一种半定量检测oxLDL的试纸

摘要

本发明提供了一种半定量检测oxLDL的试纸，该试纸可应用于动脉粥样硬化的早期诊断、病程监测以及疗效检测等领域。它由塑料底板、加样区、阻断区、标定区、反应区及吸水区组成。其中，加样区为一定孔径的微孔虑膜；阻断区为结合有精确定量的oxLDL单克隆抗体的醋酸纤维素膜；标定区为结合有色颗粒标记的oxLDL单克隆抗体1的玻璃纤维素膜；反应区由硝酸纤维素膜构成，其上分别具有检测带(T带)和质控带(C带)，检测带包埋有另一不同表位的oxLDL单克隆抗体2，质控带结合有抗鼠IgG。本发明具有操作简单、敏感特异、携带方便等特点。

说明书

一、技术领域

本发明涉及了一种半定量检测oxLDL的试纸，具体讲是一种能快速、半定量检测血清样品中oxLDL的试纸，可应用于医学临床、体质监测、家庭自检等相关领域。

二、背景技术

氧化低密度脂蛋白(oxidized-low-density lipoprotein，oxLDL)是由低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)在体内通过三种形式发生氧化修饰而形成的。天然的LDL中含有大量的不饱和脂肪酸，在氧自由基及其他多种氧化剂的作用下可生成脂类自由基，介导产生更多的过氧化脂质引起连锁的链式反应，最终形成多种活性醛。这些活性醛与LDL中的脂质蛋白apoB结合，产生新的抗原决定族，形成oxLDL。按氧化程度分为微氧化的LDL(MM-LDL)和广泛氧化的LDL(oxLDL)。其中，oxLDL与动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)关系非常密切，是As形成的重要原因，也是As病灶中特有的成份。

动脉粥样硬化(As)是一种全身性的疾病，因为全身的器官、组织都需要血液的供应来满足其新陈代谢的需要。动脉发生粥样硬化(血管的瘀积狭窄、堵塞)可以出现脑动脉硬化：慢性脑供血不足、脑梗塞；心脏血管动脉硬化：心绞痛、心肌梗死；肾脏血管动脉硬化可出现：肾功能不全、肾衰等；下肢动脉硬化可以导致腿部肌肉的供血不足而发生间歇性跛行甚至截肢。目前，动脉硬化及其并发症不论是在我国还是西方发达国家，都是导致死亡的第一大杀手。在世界范围内，动脉粥样硬化血栓形成导致的死亡人数占全部死亡的52％。据世界卫生组织报告：目前每年有1700万人死于心血管疾病，而其中80％是发生在中低收入国家。预计到2020年，因心血管疾病死亡的人数将比该数字增加50％，高达2500万，预计将有1900万发生在发展中国家。发达国家从20世纪60年代以后，由于生活方式的改变和对疾病危险因素的有效控制，其发病率和死亡率呈不断下降的趋势。而发展中国家，特别是我国近年来随着经济的快速发展、生活水平的提高，心血管疾病的发生率和死亡率却迅速增长。本病多见于老年人，大多数在40岁以上，但壮年甚至青年人亦可患病。男性较女性多，且病情重。城市居民、从事紧张脑力劳动者、肥胖、嗜烟、高血压、糖尿病及高脂血症患者易得此病

oxLDL仅存在于动脉粥样硬化病灶中，正常动脉壁中没有，患者体内的含量远高于正常人(正常值为＜0.5μg/ml)，其浓度与病变范围成比例，对As心血管病的辅助诊断价值优于总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、载脂蛋白B(APO朆)和脂蛋白(a)(LP(a))。经测定心脑血管病患者的oxLDL值明显高于对照组(所选病例也是经确认的心脑血管病患者)，这就意味着被检者的动脉粥样硬化已达一定严重程度。oxLDL含量增高与动脉粥样硬化性心血管病(ASCVD)的发生率和死亡率有密切关系，因此，oxLDL可以作为As早期诊断中一个很有价值的参考指标。临床上检测oxLDL的水平，不仅可以间接地反映病人的病变程度，而且还有利于动脉硬化性疾病的辅助诊断，另外，还是抗氧化和抗LDL修饰治疗的重要依据。

