提示存在2个硫代亚甲基和2个硫代甲基。结构(2)的指定基于化合物(1和2)的¹H NMR光谱中质子的化学位移比较。(2)的¹H NMR光谱中更多的去屏蔽质子在结构中需要额外的硫原子。

化合物(3)

实验式：¹CH₃SS⁴CH₂S⁶CH₂S⁸CH₂S¹⁰CH₃2，3，5，7，8-五硫杂癸烷

通过P-TLC(己烷∶丙酮：9.5∶0.5)纯化记级分A₅而得到化合物(3)或A_5.2，为黄色油状物，它表现出与化合物(1和2)的相似性。化合物(3)的¹H NMR光谱显示在δ_H 4.00周围有3个亚甲基质子并且在δ_H2.00周围有2个甲基质子，这分别与存在CH₂-S和CH₃-S基团一致。¹³C NMR光谱中峰的共振与¹H NMR光谱中的相应峰相符。将δ_H 3.8(δ_C37.2ppm)、δ_H 3.95(δ_C 40.9ppm)和δ_H 4.11(δ_C 45.5ppm)处的单峰分别指定为H-8、H-6和H-4。在δ_H 2.18(δ_C 15.0ppm)、H-10和2.25(δ_C 15.6ppm)、H-1处观察到甲基质子。电子电离质谱分析(EIMS)显示在m/z232处的[M⁺]，与分子式C₅H₁₂S₅一致，并且这一结果与提示的化合物(3)的结构相符。

化合物(4)

实验式：¹CH₃S³CH₂S⁵CH₂S⁷CH₃2，4，6-三硫杂庚烷

纯化化合物A_6.1得到化合物(4)的尝试并不成功。化合物(4)的¹HNMR光谱显示相应于¹³C NMR光谱的2个亚甲基在单峰和1个甲基单峰。与化合物(1)的¹H NMR光谱相比，这一结果表明化合物(4)和(1)以几乎等量混合。此外，观察到化合物(4)的¹H NMR光谱，亚甲基质子(δ_H4.5)与化合物(1)中的相比为去屏蔽的，这是因(1)的结构中有额外的硫原子所致。当化合物(1)的亚甲基质子(δ_H 4.00)和甲基质子(δ_H2.21)从光谱中消除时，剩余的质子被指定给化合物(4)。

化合物(5)

实验式：¹CH₃S³CH₂S⁵CH₃2，4-二硫杂戊烷

通过P-TLC分离(己烷∶丙酮：9.5∶0.5)从级分A₇中分离化合物A_7.1得到化合物(5)，为黄色油状物。在¹H NMR光谱中观察到分别在δ_H3.67和2.18处作为单峰共振的亚甲基和甲基质子。可以将与对2个质子积分的CH₂-SS相比较少去屏蔽的CH₂-S亚甲基(δ3.67)和对6个质子积分的特征性CH₃-S甲基质子分别指定给H-2和H-1。

化合物(6)

实验式：CH₃SO₂CH₃

Methylthiosulphonate(甲基硫代磺酸酯)

通过P-TLC分离(己烷∶丙酮：9.5∶0.5)从级分A₇中分离化合物6(A_7.2)也得到黄色油状物。尽管化合物(6)的¹H NMR光谱显示了属于亚油酸的峰，但是在δ3.7处突出的单峰并不属于观察到的那些峰的组成部分。由于分离的化合物不纯，所以不能测定精确的质量。对推定结构(6)的指定完全基于¹H NMR光谱中甲基质子的共振位置。电负性硫和氧原子使-CH₃质子去屏蔽，从而使它们移动至化学位移δ3.7，与之相对，CH₃S质子在δ2.10周围共振。

(6)讨论

在本研究中，T.violaceae的地上和土壤下部分的液-液提取操作步骤证实己烷提取了比其它有机溶剂乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取在实质上更多的化合物，表明该植物包含大量非极性物质。这一结果可以通过对液-液提取物的质量回收测定和定性薄层色谱法(Q-TLC)图谱证实。尽管与己烷相比，可以从地上部分的乙醚提取物中回收少6倍的化合物，从土壤下部分提取物中回收少4倍的化合物，但是乙醚提取了次最多的化合物。可以从剩余的更具极性的溶剂乙酸乙酯和二氯甲烷中回收少得多的化合物。

