对痢疾志贺氏菌4型的O－抗原特异的核苷酸

摘要

本发明提供一种对痢疾志贺氏菌4型(S.dysenteriae type 4)的O－抗原特异的核苷酸，它是痢疾志贺氏菌型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长14657个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于痢疾志贺氏菌4型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对痢疾志贺氏菌4型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定痢疾志贺氏菌4型的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及痢疾志贺氏菌4型(Shigella dysenteriae 4)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及痢疾志贺氏菌4型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的痢疾志贺氏菌4型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of theEnterobacteriaceae”.Elsevier Science Publishers，Amsterdam，TheNetherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between theenteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸。它是痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定痢疾志贺氏菌4型的O-抗原及检测和鉴定痢疾志贺氏菌4型。

本发明的还一目的是提供了分离痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长14657个碱基；或者所述具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO：1的核苷酸。

前述的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为wzx，orf2，orf3，orf4，wzy，orf6，gmd，fcl，gmm manC，orf11，manB的12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述基因中具有高度特异性的基因是：转运酶基因，其包括wzx基因；聚合酶基因，其包括wzy基因；糖基转移酶基因，其包括orf3、orf4、orf6、orf11基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的1081至2352碱基的核苷酸；wzy是SEQ IDNO：1中的4689至5921碱基的核苷酸。

前述的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸，其中还包括源于所述的wzx基因、wzy基因以及它们的混合或它们的重组。

前述的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其中源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的1242至1260碱基的核苷酸和2281至2299碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1196至1214碱基的核苷酸和1682至1700碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ IDNO：1中的5635至5653碱基的核苷酸和5879至5897碱基的核苷酸；SEQ IDNO：1中的5202至5220碱基的核苷酸和5902至5920碱基的核苷酸。

前述的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。

前述的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达痢疾志贺氏菌4型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。

前述的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养痢疾志贺氏菌4型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增痢疾志贺氏菌4型中的O-抗原基因簇：以痢疾志贺氏菌4型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：痢疾志贺氏菌4型，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对痢疾志贺氏菌4型的灵敏度。

前述的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养痢疾志贺氏菌4型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增痢疾志贺氏菌4型中的O-抗原基因簇：以痢疾志贺氏菌4型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCRPreps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对痢疾志贺氏菌4型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到痢疾志贺氏菌4型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对痢痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含痢疾志贺氏菌4型组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl痢痢疾志贺氏菌4型的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的1242至1260碱基的核苷酸和2281至2299碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1196至1214碱基的核苷酸和1682至1700碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5635至5653碱基的核苷酸和5879至5897碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5202至5220碱基的核苷酸和5902至5920碱基的核苷酸。，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在3对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在3对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这3对引物对猪肉馅中的痢痢疾志贺氏菌4型的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长14657个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它包括命名为wzx，orf2，orf3，orf4，wzy，orf6，gmd，fcl，gmm manC，orf11，manB的12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因(orf8、orf11、orf12基因)。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy、基因对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增痢疾志贺氏菌4型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的1081至2352碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4689至5921碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌4型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是痢疾志贺氏菌4型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由痢疾志贺氏菌4型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是痢疾志贺氏菌4型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是痢疾志贺氏菌4型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达痢疾志贺氏菌4型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养痢疾志贺氏菌4型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增痢疾志贺氏菌4型中的O-抗原基因簇：

以痢疾志贺氏菌4型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGATTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟，再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对痢疾志贺氏菌4型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到痢疾志贺氏菌4型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，orf2编码的蛋白与Lactobacillus plantarum O-抗原基因簇中编码的乙酰基转移酶有很高的氨基酸序列一致性(41％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf2编码的蛋白与已知的Bacterialtransferase hexapeptide的共有序列的同源性预期值很高。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf2。Orf7编码的蛋白分别与Yersinia pseudotuberculosis的O-抗原基因簇中编码的GDP-mannose-4，6-dehydratase有较高的氨基酸序列一致性(87％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf7编码的蛋白与已知的NAD dependentepimerase/dehydratase family的共有序列的同源性预期值很高。因此我们将这个基因命名为gmd。Orf8编码的蛋白与Yersinia pseudotuberculosis O-抗原基因簇中编码的GDP-L-fucose synthetase有很高的氨基酸序列一致性(77％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf8编码的蛋白与已知的GDP-L-fucose synthetase的共有序列的同源性预期值很高，因此我们将这个基因命名为fcl。Orf9编码的蛋白与Salmonella typhimurium O-抗原基因簇中编码的GDP-mannose mannosyl hydrolase有很高的氨基酸序列一致性(52％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf9编码的蛋白与已知的NUDIX domain的共有序列的同源性预期值很高。因此我们将这个基因命名为gmm。Orf10编码的蛋白Escherichia coli O-抗原基因簇中编码的GDP-mannose pyrophosphorylase有很高的氨基酸序列一致性(87％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf10编码的蛋白与已知的Nucleotidyltransferase的共有序列的同源性预期值很高，因此我们将这个基因命名为manC。orf12编码的蛋白分别与Shigella boydii的O-抗原基因簇中编码的phosphomannomutase有较高的氨基酸序列一致性(94％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf12编码的蛋白与已知的Phosphoglucomutase/phosphomannomutase的共有序列的同源性预期值很高。因此我们将这个基因命名为manB。

Orf1和orf5是痢疾志贺氏菌4型种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf1编码的蛋白与Bacteroides thetaiotaomicron的O-抗原转移酶有21％的序列一致性，44％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有10个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf1为wzx。Orf5编码的蛋白与Bacillus cereus的O-抗原聚合酶有22％的一致性，48％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有10个跨膜片段，并且有一个大的胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf5为wzy。

orf3，orf4，orf6，orf11预测的为糖基转移酶基因。orf3编码的蛋白与Leptospira interrogans O-抗原基因簇中编码的Glycosyl transferase有很高的氨基酸序列一致性(38％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf3编码的蛋白与已知的Glycosyl transferase的共有序列的同源性预期值很高。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf3。orf4编码的蛋白Thermoanaerobacter O-抗原基因簇中编码的Glycosyl transferases有很高的氨基酸序列一致性(43％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf4编码的蛋白与已知的Glycosyltransferases group 1的共有序列的同源性预期值很高。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf4。orf6编码的蛋白分别与Agrobacterium tumefaciens O-抗原基因簇中编码的Glycosyltransferases有很高的氨基酸序列一致性(55-56％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf6编码的蛋白与已知的Glycosyl transferasesgroup 1的共有序列的同源性预期值很高。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf6。Orf11编码的蛋白分别与Yersiniapestis O-抗原基因簇中编码的Glycosyl transferases有很高的氨基酸序列一致性(66％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf11编码的蛋白与已知的Glycosyl transferases group 1的共有序列的同源性预期值很高。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf11。

