建立洋葱的雄性不育无性系和保持系的方法

摘要

本发明涉及一种利用植物组织培养方法建立洋葱雄性不育无性系的方法及在此技术的基础上建立洋葱的雄性不育无性系和保持系的方法,此方法是利用植物组织培养方法将洋葱雄性不育单株扩繁为雄性不育无性系,用雄性不育无性系与同一品种洋葱的可育鳞茎球株进行繁殖获得洋葱的不育系和保持系,利用植物组织培养方法可获得不育率为93.5—97.5%的洋葱不育系和保持系。

说明书

本发明涉及一种用植物组织培养法建立洋葱雄性不育无性系的方法，及在此技术的基础上建立洋葱的雄性不育无性系和保持系的方法。

洋葱是重要的蔬菜之一。在我国，由于洋葱易于种植，能贮存到蔬菜淡季供应市场，有多种食用方法和广泛的医疗保健作用而得到较大面积的种植。洋葱是以营养体鳞茎为产品，其杂交种理应有较明显的优势，但到目前为止，我国仍没有洋葱杂交种在生产中应用。要想得到洋葱杂交种，必须得到洋葱品种的雄性不育无性系和与其对应的保持系。我国拥有众多的洋葱优良品种，比如：北京黄皮、北京紫皮、南京黄皮等，几乎每一个洋葱品种中均有雄性不育单株存在，而要从不育单株建立起不育系和找到其对应的保持系是十分困难的。

本发明的目的就是利用植物组织培养法建立起洋葱雄性不育无性系和保持系的方法。

该发明的技术方案是：利用植物的组织培养方法，将洋葱雄性不育单株扩繁为雄性不育无性系，用雄性不育无性系与同一品种洋葱的可育鳞茎球株进行繁殖获得洋葱的不育系和保持系。

具体步骤如下：

开花期在洋葱采种田选取花药中无花粉的采种株，将其整株拔下取回到实验室。用醋酸洋红对花药做镜检，只有在显微镜下观察不到活花粉或无花粉的采种株，才能确定为雄性不育单株。

将已确认为雄性不育单株的采种株下部的鳞茎切下，即从根基部向上10至15厘米处将鳞茎切下。除去鳞茎多层外皮再用自来水冲洗干净，然后用70％酒精浸泡整个鳞茎30分钟，再用饱和漂白粉上清液浸泡1小时，其后用1％高锰酸钾浸泡15分钟，再后用0.3％升汞浸12分钟，最后在超净工作台上用无菌水冲洗数次，就可准备进行接种。

将消毒好的鳞茎放入有滤纸的培养皿中，由滤纸将鳞茎表层水份吸干。将载坡片、刀子、镊子等工具消毒并冷却，然后将鳞茎的上半部和周边切掉，将其内部带根茎基部的侧芽切成长宽各1厘米高2厘米的长方形外植体，再从顶部切十字形切口，随后将外植体接种到洋葱快繁培养基1或2中。(培养基成份见表1和表2)

在不污染的情况下经20至40天的培养，侧芽由外植体中长出，随后转移到新配制的洋葱快繁培养基1或2中，再经过20至30天可长成丛生芽，其后每20天左右就可扩繁一次。

将扩繁好的洋葱苗一丛一丛(每丛4至5株)转入洋葱生根培养基1或2中。(培养基成份，见表3和表4。在温度25℃左右条件下，经过20至30天就可生根。

移栽前要将花盆和移栽用沙土消毒灭菌。移栽时将洋葱苗从培养瓶中取出，放入温水中把根部的培养基清除干净，然后将洋葱苗一丛丛栽入土中，栽后浇足水，放在夜15℃左右昼25℃左右的条件下培养。经过30至40天的培养，洋葱苗色为深绿且长势旺盛，表明已在沙土中移栽成活了。

                          表1洋葱快繁培养基1(mg/l)