随后对抗真菌活性的生物测试证实己烷和乙醚提取物中包含大部分活性物质，因为它们两者均表现出对全部6种测试真菌的较高的活性。然而，尽管乙酸乙酯和二氯甲烷液-液提取物表现出远低的活性，但是它们也表现出一定程度的抗真菌活性，表明看起来活性成分稀疏地分布在有机溶剂之间，或其它更具极性的物质也具有活性。对某些真菌(例如灰色葡萄孢、整齐小核菌和疖葡萄座腔菌)而言，地上和土壤下部分提取物的己烷与乙醚提取物之间在菌丝体生长抑制方面无显著性差异。因为可以从己烷提取物中回收实质上更多的化合物并且乙醚也具有相当的非极性，所以推定这两种溶剂中包含的活性成分可能相同。对己烷提取物中的化合物进行活性定向的柱色谱分离从地上部分提取物中得到4个合并的活性级分并且从土壤下部分提取物中得到2个合并的活性级分。随后通过P-TLC从这些柱级分中活性定向纯化化合物导致分离了6种纯的化合物，它们均表现出高于平均值的抗真菌活性。通过NMR光谱测定，可以阐明其化学结构并且鉴定这些化合物。可以从T.violacea的土壤下部分中鉴定2种抗真菌化合物，即已知的2，4，5，7-四硫杂辛烷和新的2，4，5，6，8-五硫杂壬烷。从地上部分中可以鉴定4种抗真菌化合物。在它们中，仅已知甲基硫代磺酸酯(methyl thiosulphonate)，而2，3，5，7，8-五硫杂癸烷，2，4，6-三硫杂庚烷和2，4-二硫杂戊烷为很可能新的化合物。令人意外的是如下事实：纯化自T.violaceae地上和土壤下部分的所有抗真菌化合物除methylthiosulphonate外均为相当简单的脂族含硫烷类。

最后，需要特别考虑的方面在于如下事实：T.violacea的甲醇粗提取物对全部测试真菌的广谱抗真菌活性均高于液-液提取物和半纯化柱色谱级分。此外，活性半纯化柱色谱级分之一(地上部分的A₈)表现出高度抗真菌活性，但在分离包含在该级分中的化合物时，活性丧失。这一结果使得从植物中分离和鉴定所有活性物质变得复杂，并且强烈表明植物对生物性胁迫情况的天然抗性主要依赖于不同活性化合物的协同或联合作用。T.violaceae中已知存在的为抗感染剂的极性皂苷类和黄酮类化合物(Pretorius，2003，Current MedicinalChemistry：Anti-infective Agents 2：335-353.)与本发明鉴定的存在的含硫的活性化合物联合在一起可以解释在粗和半纯化提取物中检测到的抗真菌活性高于纯化的化合物的抗真菌活性。

附图说明

附图1：浓度为1g/l的新鲜的T.violacea粗甲醇提取物对植物致病真菌的体外生长抑制百分比(％)。对每种真菌，用不同字母命名的棒形图根据Tukey′s平均显著性差异(MSD)统计学程序具有显著性差异(P＜0.05)。Y-轴：菌丝体生长抑制(％)。1＝地上部分；2＝土壤下部分；3＝fungizidee。

附图2：在-20℃下储存1年后浓度为1g/l的新鲜的T.violacea粗甲醇提取物对植物致病真菌的体内生长抑制百分比(％)。对每种真菌，用不同字母命名的棒形图根据Tukey′s平均显著性差异(MSD)统计学程序具有显著性差异(P＜0.05)。Y-轴：菌丝体生长抑制(％)。1＝地上部分；2＝土壤下部分；3＝fungizide。

附图3：T.violacea地上和土壤下部分粗提取物在3小时期限内以30分钟间隔对单一培养酵母细胞呼吸速率的作用。ComCat^和蒸馏水用作对照品。X-轴：时间(分钟)；Y-轴：CO₂释放(cm³)。

附图4：T.violacea地上和土壤下部分粗提取物在96-小时孵育期内以24小时间隔对水芹(Cress)幼苗胚根生长的作用。ComCat^和蒸馏水用作对照品。X-轴：时间(小时)；Y-轴：胚根生长(mm)。

附图5：T.violacea地上和土壤下部分粗提取物在96-小时孵育期内以24小时间隔对水芹(Cress)幼苗胚芽鞘生长的作用。ComCat^和蒸馏水用作对照品。X-轴：时间(小时)；Y-轴：胚芽鞘生长(mm)。

附图6：浓度为1g/l的T.violacea半纯化地上部分提取物对植物致病真菌的体外菌丝体生长抑制百分比(％)。对每种测试真菌，用不同字母命名的棒形图根据Tukey′s平均显著性差异(MSD)统计学程序具有显著性差异(P＜0.05)。Y-轴：菌丝体生长抑制(％)。