实施例6：特异基因的筛选。

针对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含痢疾志贺氏菌4型组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原都是高度特异的；这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl痢疾志贺氏菌4型的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对SEQ ID NO：1中的1242至1260碱基的核苷酸和2281至2299碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1196至1214碱基的核苷酸和1682至1700碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5635至5653碱基的核苷酸和5879至5897碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5202至5220碱基的核苷酸和5902至5920碱基的核苷酸。进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在3对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在3对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这3对引物对猪肉馅中的痢疾志贺氏菌4型的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology 1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明D4的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ IDNO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表1列出了痢疾志贺氏菌4型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了痢疾志贺氏菌4型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共12组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有痢疾志贺氏菌4型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx，wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第12组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx，wzy基因对痢疾志贺氏菌4型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从痢疾志贺氏菌4型中筛选到对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原高度特异的基因；wzx，wzy。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌4型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对痢疾志贺氏菌4型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的痢疾志贺氏菌4型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇的结构，共由12个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了痢疾志贺氏菌4型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

                  SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)

<110>  南开大学

<120>  对痢疾志贺氏菌4型的O抗原特异的核苷酸

<130>  对痢疾志贺氏菌4型的O抗原特异的核苷酸

<160>  1

<170>  PatentIn version 3.2

<210>  1

<211>  14657

<212>  DNA

<213>  Shigella dysenteriae

<400>  1

attgtggctg cagggatcac agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc      60

gaaaaccact tcgacacctc atatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt     120

caactgcttg cggaagtgca gtccatctgt ccaccgggcg tgacaattat gaacgtgcgt     180

cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttgtgtg cacgacccgc cattggtgac     240

aacccatttg tcgtggtgct gccagacgtt gtgatcgacg atgccagcgc cgacccgctg     300

cgctacaacc ttgcagccat gattgcgcgc ttcaacgaaa cgggccgtag ccaggtgctg     360

gcaaaacgta tgccgggcga tctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccactg     420

gatcgtgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag     480

acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgcaga tatttggccg     540

gaacttgaac gcactcagcc aggtgcatgg ggacgtattc agctgactga tggcattgcc     600

gaactggcga aaaaacagtc tgttgatgcc atgctgatga caggtgacag ctatgactgc     660

ggtaaaaaaa tgggttatat gcaggcattt gtgaagtatg gactacgcaa cctgaaagaa     720

ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg     780

atgtaacggt tgataaggaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaatttgt     840

tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag     900

gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt     960

agcgtttgaa tttatgaggg ctttgcgggg ttagatgcag agttcgtgac atccattgag    1020

aatctacgca gtgcactggt agctgttaag ccaggggcgg tagcgtgtgc aaataagaat    1080

atgttccgac aaataaattt caaaaatcta gaaataatga aacagattct aatttcattt    1140

tcttttagat taatgggtcc tgttatcatg cttctgacca cgccacaatt gttgtcgact    1200

ttgggaaatg tggaatatgg agtttggtct ttattgatta caacgattag ttggttgaca    1260

atatgcgact ttggcatatc aaatcagata cgaaatgaaa gtaagatttt aattgttcaa    1320

gataataaag aaagtatacg agagatatat acagcggcag ttataatttc attctttata    1380

acattattat gttgtgtgat tataagtttt attaatatcg acttgatata taaattgttt    1440

ttatcttgtg tttttttatt tgctatagaa acaaatattt gtagagccct atgcctttca    1500

ttgaataaac ctgaattggc ctctgcagta actaatattc cgaatttatt tttattgata    1560

tatgtgtttt gttattcgtc atttaacata aacaatgtga tggatatata ttgttatggc    1620

tctgccatga tgttcgtatc aatttttatt attttatata aatttaatat taagttgttt    1680

tggccagttt tccacccttc ttacttaaga ttttctatca tgaaatactc tctacttaga    1740

ggtggtggtg gtttctttat ggttcaattg gtttcgatgg ggttattaat aagtgataga    1800

tatataatat catctatatt tggtgttgaa gatgtcacaa aatatgattt gatatttaag    1860

gtgtcaaatt tttgcataat gtttttttca attgtaaata tggttctttg gtcgaaattt    1920

acagaatttt ggatgcaagg gttttataca aaaatcaagg ttatctttaa agtgtttgac    1980

ttatgttttt tattgttagt tatcgtccta attttgattt taaaccatat acactggatt    2040

tttgaattat ggctaaatgt aactaatgaa aattacaatg aagtttatat tacagggatt    2100

gtcctttatt tggttgggta ttattggatg tcagcttatt cctctttttt aaatggtata    2160

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ttattaattg ctatgaatat cttgaaagta tttaaggttg aatatattat tttgctgggt    2280

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cttttctatg aaaaacataa ttcagaaaga aataacctta tataatgaaa taatgaaaca    4680

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taattttatt tgtgttgata acgctaagtg ttaatctgtt aattagccaa tcaattaaaa    4860

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tgaaatatta tgatgttcaa aaagtaaaaa atataattaa tttttttatt ttttttagcg    4980

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taatcatttg tttaatagta gcgctatatg taggtaataa aatctcatta agtaaaatct    5400

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tcgcattgct tggtattaga gctggtagtg ttaattatat aatcatttgg ttctattttt    5880

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tgaaaataat gttgctgaat gtttgggaat aaacccgatt atattaaatc aggttggccc    6120