目前，oxLDL的检测方法有：核磁共振(NMR)；apoB荧光检测；硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)；相对电泳迁移率；oxLDL自身抗体含量检测；共轭双稀；ELISA法检测。其中，NMR法由于LDL中甘油酸和亚麻油酸的比率不同而使醛的浓度低于NMR分析范围，使结果的准确度降低；apoB荧光检测法虽是反映LDL氧化的可靠指标，但其检测敏感性不高；TBARS虽广泛用于脂质过氧化程度的评价，但因血清中的糖和氨基酸亦可产生TBA反应，故本方法特异性差；而相对电泳迁移率检测法、oxLDL自身抗体含量检测法、EMSA法虽应用效果较好，但这些方法的样品处理过程复杂，需要在有设备条件的实验室进行，要求有熟练掌握生化学实验操作技能的实验人员，且成本较高。

免疫层析技术作为一种快速临床诊断技术，目前已被广泛应用，其原理是以微孔滤膜(如硝酸纤维素膜)为固相载体，并利用微孔滤膜的毛细管作用，使加于膜一端的液体样品向另一端渗移，移动过程中被分析物与固定于膜上某一区域的抗体(抗原)结合而被固相化，无关物则继续渗移而被分离，然后通过标记物(胶体金、胶体硒、彩色胶乳)的显色来判定检测结果。免疫层析法的特点是使用安全、操作简便、单分检测、保质期长。市场上虽然已存在这类试纸，但多都是定性检测，不能进行定量或者半定量检测。尽管有很多基于定量或者半定量免疫层析检测试纸的专利和文献报道，如胶体金和磁性(荧光)纳米粒子双标记的定量检测试纸、色度对比半定量检测试纸、色带递增(减)半定量检测试纸、多条T带半定量检测试纸等。但都存在明显的缺陷，其中，胶体金和磁性(荧光)纳米粒子双标记的定量检测试纸需要特殊仪器，成本较高，且不能达到携带方便的目的；后几种半定量检测试纸虽不需要特殊仪器，但其上的数个浓度的单克隆抗体线需要大量的单克隆抗体，增加了成本，另外，由于使用者对有色标记物颜色的判断的差异，极易产生错误的检测结果。

本发明应用抗原抗体中和反应的原理，采用免疫层析技术，使样品液中人正常量的抗原与结合在醋酸纤维素膜上精确定量的单克隆抗体结合，而超过人正常量的抗原则先与有色颗粒标记的单克隆抗体1结合，形成Ag-Ab1-有色颗粒复合物，继续渗移，与硝酸纤维素膜上固定的单克隆抗体2结合，形成Ab2-Ag-Ab1-有色颗粒复合物，在检测带上呈肉眼可见的线条；若样品液中的oxLDL含量正常，则会被醋酸纤维素膜上精确定量的单克隆抗体完全中和，使oxLDL丧失与有色颗粒标记的单克隆抗体1及硝酸纤维素膜上固定的单克隆抗体2进一步结合的能力，检测带也不会显色。根据检测带是否显色，来判定样品液中oxLDL是否超过0.5μg/ml，从而实oxLDL的半定量检测，较以前试纸大大前进了一步，可精确判定病情，达到早期诊断的目的。

本发明基于免疫层析法的半定量检测oxLDL的试纸，可应用于临床检测、体质监测、家庭自检等相关领域。

三、发明内容

本发明提供的一种半定量检测oxLDL的试纸，其加样区由一定孔径的微孔虑膜组成，阻断区由结合有经过精确定量的oxLDL单克隆抗体1的醋酸纤维素膜组成；标定区由包被有色颗粒标记的oxLDL单克隆抗体1的玻璃纤维素膜组成；反应区由硝酸纤维素膜构成，其上分别具有检测带(T带)和质控带(C带)，检测带包埋有另一不同表位的oxLDL单克隆抗体2，质控带结合有抗鼠IgG。将加样膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在塑料底板上制成半定量检测oxLDL的试纸。