1＝己烷，2＝乙醚，3＝乙酸乙酯，4＝二氯甲烷，5＝fungizide。

附图7：浓度为1g/l的T.violacea半纯化土壤下部分提取物对植物致病真菌的体外菌丝体生长抑制百分比(％)。对每种测试真菌，用不同字母命名的棒形图根据Tukey′s平均显著性差异(MSD)统计学程序具有显著性差异(P＜0.05)。Y-轴：菌丝体生长抑制(％)。

1＝己烷，2＝乙醚，3＝乙酸乙酯，4＝二氯甲烷，5＝fungizide。

附图8：根据本发明用Tulbaghia提取物和百子莲属提取物(作为参比物)处理的小麦中依赖于处理后时间的NADPH氧化酶活性模式。

附图9：根据本发明用Tulbaghia提取物和百子莲属提取物(作为参比物)处理的向日葵中依赖于处理后时间的NADPH氧化酶活性模式。

附图10：根据本发明用Tulbaghia提取物和百子莲属提取物(作为参比物)处理的小麦中依赖于处理后时间的过氧化物酶活性模式。

附图11：根据本发明用Tulbaghia提取物和百子莲属提取物(作为参比物)处理的向日葵中依赖于处理后时间的过氧化物酶活性模式。

实施例：

在以下概述的实施例中使用NCSS 2000统计学程序对数据进行方差分析(ANOVA)，以便鉴定处理之间的差异。将用于平均值比较的Tukey′s平均显著性差异(MSD)程序(Steele和Torrie，1980，Principles and procedures of statistics，2^th Edition.New York：McGraw-Hill.)应用于分离平均值(P＜0.05))。

实施例1：植物材料

Tulbaghia violacea全植物最初采集自Blyde River CanyonNature Reserve(BRC)South Africa。由来自南非Bloemfontein国家博物馆的分类学家对该物种进行分类鉴定。按照标准操作步骤处理证明样本并且寄存在博物馆的植物标本室中。随后在2001，2002和2003年1月至3月之间从Botanical Gardens，Bloemfontein采集所述种的批量样品。

实施例2：植物材料的制备

对未知的材料处理遵循健康和实验室安全标准，因为假定它为危险的。预先对植物材料检验任何形式的感染或昆虫损害并且不使用这类感染的材料。将植物分成：(a)地上部分(茎和叶)和(b)土壤下部分(根茎和根)。在测定不同植物部分的鲜质量后，在35℃下的烘箱内将植物材料干燥2周并且测定干质量。随后使用Retsch SM 2000切割粉碎机研磨干燥的植物材料并且再次测定干质量。在研磨后，将有代表性的少量每一样品转入Ziploc塑料袋，密封并且储存在-20℃下的冰箱内，直到制备粗提取物为止。按如下计算研磨过程中的损耗百分比：

实施例3：粗提取物的制备

将2份研磨的样品(地上和土壤下部分)转入单独的5-升标记的Qorpak瓶并且用100％甲醇以2mlg^-1干重的比例覆盖。紧密关闭盖子，用石蜡膜密封以防止渗漏并且放在辊式磨碎机上24小时。通过替换甲醇进行两次提取。随后将每一样品过滤两次，第一次在真空中通过双层Whatman滤纸(No.3和No.1)，使用布氏漏斗过滤，且然后通过单张Whatman No.1滤纸经重力过滤。通过在30-40℃下使用Büchi旋转蒸发器进行真空蒸馏从提取物中除去大部分甲醇。在第2天对重新提取的植物材料再进行相同的操作步骤。合并来自两次提取的植物材料的最终滤液并且在真空中通过Speedvac浓缩器在-140℃下24小时浓缩至干。在测定干物质产率后，分别将粗的地上和土壤下部分储存在-20下，备以后使用。

实施例4：T.violacea的甲醇粗提取物在抗细菌活性中的筛选

(a)细菌母培养物的制备

通过琼脂平板扩散测定技术定性地评价抗细菌活性(Rios等，1988，Journal of Ethnopharmacology 23：127-149)。将平板计数琼脂(PCA)用于预先制备下列6种植物病原体和1种人细菌的母培养物：Clavibacter michiganense pv.michiganense；丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv syringae)；胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp carotovora)；根癌土壤杆菌；Ralstonia solanacearum；野油菜黄单胞菌菜豆病原变种(Xanthomonas campestris pvphaseoli)；以上均为植物病原体；以及人病原体粘膜炎莫拉氏菌(MC)。对每种细菌制备两份储备培养物，其中之一为操作培养物，而另一个为贮存培养物。将培养物储存在5-15℃下，但将莫拉氏菌(Moraxella)储存在4℃下。