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tataattcat acgaacaact tgtggaatta tttttcttat ttgccctata atttatcaaa    6240

aaacagtaaa aagccgaatg ttatttccgt cagaggcagt ttatatgctt ggtctcttga    6300

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ttatctacgc ttatatgtgt gcgtaggttt gattacacgt agatgccggt atacagaatt    13260

gaagaacggt atttgttgca ttaatgaaat tcagcactac acacattcgt gcaacttgag    13320

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gaaaaagttc gtcgtgcgct gtatctgggc aaaatcgttt cttacgctca gggcttctct    14400

caactgcgtg ctgcgtctga agagtacaac tgggatctga actacggcga aatcgcgaag    14460

attttccgtg ctggctgcat catccgtgcg cagttcctgc agaaaatcac cgatgcctat    14520

gccgaaaatc cgcagatcgc taacctgctg ctggctccgt acttcaagca aattgccgat    14580

gactaccagc aggcgctgcg cgatgtcgtc gcttatgcgg tacagaacgg tatacccggt    14640

tccgaccttt gctgctg                                           14657

表1痢疾志贺氏菌4型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

    基因    功能  基因的碱基  位置    正向引物    反向引物    PCR产物    的长度  产生正确  大小电泳  带的组数   PCR的退   火温度   (℃)    wzx    转运酶  1081-2352    1242-1260    2281-2299    1058bp  0^a   50    1196-1214    1682-1700    505bp  0^*   56    wzy    聚合酶  8137-9468    5635-5653    5879-5897    263bp  0^b   56    5202-5220    5902-5920    719bp  0^*   60

表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号                     该组中含有的菌株                                                           来源

1、野生型大肠杆菌        O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20，                 IMVS^a

                         O21，O22，O23，O24，O59，O3，O11

2、野生型大肠杆菌        O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O31，O33，O35，O36，O37，               IMVS^a

                         O38，O40，O41，O42，O43，O39，O59

3、野生型大肠杆菌        O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，                    IMVS^a

                         O57，O58，O60，O61，O62，O64，O73

4、野生型大肠杆菌        O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，                    IMVS^a

                         O79，O80，O81，O82，O83，O96，O95

5、野生型大肠杆菌        O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101，                   IMVS^a

                         O102，O103，O104，O105，O106，O100，O151

6、野生型大肠杆菌        O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，                       IMVS^a

                         O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128

7、野生型大肠杆菌        O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，                     IMVS^a

                         O138，O139，O140，O141，O142，O143，O144，O145

8、野生型大肠杆菌        O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，                     IMVS^a

                         O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166                                   b

9、野生型大肠杆菌        O168，O169，O170，O171，O172，O173，O155，O124                             c

                         D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12                          d

10、野生型大肠杆菌       B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，             d

                         B16，B17，B18

11、野生型大肠杆菌       F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，F_X变，F_Y变，DS，DR，d

12、第9组菌株加上大肠杆菌标准菌株O114                                                                IMVS

^*为了检测的方便，我们将每13-19个菌分为一组，总共12组

a.Institute of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3痢疾志贺氏菌4型O抗原基因结构图

            

#orf     galF          wzx   orf2  orf3  orf4    wzy    orf6       gmd   fcl  gmm   manC    orf11   manB        gnd

G+C％    39.5    28.2  33.7  29.6  30.0    27.6   31.0  42.3  39.5  37.7  41.2  32.7    38.5    50.8

content

表4痢疾志贺氏菌4型O抗原基因簇基因位置

ATTGTGGCTG CAGGGATCAC AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC       60

GAAAACCACT TCGACACCTC ATATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT      120

CAACTGCTTG CGGAAGTGCA GTCCATCTGT CCACCGGGCG TGACAATTAT GAACGTGCGT      180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC     240

AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ATGCCAGCGC CGACCCGCTG     300

CGCTACAACC TTGCAGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGCCGTAG CCAGGTGCTG     360

GCAAAACGTA TGCCGGGCGA TCTCTCTGAA TACTCCGTCA TTCAGACCAA AGAACCACTG     420

GATCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG     480

ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCAGA TATTTGGCCG     540

GAACTTGAAC GCACTCAGCC AGGTGCATGG GGACGTATTC AGCTGACTGA TGGCATTGCC     600

GAACTGGCGA AAAAACAGTC TGTTGATGCC ATGCTGATGA CAGGTGACAG CTATGACTGC     660

GGTAAAAAAA TGGGTTATAT GCAGGCATTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTGAAAGAA     720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG     780

ATGTAACGGT TGATAAGGAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT     840

TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG     900

GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT     960

AGCGTTTGAA TTTATGAGGG CTTTGCGGGG TTAGATGCAG AGTTCGTGAC ATCCATTGAG    1020

AATCTACGCA GTGCACTGGT AGCTGTTAAG CCAGGGGCGG TAGCGTGTGC AAATAAGAAT    1080

Orf1起始

ATGTTCCGAC AAATAAATTT CAAAAATCTA GAAATAATGA AACAGATTCT AATTTCATTT   1140

TCTTTTAGAT TAATGGGTCC TGTTATCATG CTTCTGACCA CGCCACAATT GTTGTCGACT    1200

TTGGGAAATG TGGAATATGG AGTTTGGTCT TTATTGATTA CAACGATTAG TTGGTTGACA    1260

ATATGCGACT TTGGCATATC AAATCAGATA CGAAATGAAA GTAAGATTTT AATTGTTCAA    1320

GATAATAAAG AAAGTATACG AGAGATATAT ACAGCGGCAG TTATAATTTC ATTCTTTATA    1380

ACATTATTAT GTTGTGTGAT TATAAGTTTT ATTAATATCG ACTTGATATA TAAATTGTTT    1440

TTATCTTGTG TTTTTTTATT TGCTATAGAA ACAAATATTT GTAGAGCCCT ATGCCTTTCA    1500

TTGAATAAAC CTGAATTGGC CTCTGCAGTA ACTAATATTC CGAATTTATT TTTATTGATA    1560

TATGTGTTTT GTTATTCGTC ATTTAACATA AACAATGTGA TGGATATATA TTGTTATGGC    1620

TCTGCCATGA TGTTCGTATC AATTTTTATT ATTTTATATA AATTTAATAT TAAGTTGTTT    1680

TGGCCAGTTT TCCACCCTTC TTACTTAAGA TTTTCTATCA TGAAATACTC TCTACTTAGA    1740

GGTGGTGGTG GTTTCTTTAT GGTTCAATTG GTTTCGATGG GGTTATTAAT AAGTGATAGA    1800

TATATAATAT CATCTATATT TGGTGTTGAA GATGTCACAA AATATGATTT GATATTTAAG    1860

GTGTCAAATT TTTGCATAAT GTTTTTTTCA ATTGTAAATA TGGTTCTTTG GTCGAAATTT    1920

ACAGAATTTT GGATGCAAGG GTTTTATACA AAAATCAAGG TTATCTTTAA AGTGTTTGAC    1980

TTATGTTTTT TATTGTTAGT TATCGTCCTA ATTTTGATTT TAAACCATAT ACACTGGATT    2040

TTTGAATTAT GGCTAAATGT AACTAATGAA AATTACAATG AAGTTTATAT TACAGGGATT    2100

GTCCTTTATT TGGTTGGGTA TTATTGGATG TCAGCTTATT CCTCTTTTTT AAATGGTATA    2160

AGCATCATAA AAAAACAATT TATTATCCAG GGTGGAGGGC TTTTGATCAA AGCTATTACT    2220

TTATTAATTG CTATGAATAT CTTGAAAGTA TTTAAGGTTG AATATATTAT TTTGCTGGGT    2280

                                               orf2起始

GGTGCGTGTC TATTTATTGT TGGTTTTTTA TTCAGGAAGT GTGCGCATGA TAAAATCAAT  2340

    Orf1终止

AGTTGTATAT AGCTTTCGGA TTTATTATTT CATCAATAGA TGGATTACAA CAAAAATAAA  2400

TAAATTGAGG TTGAAAGCTA ACTCTGTCGA ATTAGGTGAC AGCGTAATGA TTAATGGAAT    2460

ATTGCATATA GTTAACAAGG GGGAAATTAA AATTGGTAAC GGTGTCAAGA TTAATTCTTC    2520

ATTACGTTAC AATCCAATTT CACATCATCC ATGTTCATTT TACACTTCTG AAAATGCGGT    2580

GATTGAGATT GGGGATAAAT CCGGGTTGTC GGGTTGTACC TTATATTCTG TTAAAAAAAT    2640

CCATATTGGA AAAAGAGTGT TGATTGGTGC AGGCGTAAAT ATTTATGATA CAGATTTTCA    2700

TTCTTTACTC GTGGATGAGA GATTAAATGG TGATAGTAAC ATTAAATCCT CTCCAGTTTA    2760

TATATACGAT GATTGTTTTA TTGGAGCTAA TGTTACAATT TTGAAAGGTG TTACAATAGG     2820

                                                    Orf3起始

GGCTGGCAGT GTTGTTGCTG CTTGCTCGGT AGTAACGAAG AATATAGGGG AAAATGAACT   2880

                                                 Orf2终止

ATGGGCAGGC AATCCAGCTA GGTATATTAG AGATACTATA TATGGCGAAT GATAAAATTA   2940

CCGTTATAAC TATAAATTAC AATAATGCAG AAGGCTTATC AAAAACGATT GCTTCAGTTG     3000

AAAAGCAAAC TAATAAAGAA TTTGAGTATC TAATTATTGA TGGTGGTTCT GAGGATAATT     3060

CAATAGAACA TGCTAAGAAA AGTGTAATAT GCACAAAAAT AATATCTGAA AAAGATAATG     3120

GAATCTATGA TGCAATGAAT AAAGGAGCCT CACTTGCTAA AGGTGAGTAT ATCATTTTTA     3180

CAAACTCTGG TGATGAATTA AGAAAAAATA GCATTGAAAT TTTGATGAAT GTATTGAGAG     3240

AGACAAATAC ATTATACGAT ATATACCACG GGATTTTGGC TTTCAAAAAA AATGATAAAG     3300

TTATTTATTA TAGAGGTCGG AAAAGTGACA TGTTGAACAG TTCAATGATT GAACATCCTA     3360

CTGTGTTAAT GCGTAAAAGC ACATTTAATG AATTAAAAGG ATTTGATAAT AAGTGGCGAT     3420

ATGTAGCTGA TTATGATTTA ATGTTACGGG CATATTTTAC AAAAAGAAGA TTTTTTTTTA     3480

TTGAGGAGGT GATTGCTGAT TTTGATGTAT CAGGTGTATC TAGTGTGAGT ATTAAAGCTC     3540

CTTTGGAGTC TTTACGGTTA CAACGGAAAT ATAATTTAAT TAATACATTT GAATATTTTA     3600