本发明一种半定量检测oxLDL的试纸除具有现有检测试纸条的优点外，还有以下特点：

(1)采用阻断中和原理，准确度高。以往的试纸具多条测试带，检测时最后一条带显色并不能确定其结合的抗原量就是标定的量，加之使用者对有色标记物颜色的判断的差异，使结果失去客观性甚至准确性。而本试纸使醋酸纤维素膜上的单克隆抗体事先与抗原反应，抗体中和掉的抗原量是一定的，只要样品中抗原量超过正常值，检测带就显色，并且消除了色差对结果的影响。大大提高检测灵敏度和准确度；

(2)成本低廉，结果读取简单，以往的试纸将不同浓度的经精确定量单克隆抗体检测条带固定在硝酸纤维素膜上，需要较多的单克隆抗体，增加了成本，而且在检测时，多条带读数计算繁琐；而本试纸只在醋酸纤维素膜上精确定量单克隆抗体，单克隆抗体使用量少，检测时只需看一条带即可；

(3)区分度大，能比较好地将正常人与患者(或准患者)鉴别开，由于精确定量的地单克隆抗体能很好地将人正常量的oxLDL中和，从而有效地将正常人从被检者中区分出来，被检正常者无需再去医院进行复杂而昂贵的检查，大大减少了使用者的经济负担；同时，本发明能够及早的发现疾病的危险因素，对准患者起到一定的预警作用，对于疾病的防治、治疗与康复具有很重要的临床意义；另外，本发明还适用于各大中小型医院和基层医疗保健机构对动脉硬化的临床快速辅助诊断，具有很大的市场前景与经济效益潜力；

四、附图说明

图1，半定量检测oxLDL试纸结构正面示意图。

1加样区；  2阻断区(结合有精确定量的oxLDL单克隆抗体1和单克隆抗体2)；3标定区(结合有有色颗粒标记的oxLDL单克隆抗体1)；4检测带(结合有oxLDL单克隆抗体2)；5反应区；6质控带(结合抗鼠IgG)；7吸水区。

五、具体实施方式

实施例(一)分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的获取

6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，购自兰州生物制品研究所试验动物中心，许可证编号2006-007；氧化低密度脂蛋白，购自北京协和三友科技开发有限公司。

分泌oxLDL单克隆抗体的杂交瘤细胞的获取过程如下：

1.小鼠的免疫

初次免疫：将抗原oxLDL与等量完全福氏佐剂混合充分搅拌使混合液呈乳化状态，抗原终浓度50μg/ml，取8～10周龄雌性BALB/c小鼠，进行腹股沟腋下四点免疫，每只0.2ml；

再次免疫：3周后抗原oxLDL浓度不变，改用福氏不完全佐剂，依步骤(1)进行免疫；

加强免疫：间隔3周后以水剂抗原100μg/ml，每只0.2ml，对小鼠进行腹腔注射；

末次免疫：在融合前三天，再加强免疫一次，同步骤(3)，免疫后经小鼠眼眶取血以间接ELISA法测定血清中抗体效价、选择效价高的小鼠用于融合。

2.细胞的融合

饲养细胞的制备：用颈椎脱臼法处死小鼠1只；将小鼠浸泡在75％乙醇内5min消毒，用10ml注射器吸取无血清的RPMI-1640基础培养液8ml；将小鼠移入超净工作台内，以仰躺于台面上，用眼科剪剪开腹部皮肤并拉开，用酒精棉球对腹膜进行消毒；将注射器内的培养液全部注入腹腔，并用棉球轻揉腹腔1～2min；收集腹腔内的细胞悬液移入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，此沉淀即为收集到的小鼠腹腔巨噬细胞；同时对腹腔内的细胞悬液进行细胞计数，总数应在4×10⁶以上；将小鼠腹腔巨噬细胞重悬于HAT培养液，调整细胞浓度在2×10⁵个/ml左右；最后将细胞悬液按每孔0.1ml的量加入到96孔培养板的各个孔中