在抗细菌生物测定前2天分别给7个营养琼脂(NA)平板接种来自菌母培养物的7种细菌。在25℃下孵育它们，但在生物测定前1天在35℃下孵育莫拉氏菌平板，以便获得纯系菌落。检查所有培养物的污染情况。2天后，将2日龄的细菌培养物的未污染的纯菌落从琼脂平板中转入7支标记的包含无菌蒸馏水(就植物病原体而言)的试管，但就莫拉氏菌属而言，转入包含无菌盐水的试管。将稀释的细菌混悬液与McFarland标准品比较，以便获得1x10⁶CFUs(菌落形成单位)/ml的所需浓度。

(b)抗细菌生物测定

将5克营养琼脂溶于200ml蒸馏水，在121℃下高压灭菌20分钟并且转入7个培养皿以便冷却和凝固。通过将最高40ul转入5mm在琼脂中用无菌木制钻孔器形成的孔，将粗提取物作为在10％(v/v)DMSO(二甲亚砜)中的50mgml-1浓度的含水混悬液检测。所有活动均在预先灭菌的层流箱内进行以避免污染。将每一测试平板分成5个部分并且将提取物和10％(v/v)DMSO溶液(阳性对照)转入琼脂中的孔。将平板保持20分钟以使提取物和DMSO扩散入琼脂且随后在25℃(植物病原体)或35℃(莫拉氏菌)下孵育3天。使用无菌拭子给每个平板接种不同的细菌混悬液并且使其在平板上均匀涂展。3天后，使用数字测径器测量抑制区，不包括孔(Heisey和Gorham，1992)，并且用作抗细菌活性的定性指标。

实施例5：T.violacea的甲醇粗提取物在抗真菌活性中的筛选

将改进的琼脂稀释法(Rios等，1988，1.c.)用于测定粗提取物对测试生物体菌丝体生长的抑制作用。

(a)真菌母培养物的制备

制备在200ml蒸馏水中2％麦芽提取物琼脂(4g麦芽提取物；Difco，2.8g Technical琼脂；Difco)并且在121℃下高压灭菌20分钟。随后在45℃下的水浴中冷却培养基并且将60ul 33％(m/v)链霉素溶液加入到基础培养基中以便控制细菌生长。然后将琼脂培养基转入培养皿并且使其凝固。对下列6种植物致病真菌制备每种真菌的2份母培养物：灰色葡萄孢、尖孢镰胞、整齐小核菌、茄属丝核菌、疖葡萄座腔菌和终极腐霉。将每种真菌的接种物面向下放置在单独培养皿中的琼脂培养基上(两个重复试验)并且在25℃下孵育8-10天。随后使用蒸馏水半充满12个玻璃培养瓶并且在121℃下高压灭菌20分钟。然后将包含琼脂片的一对培养皿(每种真菌两个重复试验品)转入高压灭菌的培养瓶，用石蜡膜密封并且储存在4℃下，但将茄属丝核菌和终极腐霉储存在25℃下。

(b)生物测定

如对制备母培养物所述制备2％的麦芽提取物琼脂(MEA)。将每种提取物溶于100ml无菌蒸馏水并且在琼脂中改变以得到1mg/ml(1g/l)的终浓度。将也包含33％链霉素的培养基转入90mm无菌塑料培养皿并且使其凝固。随后对每一病原体而言单独给每一测试平板的中心接种5mm大小的塞子并且在25±2℃下的生长箱内孵育3天。在3天后通过对每一重复试验(每个生物体三份重复试验)计算两个垂直菌落直径的平均值确定放射状菌丝体生长。仅包含基础培养基的每一病原体的接种平板用作对照组。将两次测量的平均值用于计算抑制百分比(％)：

另外，将包含1ug/ml多菌灵/苯醚甲环唑(Eria^-187.5gL^-1EC)的平板用作分别对每一测试生物体的标准杀真菌剂以便通过比较测定提取物的有效性(表示为％抑制)。一式三份进行每次处理。

