灰树花多糖产品中活性多糖含量的测定方法

摘要

本发明公开一种灰树花多糖产品中具有生物活性的水溶性多糖含量的测定方法，其方法包括脂溶性成分除去，可溶性糖类干扰物质除去，硫酸－苯酚法测定活性多糖含量等步骤。本发明的方法具有可操作性强、测定结果稳定可靠、测定结果的变异系数小、误差小、重现性高等优点。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及灰树花多糖提取物的测定方法，尤其涉及灰树花深层液体发酵液多糖提取物中具有生物活性的水溶性多糖含量的定量测定方法。

(二)背景技术

灰树花深层液体发酵液多糖提取物中主要包括了活性成分多糖和非活性成分淀粉；其中，活性成分多糖含量的定量测定对于灰树花活性多糖产品的质量控制和多糖制品生产工艺的确定是十分必要的。然而，由于生物多糖提取物中非活性成分淀粉的存在而使产品质量标准的控制难以实施。关于灰树花多糖中活性成分多糖含量的测定目前尚无理想的常规分析方法，只是采用“GB/T 15672-1995食用菌总糖含量的测定方法”进行测定；在目前所用的方法中没有灰树花多糖测定的国家标准，也没有食用菌或者植物多糖的测定方法可供借鉴。因此，灰树花多糖产品中生物活性多糖的测定，目前都是沿用粗多糖的测定方法。粗多糖测定结果中，除了灰树花多糖中具有生物活性的水溶性多糖的含量外，还包含了灰树花多糖中非活性成分多糖-淀粉的含量，因而测定结果无法应用于产品质量的检验、监督，使得灰树花活性多糖产品的质量控制、生产过程中灰树花活性多糖的含量的准确检测产生了很大的不确定性。因此，灰树花活性多糖产品中活性成分多糖含量的定量测定成了其产品开发、生产以及质量控制中的关键技术问题。而现有方法“GB/T 15672-1995食用菌总糖含量的测定方法”所存在的不足以及如何进一步改进和完善，成了目前灰树花多糖产品中活性成分多糖含量的定量测定方法中所亟待解决的问题。

(三)发明内容

本发明的目的即是针对上述灰树花多糖产品中活性成分多糖含量测定方法所存在的不足，提供一种精确的测定灰树花多糖产品中活性成分多糖含量的方法。本发明所涉及的灰树花多糖产品中具有生物活性的水溶性多糖含量的测定方法，具有可操作性强、测定结果准确、稳定、可靠、误差小、重现性高、在一般常规实验室即可进行测定等优点。

本发明的灰树花多糖产品中具有生物活性的水溶性多糖的测定方法，由以下步骤组成：    

1)除去脂溶性成分：取烘干磨碎的待测多糖样品，分别称0.5～2克于6个离心杯中，分别加入30ml乙醚，充分振荡5～15分钟，以4000～5000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，再加入30ml乙醚，如此重复离心3次；

2)除去可溶性糖类干扰物质：向上述弃去上清液后的离心杯中加入50～60℃的80％乙醇30ml，充分振荡5～15分钟，以4000～5000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，如此重复离心3次；然后再向离心后的杯中加入40～50℃蒸馏水30ml，在40～50℃恒温水浴中振荡60分钟，以4000～5000转/分钟离心5～10分钟，收集上清液，再以此方法重复离心3次，上清液均收集于容量瓶中；定容至100～250ml，用作活性多糖待测溶液；

3)硫酸-苯酚法测定活性多糖含量：吸取多糖待测溶液5～25ml，用蒸馏水稀释至50～300ml，吸取该稀释定溶液1～2ml，分别加于6个25ml比色管中，依次加入蒸馏水补至总体积为2.0ml，再分别加入5％苯酚1.0ml，浓硫酸5.0ml，然后迅速放入沸水浴中12～18分钟，再迅速冷却至25～30℃，用蒸馏水定容至10ml，摇匀、冷却后以空白样品为参比，在485nm波长下，1cm比色皿测定光密度，根据标准曲线得出待测液中多糖的质量。