小鼠免疫脾细胞的制备：用颈椎脱臼法处死经检测效价最高的小鼠，无菌条件下剪开小鼠腹腔，取出脾脏；将脾脏放入盛在平皿内的100目不锈钢筛网中，剔除脂肪和结缔组织；用2支注射器针头撕开脾包膜，使细胞释放进入含20ml RPMI-1640基础培养液的平皿内；吸出平皿内的脾细胞悬液到50ml的离心管中，1000rpm离心5min沉淀细胞，弃上清；用4℃的0.91％NH₄Cl溶液5ml混悬沉淀的细胞，置细胞悬液于冰浴条件下5min，破坏从脾脏中释出的红细胞；加入RPMI-1640基础培养液15ml终止NH₄Cl的作用；将脾淋巴细胞以1000rpm离心5min，弃上清，再加入10ml基础培养液重新悬浮沉淀的脾淋巴细胞，此即为待融合的脾淋巴细胞，取样进行脾淋巴细胞计数。

SP2/0骨髓瘤细胞的收集：本实验用SP2/0骨髓瘤细胞由兰州生物制品研究所提供。为了防止HGPRT缺陷的回复突变，将细胞以每20代的间隔用8-氮杂鸟嘌呤(8-AG，15～20ug/ml培养基)处理，连续培养7天，除去含HGPRT的骨髓瘤细胞。融合前，收集进入对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞6～8瓶，将SP2/0细胞悬液在室温下以1000rpm离心5min，弃上清液；用RPMI-1640基础培养液20ml将沉淀的细胞洗2次，再用5ml RPMI-1640基础培养液重新悬浮后计数细胞，备用。

融合操作：将所收集的脾淋巴细胞悬液与待融合的SP2/0骨髓瘤细胞悬液按1∶1～10∶1的比例混合，室温下以1000rpm离心5min，弃上清液；用无菌滤纸吸干离心管内的残余液体；用吸管在1min内逐滴缓慢加入37℃预温的50％的PEG2000 0.6ml，与沉淀的细胞混合均匀；立即将细胞悬液吸入毛细管内，静置30秒钟，再缓慢将细胞悬液吹入离心管，慢慢加入8～10ml RPMI-1640基础培养液，边加边轻轻搅动；将终止反应后的细胞悬液以1000rpm离心5min，弃上清液，留下细胞；最后，按每2×10⁷个脾淋巴细胞加入10ml HAT培养液的比例，加入HAT培养液重新悬浮已沉淀的融合细胞，接种于铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，放入CO₂培养箱，在37℃，5％CO₂和饱和湿度下培养。

3.融合细胞的选择性培养

将以HAT培养液重新悬浮的融合细胞按每孔0.1ml的量，加到前述的预先准备好的含饲养细胞的96孔培养板中；将接种了融合细胞的96孔培养板置37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养；融合后一周左右用新配的HAT培养液置换孔内的1/2培养液(每孔约0.1ml)，12天左右改用HT培养液。

4.杂交瘤细胞的筛选

融合3天后，逐日镜检。待培养孔中细胞集落达1/3视野以上时开始初筛。以间接ELISA法检测克隆板培养液上清，同时以稀释的正常小鼠血清(1∶500)作阴性对照。以稀释的免疫小鼠血清(1∶500)为阳性对照。首先，吸取杂交瘤培养上清2滴，加入预先包被抗原oxLDL的酶标板中，用封板膜封好，37℃温育30min，洗涤板孔3次；再加入稀释好的HRP标记羊抗小鼠IgG，50μl/孔，用封板膜封好，37℃15min，洗涤板孔3次；最后，加入底物使用液100μl，用封板膜封好，37℃温育10min。终止液终止反应。在酶标仪上测OD值。以OD值高于阴性对照2.1倍以上的为阳性孔。