实施例6：T.violacea的甲醇粗提取物在生物刺激活性中的筛选

将两种方法应用于测定T.violacea的器官粗提取物的生物刺激潜能：

方法1：测定粗提取物对单一培养的酵母细胞呼吸速率的作用的测压法

将具有用来包含酵母细胞的短凸出部件(贮器)和在上端封闭以收集CO₂气体的长刻度管的专门建造的玻璃呼吸测定计用于测定T.violacea器官(地上和土壤下部分)粗提取物对酵母细胞呼吸速率的作用。将干面包酵母(0.8g)放入呼吸测定计贮器。随后将预先以0.5mg/ml浓度制备并且包含用作酵母细胞呼吸底物的5mg/ml葡萄糖的70ml每种植物提取物加入到呼吸测定计中。将该仪器向侧面倾斜以便释放留在干面包酵母中的气泡并且放入预加热至29℃的水浴中。将0.5mg/ml商购生物刺激剂ComCat^(EP1 051 075)用作阳性对照(按照制造商的最佳浓度；Agraforum，Germany)并且将蒸馏水用作第二种对照品。在3小时孵育期内，通过从刻度管中读取释放的气体体积以30分钟间隔测量以cm³计的酵母细胞释放的CO₂。按照一式三份进行测试。

方法2：不同器官粗提取物对水芹(Cress)种子萌发百分比和随后的幼苗生长的作用

将2片专用萌发纸(30×30cm)用于测试T.violacea的器官粗提取物对水芹(Cress)种子萌发以及随后的幼苗生长的作用。在1张纸上画距上部10cm的线并且使20粒水芹种子均匀间隔排列在该线上。将第二张萌发纸放在第一张的上部并且用0.5mg/ml粗提取物溶液，蒸馏水(阴性对照)或0.5mg/lComCat^溶液(阳性对照)湿润。将两张纸纵向卷起并且直立放入包含地上或土壤下部分粗提取物，蒸馏水或ComCat^溶液的锥形瓶并且避光保持在25℃下的生长室内。在4天孵育期内以24小时间隔测定种子萌发以及胚芽鞘和根长。按照一式三份进行测试。

实施例7：豌豆(Pisum sativum)植物的栽培

将获自地方种子商人的100粒Pisum sativum cv.Mohanderfer种子距表面2cm播种在20个罐中，每个罐5粒种子，使用Bainsvlei土壤，并且施用标准NPK肥料混合物。使植物在温室内生长4周，同时维持土壤的田间持水量。4周后，从每一植物的第四节上小心取下同龄的2片完全展开的小叶并且用于监测T.violacea地上部分提取物体内控制褐纹病的潜能。

实施例8：豌豆球腔菌的分离

从衰老时的紫花豌豆(field pea)的各种冬季栽培品种的患病叶和茎中分离豌豆球腔菌。感染植物材料从埃塞俄比亚中部和东南部豌豆种植地区收集。将患病组织片在96％(v/v)乙醇中1分钟，在3.5％(v/v)NaCl溶液中3分钟(Moussart等，1998，European Journalof Plant Pathology 104：93-102)和在96％(v/v)乙醇中30秒进行表面无菌化。随后将组织以无菌方式转入使用链霉素(0.3ml/l)改变的9cm培养皿中的玉米粉琼脂中并且在20±1℃下的生长室内孵育。然后使最初获自植物材料的分离物生长在由4g麦芽糖，2g KNO₃，1.2g MgSO₄，2.7g KH₂PO₄和20g琼脂组成的Coon′s培养基(AH等，1978，Australian Journal of Agricultural Research 29：841-849)中。将培养基孵育14天以便获得器孢子。为了获得来源于单一单核细胞的分离物，将器孢子的混悬液在15％水琼脂上划线，在20±1℃下孵育过夜并且在解剖显微镜(80x放大倍数)下检验。切开从器孢子的一个细胞产生的芽管并且转入Coon′s琼脂(Clulow & Lewis，1992，Plant Pathology 41：362-369)。获得6种豌豆球腔菌分离物。将所有来自单孢子和培养物的分离物维持在Coon′s琼脂斜面上并且储存在5℃下的黑暗中。