                                    Orf4起始       Orf3终止

GCAAGTTATT TTTTATCAAG ATGAAAAAGG CTGTATCATG CTTAAGGTAA TCCTTCTTTC 3660

ATCAATCAAC CCAGAACAAA AAACAGGCTA CTATAATGCT GTCAATGACC GTGTAAAATC     3720

TCTAAAAAAA GAGAAAGGAA TAAAAATTTG GTCATATTCG ATATATAAAA GCACGTCATT     3780

GATAAGATTC TCAATAAAAA AAAATGAAAA TCATTTTTTT ATAGAATATC CCAAAGCATT     3840

TCCTTCGCAT GGTTTATTTT CATTCATAAC TCTCTGGTTT ATAAGATGTG TTATTTTATT     3900

TCTGTGGGTT ATAATAAGAC CTAACATGAT ACATGTGACT TTCCATGGCT CTGAAGTCCA     3960

TACCCAGCCT GCCAGATCGA AAGAAATTTT CGTAAAAACT TGTAATTTAT GTAAAAGAGT     4020

TGATCATGTT ACGGCTGTGA GTGAGAACTT ATTATTGCAA GTAAGAAATA AGTTTTCAGT     4080

GTCAGAATCG AAATCATCTA TAACATATAA TGGAGTTAAC CTAGATGAAA CTAATTGTTC     4140

TTTTTCATCA AGTAATGGAT TGACGTTTTC GTTTTTTGGG AATCTAAATA TGACTAAAGG     4200

TGCTGATAGG ATAATTCCAC TTTATAATGC ACTTTCAGGG TTAATTGAAG AGAACTTTAC     4260

ATTTTATGTT GGCGGGGAAG GACCTTGTTA TAAGGAAATA AAGCAATATA TTATCGTAAA     4320

TGGAATCTCT AATATTAAAT TGCTCGGTTT TATGCCTCGT GCTGATGTAA AACGAATAAT     4380

GCGCAAAAGT AATTGTGTCT TTATATTAAG TCGTAATGAA GGGTTGGGTA TTAGTGCAAT     4440

TGAAGCATTA GCTTATAGTC AATTATGTAT AGCACCTGAT ATAGGTGGAT TATCTGAAGT     4500

TTTTAGAGAG AATCCAGAGT TATTAATTAA AAATGATTTT AATCCATCAG ACTATGCTAA     4560

TAAGTTTATT AGTTGTCACA AAGATAAATT CAGAGTTAAT CGTACATATA TATTTAAAAA     4620

CTTTTCTATG AAAAACATAA TTCAGAAAGA AATAACCTTA TATAATGAAA TAATGAAACA     4680

       Orf5起始  Orf4终止

GGCACAAAAT GAATTGTAAA TTTAACATTT GGGATATTCA GTTAGGTTTG ATATTAATAT 4740

CAGTACTATC TTATGCTTTT TTAAACTTGG GTTTTTTACC ATTAAATATT TCCCATCTAA     4800

TAATTTTATT TGTGTTGATA ACGCTAAGTG TTAATCTGTT AATTAGCCAA TCAATTAAAA     4860

TAACTGGATT ATTTTTAACT CTTTTTGTGT CCTTTATTTT ACTTTCTGCT TATTCATTAT     4920

TGAAATATTA TGATGTTCAA AAAGTAAAAA ATATAATTAA TTTTTTTATT TTTTTTAGCG     4980

TTGCTGCTAT AGTGATAAAT AACTGCAGTG CTGATAAAAT AATAAAATTT TATTACAAAT     5040

TAACTAAAAT TTTTATATTT TTTGCTTTAC TTCAGTGGGT TCTTTATTAT CTCAACATTG     5100

GAACACTATA TACATATTCT TTTCTTGGTT TAAAGGAAGT TAATATTTCA ACAAGTGGAT     5160

ATTTAATTCG GCTATTCTCT ATAGCTAGTG AGCCTGCTGC ATTATGTGGG ATATTGCTTC     5220

CAGCTATATA TCTATCTATA AATAGAATAG TTAATAAGGG TAAAGAAGTT ACTTTATCAT     5280

ATTCAGTAAT TGTTTTATTT GTTATTTTAA ATACATTTTC GTTGGTTGGC TATATATATA    5340

TAATCATTTG TTTAATAGTA GCGCTATATG TAGGTAATAA AATCTCATTA AGTAAAATCT    5400

TTATTTTCAC AATTTGTTTG GCATTGCTTG TCTTTATTCT TTTTCAATCG GATAGTATCC    5460

AGCAGCGTTT AAATGAAATA ACTAGTCTAG ATAAAATGGC TAGCTCAGAC AATCTTTCTG    5520

TTATAGCAAT TTATTCAAAT TTGCAAATAG CTTTGATAAG TCTCAGTGAT AATCTTATAT    5580

TTGGGGGAGG AATATTTAGT CATCCTTATA CATACGATCA TTATATCAGT CAATTGTATG    5640

CTGGTGGAGG ACCACGCATG GAATTAAATA AGGATGATGC AGCTTCTCTT TACATACGTG    5700

CATTATCAGA AACGGGAATT TTAGGTTTTT GTATTTTGAA TGGGTTGATT ATATATCTGA    5760

TGAAACGCTG CGATAAATCT AAAATCAACT ATCCATATAA CATCGCTTTT ACAATTGCAT    5820

TCGCATTGCT TGGTATTAGA GCTGGTAGTG TTAATTATAT AATCATTTGG TTCTATTTTT    5880

                                     Orf6起始  Orf5终止

TTTCCGCTAT ACGGTTCGTA AATGAAGGAA GGTTAAAATG AAAATGTTAT CGTTTTTGGA  5940

ATGTATGAAT AGCACTTATG GAGGGCCAGC ATTTTCACTT CCTTCTTTAC TTCATCATTT    6000

AGAAAAAAAC TATCTTGTTC AAAGTACAGT TATTTCGCTT AAAAAGAAGA ATGAAGTTTA    6060

TGAAAATAAT GTTGCTGAAT GTTTGGGAAT AAACCCGATT ATATTAAATC AGGTTGGCCC    6120

AAGAAAGTTA AAATTAACAC ACGAGATAGC AAAAGTAAAA AAAATAATGC AAGATTGTGA    6180

TATAATTCAT ACGAACAACT TGTGGAATTA TTTTTCTTAT TTGCCCTATA ATTTATCAAA    6240

AAACAGTAAA AAGCCGAATG TTATTTCCGT CAGAGGCAGT TTATATGCTT GGTCTCTTGA    6300

ACAGTCGAGA CTGTTAAAAA AAATCTCATG GTTTCTTTTT CAAAAGAAAG CATTGGATTC    6360