5.杂交瘤细胞的克隆培养

本实验采用有限稀释法：

在已检测过的96孔培养板内将待克隆的孔做好标记；

用吸管吹打孔内的细胞使其散开，从孔内吸出0.1ml细胞悬液到1ml杂交细胞培养液中计数；

初次克隆时用HT培养液调整杂交瘤细胞密度到3～10个/ml。每块96孔培养板为10ml(第二次或第三次克隆可改用杂交细胞培养液)；

将调好预定密度的细胞悬液加到含饲养细胞的96孔培养板，每个孔加0.1ml；

将96孔培养板置37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养；

第4天用新培养液置换孔内1/2上清液；

第7天至第9天，当孔底细胞集落在1～2mm大小时，吸出杂交瘤细胞生长孔的上清液。按抗体筛选方法检测上清液中的抗体。计算杂交瘤细胞的阳性孔比率(阳性孔数/杂交细胞生长孔数×100％)；

将抗体阳性的孔内细胞移到24孔培养板扩大培养2～4天；

按步骤(1)～(7)，将扩大培养后的阳性细胞再重复克隆2～3次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％为止。孔内的细胞即为克隆化后的杂交瘤细胞；

将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养后，以1000rpm离心5min。收集上清液作单克隆抗体鉴定，冻存沉淀的细胞备用；

实施例(二)单克隆抗体的制备和纯化

oxLDL单克隆抗体的制备和纯化过程如下：

1.鼠腹水的诱导和制备

用杂交瘤细胞诱生的小鼠腹水中，抗体的浓度比培养上清液高1000倍以上。

取BALB/c小鼠2～3只，经腹腔注入无菌石蜡油，每只小鼠0.2ml；

1周后，将对数期生长的杂交瘤细胞以1000rpm离心5min，弃上清液；

细胞计数，调节细胞密度至10⁶个/ml；

将0.2ml细胞悬液注入已用无菌石蜡油处理1周的小鼠腹腔；

7～10天后，小鼠腹部增大。可以用粗针头(12号针头)扎入腹腔，挤压腹部使腹水流出；

收集腹水，以1000rpm离心5min，上清液即为含有所需单克隆抗体的腹水。每3天可收一次腹水；直至小鼠死亡。也可以直接处死小鼠作一次性收集。

从腹水中离心的细胞可以接种到用无菌石蜡油处理的其它小鼠腹腔，或冻存备用。

2.单克隆抗体的纯化

采用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体，过程如下：

将收集的腹水合并，置于4℃冰箱中沉淀脂肪等杂质，3000rpm离心10min，收集上清，测量体积；

加入等体积生理盐水，于4℃下再缓慢加入等体积33％饱和硫酸铵，边加边搅拌；

置于4℃冰箱中过夜；

第二天离心，3000rpm离心5min，弃上清，沉淀用尽量少的PBS缓冲液重悬；

在4℃下用PBS缓冲液透析，每天更换2次，透析3天通过离心取上清液分装贮存于-20℃

实施例(三)单克隆抗体表位特异性分析

参照抗体竞争法。以10μg/mloxLDL抗原包被，将各株单克隆抗体作系列稀释进行间接ELISA实验，测定各稀释度的OD值，以其浓度增高而OD值不再出现明显变化时的最高稀释度为其饱和浓度。将饱和浓度未标记的单克隆抗体先加入oxLDL抗原包被的板孔孵育，再加入另一酶标记的单克隆抗体。孵育后显色测OD值，用只加酶标单克隆抗体的板孔作对照，以各抗体对酶标记抗体的抑制率≥50％作为抑制标准，互相抑制的抗体为同位点或同位阻；反之为错位点的一对单克隆抗体。