实施例9：豌豆球腔菌孢子混悬液的制备

通过将30g燕麦在1升蒸馏水中温和加热1小时，频繁搅拌且随后通过细筛过滤，此时将体积重调至1升，制备燕麦粉琼脂。向滤液中加入20g工业级琼脂和0.1g三氯杀螨醇(Keltane)AP而得到2％(m/v)琼脂浓度。将琼脂高压灭菌15分钟，倾入培养皿并且使其冷却下来，此后使用豌豆球腔菌菌丝体接种3个燕麦粉平板。将平板在20℃下和12小时光周期保温箱内孵育14天，以确保产生器孢子。为了制备接种物(孢子混悬液)，将无菌蒸馏水加入到14日龄的培养物中，使用无菌玻璃棒缓慢取出孢子。随后将该混悬液通过4层粗平布过滤以便除去菌丝体并且通过血细胞计数器测定器孢子的浓度。使用无菌蒸馏水将器孢子浓度调整至1×10⁵个孢子/ml(Nasir & Hoppe，1997，Annals of Applied Biology 18：32-33)，此后接种豌豆叶。

实施例10：粗提取物植物毒性的体内评价

将豌豆种子种植在塑料罐中的Bainsvlei土壤中并且使其生长在温室中(最低温度18℃)。种植后4周，当第三和第四节上的小叶完全展开时，每个重复从植物中取下3个第四节小叶，放在Schleicher和Schull No.595滤纸上并且在9cm培养皿中使用4ml无菌蒸馏水湿润。将30ul 0.25、0.5、1.0和2.0mg/ml粗提取物溶液各自分开放在每一3片叶/培养皿上并且重复3次。用水和标准杀真菌剂(多菌灵/苯醚甲环唑)处理叶用作对照组。将包含处理的小叶的培养皿在20℃下16小时白天周期的日/夜程序的保温箱中孵育，同时每日加入2ml无菌蒸馏水以保持滤纸湿润。处理后6天，使用基于立体显微镜观察结果使用6等级评分法[0＝无症状；1＝＜5％坏死斑点；2＝＞5％坏死斑点；3＝＜50％接种区坏死；4＝50-100％接种区坏死；5＝扩散出接种区的坏死]对叶评价植物毒性症状(Clulow等，1991b，Journal ofPhytopathology 131：322-332)。

实施例11：粗提取物抗真菌特性的体内评价

如植物毒性评价测试中所述获得第四节豌豆小叶并且维持在培养皿中的湿润滤纸上。遵循两种方式，即通过在分别施用不同浓度的粗提取物前30分钟使用15ul孢子混悬液(1×10⁵个孢子/ml；Nasir &Hoppe，1997.1.c.)接种叶，和以相反的方式，用不同浓度(0.25，0.5，1.0和2.0mg/ml)的T.violacea地上部分提取物体内控制豌豆球腔菌孢子的叶感染。将目前用来抗豌豆褐纹病的标准杀真菌剂多菌灵/苯醚甲环唑(Bretag等，1995，Australian Journal of ExperimentalAgriculture 35：525-530；Moussart等，1998，European Journal ofPlant Pathology 104：93-102)以及仅用孢子混悬液接种的叶用作对照品。每个培养皿中的3片叶代表重复试验并且按照一式三份进行实验。在20℃(豌豆球腔菌孢子萌发的最佳温度)下在日/夜保温箱中孵育包含不同处理的叶的培养皿，因为光照对孢子萌发而言是必需的(Roger & Tivoli，1996，Mycological Research 100：304-306)。在孵育6天后，测量叶的损害并且将叶损害与对照品的叶损害进行比较。

实施例12：数据的统计学分析

使用SAS统计学分析程序(SAS Institute公司，SAS Institute软件：Usgae and reference.Version 6.SAS Institute)对数据进行方差分析(ANOVA)。将用于比较平均值的邓肯氏LSD(leastsignificant difference，最小显著性差异)程序应用于分离平均值(P＜0.05)。具有显著差异的处理在表中通过给定不同组字母来表示。

实施例13：种子处理

以5％(w/w)的比例人工给不同批高粱种子分开接种坚黑穗病(Sporisorium sorghi)和散黑穗病(Sporisorium cruentum)孢子，此后实施种子处理。以2.0g/l的比例将T.violacea的地上粗提取物悬浮于水中。通过在种植前在小塑料袋中充分混合24小时用15ml粗提取物处理每批90g的各批高粱种子。按照相同方式，以每kg种子0.25％(w/w)的比例施用标准合成拌种杀真菌剂塞仑(65W)并且用作阳性对照。还将高粱种子用散黑穗病和坚黑穗病孢子分开人工接种，但不用提取物或合成杀真菌剂处理，用作第二对照。

实施例14：田间试验

在2003年在埃塞俄比亚的Melkassa Research Centre进行田间试验。以随机化完全区组设计安排小块土地并且重复处理3次。在18.75m²的小块土地中用手种植5排处理的高粱种子，保持0.75cm的行距。施用标准肥料并且通过沟灌保持小块土地的田间持水量。将病患发生率记录为感染植物的百分比。对整个小块土地测定谷物产率。