其中，上述步骤1)或2)所述的振荡时间是8～12分钟。

其中，上述步骤2)所述80％乙醇的温度是55～58℃。

其中，上述步骤2)所述加入的蒸馏水和恒温水浴的温度均为45～50℃。

其中，上述步骤3)所述多糖待测溶液的用量是5～15ml。

其中，上述步骤3)所述多糖待测溶液用蒸馏水稀释后的终体积是50～250ml。

其中，上述步骤3)所述在沸水浴中的处理时间为15分钟。

本发明所采用的灰树花多糖产品中具有生物活性的水溶性多糖含量的测定方法，具有可操作性强、测定结果稳定可靠、测定结果的变异系数小、误差小、重现性高等优点。实验显示，根据样品中水溶性多糖的含量不同，变异系数一般在5％～10％范围内。可满足常规实验室对分析测试的要求以及相关企业对产品质量的控制要求。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

(四)具体实施方式

实施例1：

1)除去脂溶性成分：取烘干磨碎的待测活性多糖样品(编号为1号)，质量分别为1.0727克、1.1028克、1.1509克、0.948克、1.1813克、1.0481克，分别放于6个离心杯中，分别加入30ml乙醚，充分振荡12分钟，以4500转/分钟离心8分钟，弃去上清液，再加入30ml乙醚，如此重复离心3次；

2)除去可溶性糖类干扰物质：向上述弃去上清液后的离心杯中加入58℃的80％乙醇30ml，充分振荡15分钟，以5000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，如此重复离心3次；然后再向弃去上清液后的离心杯中加入50℃蒸馏水30ml，在50℃恒温水浴中振荡60分钟，以5000转/分钟离心5分钟，收集上清液，再以此方法重复离心3次，上清液均收集于容量瓶中；定容至100ml，用作活性多糖待测溶液(V₁)；

3)硫酸-苯酚法测定活性多糖含量：

3.1标准曲线的绘制：

3.1.1葡聚糖标准储备液的配置：准确称取相对分子质量T500(50万单位)、已于烘箱中烘至恒重的葡聚糖0.5000g，蒸馏水溶解后定容至50ml，混匀后置于冰箱中备用。

3.1.2葡聚糖标准使用液的配置：准确吸取葡聚糖标准储备液1.0ml于100ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀后置于冰箱中备用。

3.1.3标准曲线的绘制：分别准确吸取葡聚糖标准使用液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于6个25ml比色管中，依次加入蒸馏水补至总体积为2.0ml，再分别加入5％苯酚1.0ml，浓硫酸5.0ml，然后迅速放入沸水浴中15min，再迅速冷却至27℃。用蒸馏水定容至10ml，摇匀、冷却后在485nm波长下测定光密度。以标准空白为参比，光密度为纵坐标，葡聚糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3.2活性多糖含量的测定：

吸取多糖待测溶液5ml(V₂)，用蒸馏水稀释至50ml(V₃)，吸取该稀释定溶液2ml(V₄)，分别加于6个25ml比色管中，依次加入蒸馏水补至总体积为2.0ml，再分别加入5％苯酚1.0ml，浓硫酸5.0ml，然后迅速放入沸水浴中15min，再迅速冷却至25℃，用蒸馏水定容至10ml(V₅)，摇匀、冷却后以空白样品为参比，在485nm波长下，1cm比色皿测定光密度，根据标准曲线得出待测液中多糖的质量(A)。

同时按同一方法做试剂空白试验。

3.3结果计算：活性多糖％＝(A-A₀)/m*n*100

式中：活性多糖含量以葡聚糖计，

A——测液中多糖的质量，μg；

A₀——空白液品液中多糖的质量，μg；

m——样品质量，μg；

n——稀释倍数。实施例中为n＝100/5*50/2*10＝5000

灰树花活性多糖含量的测定实施例分析结果见附表1：

                            附表1：灰树花活性多糖含量的测定实施例分析结果                                       实施例1(C＝1mg/ml)     样品编号  重  复  m(g)   V₁  (ml)    V₂   (ml)    V₃   (ml)    V₄   (ml)    V₅    (ml)    A-A₀    (μg)  活性多糖  ％      1号     (灰树花粗     多糖2N)  1  1.0727  100    5    50    2    10    49.04  22.86  2  1.1028  100    5    50    2    10    48.16  21.84  3  1.1509  100    5    50    2    10    48.52  21.08  4  0.948  100    5    50    2    10    49.00  25.84  5  1.1813  100    5    50    2    10    48.51  20.53  6  1.0481  100    5    50    2    10    47.52  22.67    平均  22.47    标准差    STDEV  1.880    变异系数    CV％  8.365    均数标准差  0.7674    平均数±均    敷标准差  22.47±0.77实施例2：