AGCCGGTTTT ATACATGTTA CTTGTAACGA TGAATTAACA GCTTTACGAG AATTAGGTAT    6420

TAAAAATAAA ATAGTTGTTT CACAACATGG TGTGGATGTA CCTGATTTGA TAGATAAAGT    6480

TCCAGATAGT TTTTATGATA AATATAAATT ATCGCATAAT AAAAAATATT TTCTATTTAT    6540

GTCTCGACTA CATACGAAAA AAGGGCTAGA TATGTTGTTT AATGTATGGT CGAGGATCTC    6600

TCACCATTAT CCTGATTGGG AATTACTTGT TGCTGGTCCT GATTATGGAA ACTATATACC    6660

AAAAATAACT AAGTTAAATG CAGTAAAATA TATGGGAATG CTAAGTGGGG AAGAGAAAGA    6720

ATACTGTTTT TCTATAGCTC AATTTTTTGT TCTACCTTCA TACACTGAAA ATTTTGGCGT    6780

TGTAATTGGT GAGGCTATGG CAAGAACCGT ACCTGTTTTA ACTTCTACTA ATACACCATG    6840

GAAAGATGTT AATACCAATA ATGCAGGTGT ATGTTTCGAT TTATCAACTG AAAATTTAAA    6900

AAGAGAATTG GAGTTTTTTT TCAATTTATC TGATTCAACT AGAAAAGAAA TGGGAAGGAA    6960

TGCGAGAGAA TTGATAGTTA GAAACTATTC ATGGGAACGA GTTAGTTATC CTTTTTACGA    7020

              Orf6终止              Orf7起始

TGCACTTAAA TCACTTTGAG GTTTAATAGA ATGAAAAAAG CATTAATCAC AGGCATCACC7080

GGTCAAGATG GATCTTACTT AGCAGAATTC CTTCTTGATA AAGGGTATGA AGTGCATGGC    7140

ATTAAACGTC GAGCATCTTC ATTTAATACG GAGCGTGTTG ATCATATTTA TCAAGATCGC    7200

CACAATCAAA ATCCAAATTT CTTTCTTCAT TACGGTGATT TGACAGATAC TTCGAACTTG    7260

ATACGTCTCA TTAAAGAGAT CCAACCAGAC GAAGTTTATA ACCTTGGCGC TCAATCTCAT    7320

GTAGCGGTTT CATTCGAATC ACCTGAATAT ACTGCTGACG TAGATGCAAT GGGGACTTTA    7380

CGTCTGCTGG AAGCGATTCG TATTTGTGGG TTAGAGAAAA AAACACGCTT CTATCAGGCA    7440

TCTACTTCTG AACTCTTCGG CTTAGTTCAG GAAATCCCGC AGCGAGAAAC AACACCATTC    7500

TACCCTCGTT CGCCTTATGC TGTTGCTAAG ATGTATGCAT ACTGGATTAC TGTAAACTAT    7560

CGTGAATCCT ATGGAATGTA CGCCTGTAAT GGTATTCTCT TCAACCATGA ATCCCCGCGT    7620

CGTGGTGAAA CATTCGTAAC ACGTAAAATC ACGCGTGCTA TTGCAAATAT TTCGCAGGGA    7680

ATCGAAAAAT GTCTCTATCT TGGCAATATG GATTCACTGC GCGACTGGGG ACATGCGAAA    7740

GATTACGTGC GTATGCAGTG GATGATGTTG CAGCAAGATC ACCCAGAGGA TTTTGTTATT    7800

GCAACAGGCA AACAAATTTC CGTACGTGAA TTTGTTCGTA TGTCAGCTAA AGAAGTCGGT    7860

CTGGAGTTAG AATTCTCCGG ACAAGGTGTT GATGAAATAG CAACTGTTGT GAATAAAACA    7920

TCTGACTGTG CTATTGGTGT TAGTATTGGG GATGTGATCG TTCGTGTTGA TCCTCGTTAT     7980

TTCCGTCCTG CAGAAGTTGA AACTCTTCTT GGTGATCCAG CAAAAGCGAA AAAAGTATTG     8040

GGTTGGGAAC CAGAGATTAC AGTTGAAGAG ATGTGTGCAG AAATGGTTGC CAGTGATCTG     8100

GCGAAAGCAA AACAGCATGC ACTACTGAAA AGCCATGGTT ACGATGTTGC AGTTTCTCTG     8160

    Orf7终止     Orf8起始

GAGCGGTAAG GTATGACAAA AAAACGTATC TACGTTGCTG GTCACCGAGG TATGGTTGGC 8220

TCTGCTATTT GCCGTCAATT ATCACTGCGT GATGATATCG AATTAGTGGT CAAAACACAC     8280

AAAGAACTCG ATCTAACCGT ACAGAAGGAA GTTGATGCAT TTTTTGAGCA AGAGAAAATT     8340

GATCAGATTT ATCTTGCTGC GGCTAAAGTC GGTGGCATTT ATGCCAACAA TACATTTCCG     8400

GCAGAATTCA TCTATCAGAA TCTCATGATT GAGAGTAATA TTATTCATTC AGCTCACAAG     8460

GCCGGAATTC AAAAATTACT TTTTTTAGGC TCAAGCTGTA TTTATCCTAA ATTCGCAGAG     8520

CAGCCGATGA ACGAGTCTGC GCTTTTAACG GGCATACTTG AGCCAACTAA TGAGCCATAC     8580

GCAATTGCTA AAATTGCGGG CATAAAATTA TGTGAATCTT ATAACCGTCA ATATGGCCGT     8640

GATTATCGCA GTGTAATGCC TACTAATCTT TATGGCATAA ATGATAATTT CCACCCCGAA     8700

AACTCTCATG TTATTCCGGC ACTCATGCGT AGATTCCATG AGGCAAAAGA GAGTGGTGCA     8760

CCAGAAGTTA TTGTCTGGGG AACAGGAACA CCGATGCGTG AGTTTTTATA TGTTGATGAT     8820

ATGGCTGCCG CATCTGTTCA TGTAATGGAA CTTGACGAAG CAATTTATCA ACAAAATACA     8880

CAGCCTATGT TATCTCATAT TAATGTTGGT ACGGGTGTAG ATTGTTCCAT ACGTGAAATG     8940

GCTGAAACAA TGGCCTCTGT GGTGGGTTAT CAAGGTAAAA TTGTTTTTGA TGTTACTAAA     9000

CCTGATGGCA CTCCGCGCAA ACTTATGGAC GTTACCCGGC TCAAAAACTT GGGCTGGCAA     9060

TATCAATATA ACTTACATGA AGGCTTATCA TTAACATATA AATGGTTTAT TGAGAATATT     9120

           Orf8终止           Orf9起始

AATTCTTTTC GGGGATAGTT ATGAATAAGA GATTGGAACG TGAGCTATTT AAAACAATAG 9180