实施例15活性定向的液-液提取

将按照渐增极性(介电常数)顺序排列的下列溶剂分别用于半纯化(液-液提取)地上和土壤下部分的粗提取物：己烷(DC＝2.0)；乙醚(DC＝4.3)；乙酸乙酯(DC＝6.0)；二氯甲烷(DC＝8.9)。对地上和土壤下部分进行提取。将约63.30g甲醇地上部分提取物和88.24g土壤下部分提取物各自溶于50ml蒸馏水并且与50ml己烷(1∶1比例)混合。将每种混合物在机械振荡器上剧烈振摇20分钟且随后转入分液漏斗，以使两液相分离。将分离的己烷上层转入烧杯，而如上所述将粗提取物下层再次与新鲜的50ml己烷混合物和并且振摇。使用新鲜的溶剂将分级分离重复20次以使化合物的收率最优化。使用其它有机溶剂遵循相同的操作步骤。在真空中和35℃下的水浴上通过Büchi旋转蒸发器将4种分离的级分蒸发至干。

对每种级分测定回收的干物质质量。由每种级分干燥的物质制备在水中的1mg ml^-1储备溶液。为了确立分级分离过程成功，使用0.5mm硅胶60板，应用氯仿∶甲醇∶水(80∶20∶10)作为流动相(实施例16)对每种级分获得定性薄层色谱(TLC)图谱。为了确定活性组分位于哪里，筛选8种提取物的抗真菌特性。使用如实施例5中所述的相同操作步骤。

实施例16：活性定向的柱色谱分级分离(CCF)

在对通过液-液提取获得的半纯化己烷提取物中的活性化合物进行柱色谱分离前，使用硅胶作为固定相，使用硅胶TLC-板测试最有效的溶剂系统。测试的溶剂系统范围从最低极性到最高极性并且包括：己烷∶丙酮(9.5∶0.5-6∶4)；己烷∶乙酸乙酯(8∶2-6∶4)；己烷∶丙酮∶乙酸乙酯(6∶2∶2)；己烷∶丙酮∶甲醇(6∶3∶1)和氯仿∶甲醇(9∶1-5∶5)。就地上和土壤下部分提取物而言，将最合适的溶剂系统确定为己烷∶丙酮(分别为9.5∶0.5和9∶1)。将普通的玻璃滴定管(1.5m×2cm)用作分离柱。在将1小片原棉放在柱底部上后，将预先使用溶剂系统制备的硅胶60淤浆缓慢倾入柱并且使其沉降，直到达到1.49m的最终高度。谨慎操作以避免形成气泡。将充入了约1.5升溶剂系统的分液漏斗放在柱顶部以确保持续提供流动相并且维持高于固定相10cm的溶剂柱。在测定床体积并且使活性半纯化提取物上柱前平衡该柱。将12g干燥的液-液活性提取物溶于适当体积的己烷：丙酮溶剂并且使用移液管缓慢上柱。使其在硅胶表面上沉降并且扩散入固定相，此后使流动相在重力作用下移动。以0.5ml/分钟的流速洗脱化合物并且在两个月到两个半月期限内使用级分收集器采集12ml级分。持续监测柱以确保它们不会运行至干。收集级分，直到柱变色为止。随后用更具极性的9∶1或8∶2，7∶3，6∶4或5∶5比例的己烷∶丙酮取代己烷∶丙酮(9.5∶0.5)溶剂系统。结束分离过程前，用100％甲醇从柱上取出更多的化合物。

实施例17：定性薄层色谱法(Q-TLC)

使用10×20cm Kieselgel 60F₂₅₄，0.25mm铝板(Merck)进行定性薄层色谱(TLC)。通过用甲醛(40％)-硫酸(2∶98)或茴香醛-硫酸-乙醇(5∶5∶90)喷雾使在适当溶剂中的TLC板显色并且加热至120℃。在上述柱色谱分离过程中对每种提取物采集总计约3600支试管。对采集的每一第三支试管级分中分离的化合物进行定性薄层色谱(Q-TLC)。用于柱色谱分离的相同溶剂系统也用于TLC-分离。使板显色且随后在254和365nm处的UV-光下研究。用铅笔标记可见的荧光斑点，此后用香草醛-硫酸试剂喷雾板以便显示所有斑点。比较分开的化合物的RF-值以及不同柱级分的TLC-图谱。合并显示相似图谱和RF-值的柱级分。在40℃下的旋转蒸发器中和减压条件下蒸发合并的柱级分并且测定干燥的级分质量。