1)除去脂溶性成分：取烘干磨碎的待测活性多糖样品(编号为2号)，质量分别为0.9368克、0.9465克、0.9254克、1.0136克、0.8831克、0.8177克，分别放于6个离心杯中，分别加入30ml乙醚，充分振荡8分钟，以5000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，再加八30ml乙醚，如此重复离心3次；

2)除去可溶性糖类干扰物质：向上述弃去上清液后的离心杯中加入55℃的80％7醇30ml，充分振荡13分钟，以4000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，如此重复离心3次；然后再向弃去上清液后的离心杯中加入40℃蒸馏水30ml，在45℃恒温水浴中振荡60分钟，以5000转/分钟离心5分钟，收集上清液，再以此方法重复离心3次，上清液均收集于容量瓶中；定容至250ml，用作活性多糖待测溶液(V₁)；

3)硫酸-苯酚法测定活性多糖含量：

3.1标准曲线的绘制：

3.1.1葡聚糖标准储备液的配置：准确称取相对分子质量T500(50万单位)、已于烘箱中烘至恒重的葡聚糖0.5000g，蒸馏水溶解后定容至50ml，混匀后置于冰箱中备用。

3.1.2葡聚糖标准使用液的配置：准确吸取葡聚糖标准储备液1.0ml于100ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀后置于冰箱中备用。

3.1.3标准曲线的绘制：分别准确吸取葡聚糖标准使用液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于6个25ml比色管中，依次加入蒸馏水补至总体积为2.0ml，再分别加入5％苯酚1.0ml，浓硫酸5.0ml，然后迅速放入沸水浴中15min，再迅速冷却至27℃。用蒸馏水定容至10ml，摇匀、冷却后在485nm波长下测定光密度。以标准空白为参比，光密度为纵坐标，葡聚糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3.2活性多糖含量的测定：

吸取多糖待测溶液15ml(V₂)，用蒸馏水稀释至50ml(V₃)，吸取该稀释定溶液1ml(V₄)，分别加于6个25ml比色管中，依次加入蒸馏水补至总体积为2.0ml，再分别加入5％苯酚1.0ml，浓硫酸5.0ml，然后迅速放入沸水浴中15min，再迅速冷却至25℃，用蒸馏水定容至10ml(V₅)，摇匀、冷却后以空白样品为参比，在485nm波长下，1cm比色皿测定光密度，根据标准曲线得出待测液中多糖的质量(A)。

同时按同一方法做试剂空白试验。

3.3结果计算：活性多糖％＝(A-A₀)/m*n*100

式中：活性多糖含量以葡聚糖计，

A——测液中多糖的质量，μg；

A₀——空白液品液中多糖的质量，μg；

m——样品质量，μg；

n——稀释倍数。实施例中为n＝100/5*50/2*10＝5000

灰树花活性多糖含量的测定实施例分析结果见附表2：

                              附表2：灰树花活性多糖含量的测定实施例分析结果                                               实施例2(C＝1mg/ml)     样品编号  重  复  m(g)   V₁  (ml)    V₂   (ml)    V₃  (ml)   V₄  (ml)   V₅  (ml)    A-A₀    (μg)  活性多糖  ％      2号    (灰树花多    糖)  1  0.9368  250    15    50    1    10    37.77  10.08  2  0.9465  250    15    50    1    10    39.2  10.35  3  0.9254  250    15    50    1    10    38.98  10.53  4  1.0136  250    15    50    1    10    41.8  10.31  5  0.8831  250    15    50    1    10    37.79  10.70  6  0.8177  250    15    50    1    10    35.34  10.80  平均  10.46  标准差  STDEV  0.268  变异系数  CV％  2.561  均数标准差  0.1094  平均数±均  数标准差  10.46±0.11