TTGAGCATAC TCCTCTAATC TCGATTGATC TCATAATTAG AAACGATAAA GGAGAGGCGC     9240

TGCTGGGGCA GCGCCTGAAT CGCCCAGCAC AAAATTATTG GTTTGTGCCA GGAGGGCGAA     9300

TTTATAAGGA TGAGTCATTC GAGATTGCAT TTAAGCGGAT AACATTTGAA GAGGTGGGCG     9360

TTCAAATTAG TCTTAATGAT GCCTTATTTC TAGGGGTGTA TGAACATTTT TACAATGATA     9420

ATTTTTCTGA AGCAGAATTT TCTACACACT ATGTAGTGCA TGGATATGAA ATCCAACTTA     9480

AACCTCAGCA ACTTCACCTA CCAACGGTCC AGCATAATTC CTACAAGTGG TTTGATGTAG     9540

TAACGTTGCT TAATAGCACT ACAGTTCATC AATATACCAA AAATTATTTT ATACCAAGGT     9600

Orf9终止Orf10起始

AATAGATATG CTACTTCCCG TTGTCATGGC CGGTGGTTCT GGTACCAGAT TATGGCCTCT  9660

TTCACGTACA CTTTATCCGA AACAATTTCT GTCTTTAAAT AGTCGTTTAA CCATGTTGCA     9720

AGAGACATTG CGGCGGCTTG ACAAGGTAGA ACATAAACCC GCTTTGGTCA TTTGTAACGA     9780

ATCACATCGC TTTATCGTTG CTGAACAATT GCGTAAAGAG GGTTTAAAGC ATAGCGGTAT     9840

TTTGCTTGAG CCTGTTGGTC GTAATACTGT GCCTGCTGTA GCACTCGCAG CACTACAGGC     9900

TATGGTAACT GGAGATGATC CTATTCTGTT GGTTCTTGCT GCTGATCATG AAATTCAGAA     9960

TGAGGATAAT TTCATTGATG CAGTTCTTGC AGCCAAGAAT TTTGCAGAAC AGGGTAAGCT    10020

TGTTACGTTT GGTATTGTTC CAACATCCCC AGAAACGGGC TATGGTTACA TTAAGTCAGG    10080

TGAATATCTG GATGGAAAAG GTTACAAAGT TGCTGCTTTT GTTGAAAAAC CAGAGCTTCA    10140

CGTAGCTCAG CAGTATATAT CAGATGGCGG TTATCTTTGG AATAGTGGGA TGTTTATGTT    10200

CAGAGCATCT GTATTTATCG ATGAACTGAA AAAATTCCGA CCAGATATTT TAGCCAGTTG    10260

CCAACGCTCC TTGTCCTCTT CGATACAAGA TTTAGATTTT ATCCGTCTGG ATAATGCTTC    10320

ATTTTCTTGC TGTCCTGAAG AGTCTATTGA CTATGCAGTT ATGGAAAAAA CAGCCGAAGC    10380

TGTCGTCGTT CCATTAAATG CACAATGGAG TGATGTTGGG TCATGGTCTG CATTGTGGGA    10440

AATAAGTTCA AAAGATCAAA GCGGTAATGC CATTCGTGGT GATGTATTGG TTGAAGATGC    10500

TACAGATAGT TATCTTTATT CGCAGCATAG ACTTATTGGT GCCGTGGGCA TAAAGGATTT    10560

GGTTGTTGTT GAAACGAAAG ATGCCGTATT AGTTGCTCAT AAAGATAAAG TTCAGCAAGT    10620

TAAAAACATC GTCGCTCAAC TTAAAAAGAA TAATCGCACA GAATATTTAC AGCATCGGGA    10680

AATATTTCGG CCTTGGGGCA GTCATGATAC TATAGCTGAA GGGCCGCGCT TTCAAGTGAA    10740

ACATGTGATT GTATTACCTG GCCACATTAC CGCTAAGCAA ATTCATTACC ATCGTACTGA    10800

GCATTGGATT GTTGTCTCGG GGACAGCTAA AGTCCATCTT GAAGATAAGA CTTACCTTGT    10860

TTCTGAAAAT GAATCAACAT ATATACCTGT TGGTGTTCCA CATGCCATTG AAAATCCTGG    10920

CAAGATCCCG CTTGAAATAA TCGAGGTCAG ATCAGGAGTC TACCTGGAAG AGGATGATGT    10980

                             Orf10终止   Orf11起始

TATAAGAGTT TCTTCTTCTG GAGTAGGATA CTAATGCGAA TTTCTATTAT CACAGCTACT  11040

TATAATAGTG AAAAAACTCT CCTTGATACA TTACTTTCTC TAGAAAAACA AACGTATCCA    11100

GATATCGAAT ATATAGTTGT AGATGGAGCA TCGAACGATA ATACAATTAA GCTGATTAAG    11160

AGTAATTGTA CAAAAGTTTC AAAAATCATT TGCGAACCCG ATAAGGGCAT TTATGATGCT    11220

CTGAATAAAG GTATTCAAGC AGCTTCGGGT GATGTTATTG GTTTTTTACA TTCTGATGAT    11280

TTATTAGCTT ATGATGATGC TATTGCAGAT ATAGCAAAAA CATTTGAAAT TACAGGGTGT    11340

GATGCTATTT ATGGCGATTT GGAGTATGTT GCCCAAAATA ATACGACTAA ACGTATTAGA    11400

TTATGGAAAA GTGGTTCATT TAGTCGTTTC AAGATGAAAG TGGGTTGGAT GCCGCCACAC    11460

CCATCATTTT ATATGAAACG CAAATGTTAT AGGCAGTTTG GTTGTTTTTC TTTAGATTAT    11520

CGTATATCTG CTGATTATGA CTCATTATTA CGATATATTT TAAAGCAACG TATTTCAATA    11580

GAATATTTAC CAAAAGTCTT AGTGAAGATG CGTGTTGGTG GAATTAGCAA TCGTTCAGTC    11640

TCTTCAATGG TAAAGAAGTC AATGGAAGAC ATCCGTGTTA TGAACCAGAA TGGTATTATC    11700

TGGCCAATAG CTTTAGTGTA TAAAAATATA TCCAAACTTC CTCAATTTAT TAAAAAGTAA    11760

 Orf12起始                                                   Orf11终止

TCATCATGTT AAATGTTAAA AAAATCATTA ACGATAGTAA TATTGCGTTC GGTACTAGTG  11820

GTGCTCGCGG TTTAGTGATC GATTTTTCCC ATGATGTTTG TGCTGCGTTC ACTCATGCGT    11880

TTCTTTCTGT TATTGATGAC AAATACAATT TTAATAAAGT TGCCTTAGCA ATTGATAACC    11940