实施例18：合并的柱色谱级分的抗真菌活性的测定

为了确定大多数抗真菌化合物位于哪些柱分级中，仅使用对地上部分提取物具有相对抗性的尖孢镰胞作为测试生物体进行与如上所述相同的操作步骤。仅考虑最具活性的合并的组合色谱级分用于进一步纯化。

实施例19：制备型薄层色谱法(P-TLC)

通过制备型薄层色谱法(P-TLC)仅进一步纯化最具活性的合并的柱色谱级分中的化合物。在使用风干并且无需在先活化使用的1.0mmKieselgel 60F₂₅₄(Merck，Germany)涂敷的20×20cm玻璃板上进行分离。将约250-300mg合并的柱活性级分各自溶于小体积(3-5ml)的甲醇、氯仿或流动相，这取决于最有效的溶剂。在约20个P-TLC板中的均匀细带的基线上用溶液划线，每次涂布小体积并且在涂布之间干燥，直到每个板涂布约15mg。在这种情况中，为了分开合并柱级分中的所有化合物，使用约20-25个P-TLC板。将己烷∶丙酮(9.5∶0.5)用作溶剂系统在玻璃槽中使板显色。当流动相达到前沿时，从显色槽中取出板并且放入通风烟橱中以便干燥。随后在254和365nm处的UV-光下检验板并且用刮刀的尖端标记荧光带，此后使用刮刀刮取带并且转入相应的标记小瓶。用适当体积的氯仿覆盖化合物并且通过剧烈振摇10分钟从二氧化硅中洗脱，此后通过带有与二氧化硅带标签相对应的标签的大量坩埚抽滤。将滤液采集在相应的预称重的烧瓶中，放入通风烟橱以便干燥，测定回收的质量并且测试其抗真菌活性。

实施例20：通过制备型薄层色谱法(P-TLC)纯化的化合物的抗真菌活性的测定

为了确定通过P-TLC分离的哪些化合物为活性的，仅使用尖孢镰胞作为测试生物体进行如实施例5中所述相同的操作步骤。仅进一步纯化最具活性的化合物。

实施例21：分离的活性化合物的最终纯化

仅用原始分析型薄层色谱(TLC)系统(Mikes和Chalmers，1979，Laboratory Handbook of Chromatographic and Allied Methods.Ellis Horwood Ltd.London.)，除流动相稍做修改外，按照相同的Q-TLC(参见部分6.2.3.3)和P-TLC(参见上文)操作步骤再次测试仅最具活性的分离的化合物的纯度。将氯仿∶甲醇∶水(80∶20∶10v/v)或甲苯∶丙酮∶乙酸乙酯(7∶2∶1v/v；Wagner和Bladt，1996，Plant DrugAnalysis：A Thin Layer Chromatography Atlas，Second Edition.Springer，New York)用作溶剂系统以便将活性化合物与可能在Q-TLC或P-TLC板上共有相同位置的任意其它化合物分离。在用空气流干燥板后，在254和365nm处的UV-光下检测化合物或用5％(v/v)乙醇H₂SO₄或1％(m/v)香草醛(在100ml H₂SO₄中1g；Wagner和Bladt，1996)染色板。使不纯的化合物再次进行用1％(v/v)HCL酸化的制备型TLC，直到获得纯的化合物。仅将表现出最高抗真菌活性的纯的化合物进行核磁共振(NMR)光谱测定以便鉴定它们并且阐明其分子结构。

实施例22：NMR和质谱

为了鉴定纯化自地上和土壤下植物部分的最具生物活性的化合物并且阐明其分子结构，用丙酮反复洗涤分离的化合物以便获得可接受水平的纯度。随后对化合物进行核磁共振光谱测定(¹³C和¹H1D和2DNMR)。在Bruker ADVANCE 300MHz DRX 300光谱仪上在296K(23℃)处进行NMR-光谱测定，使用四甲基硅烷(Si(CH₃)₄；TMS)作为内标。所用的溶剂为如所示的氘氯仿(CDCl₃)或氘丙酮(deuterioactetone)[(CD₃)₂CO]。使用δ-标度以百万分之份数(ppm)报导化学位移并且以Hz给出偶合常数。使用Kratos MS-80质谱仪在双聚焦电子轰击(EI)模式中获得MS光谱和质量测定值。