实施例(四)半定量检测oxLDL胶体金试纸条的制备

1.金标单克隆抗体

金标oxLDL单克隆抗体1过程如下：

(1)待标记oxLDL单克隆抗体1溶液的制备

将oxLDL单克隆抗体1预先在0.005mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后3500rpm 4℃离心1h，去除聚合物，沉淀用0.01的PBS缓冲液(pH8.0)稀释至1mg/ml备用。

(2)待标胶体金溶液的准备

用0.1mol/L K₂CO₃将胶体金溶液的pH值调至8.2。由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。

(3)金标oxLDL单克隆抗体1

边搅拌，边向10ml浓度为1％的金胶溶液中逐滴加入2.5ml浓度为1mg/ml的oxLDL单克隆抗体1，10min后，加入5％的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1％，继续搅拌10min。制成的溶液即为胶体标记的oxLDL单克隆抗体1溶液，测量体积备用。

(4)金标oxLDL单克隆抗体1的纯化

将胶体标记的oxLDL单克隆抗体1溶液用蔗糖透析，浓缩至原体积的1/10。再经1500rpm离心20min。取上清加至丙烯葡聚糖凝胶S-400层析柱纯化。用0.02mol/LpH8.2 TBS(内含1％BSA，0.05％叠氮钠)洗脱，收集颜色峰值时的液体5ml，4℃保存备用。

2.半定量金标试纸条的装配

将经过精确定量的oxLDL单克隆抗体1和单克隆抗体2均匀喷涂在6×3mm的醋酸纤维素膜上；将6×3mm的玻璃纤维素膜放入含质量百分比浓度为1％BSA、质量百分比浓度为1％Tween-20的PBS缓冲液中浸泡30min，37℃干燥箱干燥，再将其浸泡于金标oxLDL单克隆抗体1溶液中，自然干燥；用1mol/L PBS将不同表位oxLDL单克隆抗体2和抗鼠IgG分别稀释至1mol/ml，2mol/ml，在20×3mm的硝酸纤维素膜上用点膜机喷成两条线，作为检测带和质控带，37℃干燥箱干燥3h，然后选择加封阻液作用1h，用缓冲液洗膜3次，自然干燥1h，用含质量百分比浓度为1％BSA的PBS缓冲液封闭2h，以0.01mol/LPBS缓冲液洗涤，自然干燥2h；将微孔虑膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在塑料底板上，即可制得oxLDL金标检测试纸。

实施例(五)半定量检测oxLDL胶体硒试纸条的制备

1.硒标单克隆抗体

硒标oxLDL单克隆抗体1过程如下：

(1)待标记oxLDL单克隆抗体1溶液的制备

将oxLDL单克隆抗体1预先在0.005mol/LpH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后3500rpm 4℃离心1h，去除聚合物，沉淀用0.01的PBS缓冲液(pH8.0)稀释至1mg/ml备用。

(2)待标胶体硒溶液的制备

先取一定量浓度为0.800‰的葡苷聚糖、浓度为1.00×10^-3mol/L H₂SeO₃溶液于10mL比色管中，混合均匀后静置片刻，加入一定量浓度为5.00×10^-3mol/L抗坏血酸(Vc)溶液，所加H₂SeO₃和Vc的物质的量的比为1∶5，加去离子水稀释至刻度，振摇混合均匀，将反应混合液置于60℃水浴中5h，即可制得直径约80nm的胶体硒溶液。

(3)硒标oxLDL单克隆抗体1

边搅拌，边向10ml硒胶溶液中逐滴加入2.5ml浓度为1mg/ml的oxLDL单克隆抗体1，10min后，加入5％的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1％，继续搅拌10min。制成的溶液即为胶体硒标记的oxLDL单克隆抗体1溶液，测量体积备用。