GCCCAAGCAG TTACGAAATC GCTCAGGCAT GCGCCTTCGC TATCAAACAA CATGGGTTCA    12000

CTGTCGAATA TCATGGTGTA ATTCCGACTC CCGCATTAGC TCATTATTCG ATGCAGAAAA    12060

ACATTCCCTG CATAATGGTC ACAGGGAGTC ATATCCCTTT TGATCGTAAT GGCTTAAAAT    12120

TCTACAGACC TGATGGTGAA ATCACTAAAG AGGATGAGCT CGCAATTATA AATAGTGAGT    12180

ATACATTTCC GCCTGTAGGT GTATTACCTC ATCTTGAAAC AAGCACTCAA GGTGCAGACT    12240

ACTACCTTGA GCGTTATGTT TCTCTTTTTA ATCCCGAGAT TTTAAAGGGG AAAAGAATAG    12300

GGGTATATGA ACATTCTAGT GCGGGACGCG ATTTATATGC TCCTCTTTTT AATCAAATGG    12360

GTGCAGAGGT CATTTCCCTC GGCAGGAGTG ATGAGTTCGT TCCGATTGAT ACGGAAGCAG    12420

TAAGCGATGA AGATCGTATA CTTGCAAGAG AGTGGTCTAA AAAATATAAT CTTGATGCTA    12480

TTTTCTCAAC AGATGGCGAT GGTGATCGTC CTTTAGTTGC TGATGAAAAT GGTGAATGGT    12540

TAAGAGGCGA TATTCTGGGA CTACTTACTG CTATTGAACT TAATATCAAG GCGTTGGCTA    12600

TTCCAGTGAG TTGTAATACA GCAATTGAAG AGTCTAATAA ATTTGCAAGT ATACAACGAA    12660

CGAAAATAGG TTCTCCTTAT GTAATTGCAG CATTTGCAGA TCTTGCTAAG CAATTTGATT    12720

CAGTCGCAGG TTTTGAAGCT AATGGTGGTT TTCTCCTTGC CTCCGATTTA CAAATTAATG    12780

GCAAGGAATT AAAATCGTTG CCTACACGAG ATGCTGTGTT ACCAGCATTA ATGCTCTTAA    12840

TAGCTTCTCG CAATAGTACT ATTTCTCAAC TGATTAATAA TCTTCCTCAG CGATTCACTT    12900

GGTCAGATAG AGTTAAAAAC TTCCCTTCAG ATTCAAGTCA ACAAATTATA AAAAATGCCA    12960

TATCGTCACC CAATAATTTC TTTAATAGTT TAGGTTATGA ATCATTATCC TGTTCCGCTA    13020

TTGATGAAAC GGATGGTGCA AGATTTACTT TAAATAATGG TGATATTATA CATCTCCGTC    13080

CTTCCGGTAA TGCTCCAGAA CTCCGTTGTT ATGCTGAGGC CAGTGATGAA AATCAGGCTA    13140

                                                Orf12终止

AGCAATATGT TACGAATGTG CTGGGAAATA TTACCTCTTT GATTTCTTGA TGTTATAGGT  13200

TTATCTACGC TTATATGTGT GCGTAGGTTT GATTACACGT AGATGCCGGT ATACAGAATT    13260

GAAGAACGGT ATTTGTTGCA TTAATGAAAT TCAGCACTAC ACACATTCGT GCAACTTGAG    13320

ATAACATCTC AATCATATTC AAGTCGCGCA TACATCGCGG TGAACACCCC CTGACAGGAG    13380

TAAACAATGT CAAAGCAACA GATCGGCGTC GTCGGTATGG CAGTGATGGG GCGCAACCTT    13440

GCGCTCAACA TCGAAAGCCG TGGTTATACC GTCTCTATTT TCAACCGTTC CCGTGAGAAA    13500

ACGGAAGAAG TGATTGCCGA AAATCCGGGC AAGAAACTGG TTCCTTACTA TACGGTGAAA    13560

GAGTTTGTTG AATCTCTGGA AACGCGTCGT CGCATCCTGT TAATGGTGAA AGCAAGTGCA    13620

GGCACGGATG CTGCTATTGA TTCCCTCAAA CCATATCTCG ATAAAGGCGA CATCATCATT    13680

GATGGTGGTA ACACCTTCTT CCAGGACACC ATTCGTCGTA ACCGTGAGCT TTCTGCCGAA    13740

GGCTTTAACT TCATTGGTAC CGGTGTCTCC GGTGGTGAAG AAGGCGCGCT GAAAGGTCCT    13800

TCCATTATGC CTGGTGGGCA GAAAGAAGCC TATGAACTGG TTGCGCCGAT CCTGACCAAA    13860

ATCGCCGCAG TGGCTGAAGA CGGCGAGCCA TGCGTTACCT ATATTGGTGC CGATGGTGCA    13920

GGTCACTATG TGAAGATGGT TCACAACGGT ATTGAATACG GCGATATGCA GCTGATTGCT    13980

GAAGCCTATT CTCTGCTTAA AGGTGGCCTG AATCTCACCA ACGAAGAACT AGCGCAGATC    14040

TTTACCGAGT GGAATAACGG TGAACTTAGC AGCTACCTGA TCGACATCAC CAAAGATATC    14100

TTCACCAAAA AAGATGAAGA GGGTAACTAC CTGGTTGATG TGATTCTGGA TGAAGCAGCA    14160

AACAAAGGTA CGGGCAAATG GACCAGCCAG AGTGCGCTCG ATCTCGGCGA ACCGCTGTCG    14220

CTGATTACCG AGTCTGTGTT TGCACGTTAT ATCTCTTCTC TGAAAGATCA GCGCGTTGCC    14280

GCTTCTAAAG TTCTCTCTGG CCCGCAAGCG CAGCCAGCAG GCGATAAGGC TGAGTTCATC    14340

GAAAAAGTTC GTCGTGCGCT GTATCTGGGC AAAATCGTTT CTTACGCTCA GGGCTTCTCT    14400

CAACTGCGTG CTGCGTCTGA AGAGTACAAC TGGGATCTGA ACTACGGCGA AATCGCGAAG    14460

ATTTTCCGTG CTGGCTGCAT CATCCGTGCG CAGTTCCTGC AGAAAATCAC CGATGCCTAT    14520

GCCGAAAATC CGCAGATCGC TAACCTGCTG CTGGCTCCGT ACTTCAAGCA AATTGCCGAT    14580

GACTACCAGC AGGCGCTGCG CGATGTCGTC GCTTATGCGG TACAGAACGG TATACCCGGT    14640

TCCGACCTTT GCTGCTG                                                   14657

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。