(4)硒标oxLDL单克隆抗体1的纯化

将胶体标记的oxLDL单克隆抗体1溶液用蔗糖透析，浓缩至原体积的1/10。再经1500rpm离心20min。取上清加至丙烯葡聚糖凝胶S-400层析柱纯化。用0.02mol/LpH8.2 TBS(内含1％BSA，0.05％叠氮钠)洗脱，收集颜色峰值时的液体5ml，4℃保存备用。

2.半定量硒标试纸条的装配

将经过精确定量的oxLDL单克隆抗体1和单克隆抗体2均匀喷涂在6×3mm的醋酸纤维素膜上；将6×3mm的玻璃纤维素膜放入含质量百分比浓度为1％BSA、质量百分比浓度为1％Tween-20的PBS缓冲液中浸泡30min，37℃干燥箱干燥，再将其浸泡于硒标oxLDL单克隆抗体1溶液中，自然干燥；用1mol/L PBS将不同表位oxLDL单克隆抗体2和抗鼠IgG分别稀释至1mol/ml，2mol/ml，在20×3mm的硝酸纤维素膜上用点膜机喷成两条线，作为检测带和质控带，37℃干燥箱干燥3h，然后选择加封阻液作用1h，用缓冲液洗膜3次，自然干燥1h，用含质量百分比浓度为1％BSA的PBS缓冲液封闭2h，以0.01mol/LPBS缓冲液洗涤，自然干燥2h；将微孔虑膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在塑料底板上，即可制得oxLDL硒标检测试纸。

实施例(五)半定量检测oxLDL彩色胶乳试纸条的制备

1.彩色胶乳标记单克隆抗体。

彩色胶乳标记oxLDL单克隆抗体1过程如下：

(1)待标记oxLDL单克隆抗体1溶液的制备

将oxLDL单克隆抗体1预先在0.005mol/LpH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后3500rpm 4℃离心1h，去除聚合物，沉淀用0.01的PBS缓冲液(pH8.0)稀释至1mg/ml备用。

(2)待标记彩色乳胶溶液的制备

调整超声波处理过的乳微球浓度为1.0×10⁶个/ml，3000rpm离心5min。用三蒸水溶解沉淀，超声波处理30sec后，加入适量50mg/ml的IEDC混匀，37℃温育20min后，3000rpm离心5min，沉淀用50mM的pH5.5的柠檬酸缓冲液溶解，置4℃备用。

(3)彩色胶乳标记oxLDL单克隆抗体1

取彩色乳胶溶液10ml，超声波处理30sec，边搅拌边向其中滴加3.0ml浓度为1mg/ml的oxLDL单克隆抗体1，继续室温搅拌2h，3次离心(3000rpm，5min)洗涤，沉淀用PBS TBN溶解，超声处理30sec，用PB恢复至10ml，室温放置备用。

2.半定量彩色乳胶标记试纸条的装配

将经过精确定量的oxLDL单克隆抗体1和单克隆抗体2均匀喷涂在6×3mm的醋酸纤维素膜上；将6×3mm的玻璃纤维素膜放入含质量百分比浓度为1％BSA、质量百分比浓度为1％Tween-20的PBS缓冲液中浸泡30min，37℃干燥箱干燥，再将其浸泡于彩色乳胶标记的oxLDL单克隆抗体1溶液中，自然干燥；用1mol/L PBS将不同表位oxLDL单克隆抗体2和抗鼠IgG分别稀释至1mol/ml，2mol/ml，在20×3mm的硝酸纤维素膜上用点膜机喷成两条线，作为检测带和质控带，37℃干燥箱干燥3h，然后选择加封阻液作用1h，用缓冲液洗膜3次，自然干燥1h，用含质量百分比浓度为1％BSA的PBS缓冲液封闭2h，以0.01mol/LPBS缓冲液洗涤，自然干燥2h；将微孔虑膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在塑料底板上，即可制得oxLDL彩色乳胶标记的检测试纸。