          NH₄NO₃      1650-1750       CaCL₂·2H₂O      400-520       MgSO₄·7H₂O      310-410           KNO₃      1400-2100          KH₂PO₄      140-210       ZnSO₄·7H₂O      9.5-11.5          H₃BO₃      8.0-11.0       MnSO₄·4H₂O      22-29       CuSO₄·5H₂O      0.02-0.03      Na₂MoO₄·2H₂O      0.2-0.3    C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O      36.5-38.5       FeSO₄·7H₂O      27.0-28.5           VB₁      0.4-0.8       VB₆      0.3-1.0       VB₉      0.4-0.8       肌醇      80-120       烟酸      3-7      甘氨酸      1-5     生物素(H)      0.02-0.07   Kinetin/6-BA      2-8     NAA/IAA      0.3-0.8      蔗糖       30000      琼脂       8000       PH       5.8                                 表2洋葱快繁培养基2(mg/l)       KNO₃      1400-2100      NH₄NO₃      1550-1750    CaCL₂·2H₂O      400-520     MgSO₄.7H₂O      310-410       KH₂PO₄      140-210    MnSO₄·4H₂O      22-29    ZnSO₄·7H₂O      9.5-11.5    CuSO₄·5H₂O      0.02-0.03       H₃BO₃      5.6-8.0   Na₂MoO₄·2H₂O      0.2-0.3         KI      0.6-0.9    COCL₂·6H₂O      0.02-0.03 C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O      36.5-38.5    FeSO₄·7H₂O      27.0-28.5         VB₁      0.3-0.9       VB₆      0.3-1.0      烟酸      0.5-5.0     甘氨酸      1.0-4.0      肌醇      80-120   Kinetin/6-BA      2-8     NAA/IAA      0.3-0.8      蔗糖      30000      琼脂      8000       PH      5.8                                       表3洋葱生根培养基1(mg/l)        NH₄NO₃     1650-1750     CaCL₂·2H₂O     400-520     MgSO₄·7H₂O     310-410         KNO₃     1400-2100        KH₂PO₄     140-210     ZnSO₄·7H₂O     9.5-11.5        H₃BO₃     8.0-11.0     MnSO₄·4H₂O     22-29     CuSO₄·5H₂O     0.02-0.03    Na₂MoO₄·2H₂O     0.2-0.3 C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O     36.5-38.5     FeSO₄·7H₂O     27.0-28.5          VB₁     0.4-0.8          VB₆     0.3-1.0          VB₉     0.4-0.8         肌醇     80-120         烟酸     3-7     甘氨酸       1-5    生物素(H)       0.02-0.07   Kinetin/6-BA       2-8     NAA/IAA       0.3-0.8     活性碳       2500-5000      蔗糖       30000      琼脂       8000       PH       5.8                                        表4洋葱生根培养基2(mg/l)         KNO₃     1400-2100        NH₄NO₃     1550-1750     CaCL₂·2H₂O     400-520     MgSO₄·7H₂O     310-410       KH₂PO₄     140-210     MnSO₄·4H₂O     22-29     ZnSO₄·7H₂O     9.5-11.5     CuSO₄·5H₂O     0.02-0.03        H₃BO₃     5.6-8.0    Na₂MoO₄·2H₂O     0.2-0.3          KI     0.6-0.9     COCL₂·6H₂O     0.02-0.03  C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O     36.5-38.5      FeSO₄·7H₂O     27.0-28.5          VB₁     0.3-0.9          VB₆     0.3-1.0         烟酸     0.5-5.0        甘氨酸     1.0-4.0      肌醇    80-120   Kinetin/6-BA    2-8     NAA/IAA    0.3-0.8     活性碳    2500-5000      蔗糖    30000      琼脂    8000       PH    5.8

用此方法培育出来的洋葱组培苗无论是幼苗还是鳞茎球，开花后均表现为雄性不育，由此可知雄性不育无性系已建成。

将用组培法获得的洋葱雄性不育无性系的单个鳞茎球收藏，从当时选取到不育单株的同一地点取得洋葱鳞茎球(即取得的鳞茎球要和取得的不育材料为同一品种)，数量依不育鳞茎球而定，比例为1∶1。这直接取得的鳞茎球为可育株。将不育株和可育株的鳞茎球两两种在一起，种球的栽培管理与一般洋葱采种田相同。

种株抽苔期，要做好纱网将每对种株罩在一起，制做纱网一般用较细的窗纱即可。在初花时，以进行辅助授粉。

采摘种子必须及时，不能让种子随便散落，因为确认种子采自那一株对下一步选育十分重要。必须按所编株号采取种子，例如每对种株的不育株编为1-A，其对应的可育株则应编为1-B。第二对种株相应编为2-A和2-B。依此类推。因为要对不育率进行统计和比较，所以对采自不育株的种子要全部播种并将所得幼苗全部保留并种植好。来自可育株的种子也要全部播种。

在开花期，统计来自每对种株中不育株幼苗的不育率。将不育率最高的几对留下，其它的拔除。例如，1-A的群体不育率为75％,3-A的群体为71％，而其它株号的A群体均少于70％时，可仅留下1-A和3-A，而将其它成对群体拔除。随后在1-A和3-A的群体中做如下工作：(1)将1-A中的第一株和1-B的第一株，即1-A-1和1-B-1(或其它株)成对隔离授粉。同样，可将1-A-2和1-B-1(或其它株)成对隔离授粉等等……依此类推。(2)将1-B-1和1-B-2等做自交留种。

播种从1-A-1和1-B-1等种株上采得的编号种子。所有的各类安排如其上一代，即1-A和1-B那一代。

如果统计不育率的结果是：1-A-1的群体为90.2％,3-A-5的群体为97.5％，而其它群体低于90％时，可仅保留3-A-5的群体，而将其它群体淘汰。此时，3-A-5为不育系，3-B-5为其保持系。若对这一不育率还不满意，可按上述方法进一步找具更高不育率的不育系和保持系。

利用植物组织培养方法可获得不育率为93.5-97.5％洋葱不育系和保持系，育成的不育系和保持系可大量繁殖不育系，利用不育系和经筛选出的父本品种即可生产杂交种。

实施例1

熊岳洋葱具有极好的耐储藏性，本实施例选用熊岳洋葱扩繁雄性不育系。在熊岳洋葱开花期，在其采种田里选取花药中无花粉的采种株，将其整株拔下，取回到实验室，用醋酸洋红对花药做镜检，只有在显微镜下观察不到活花粉或无花粉的采种株，才能被确定为雄性不育单株。将已确认为雄性不育单株的采种株下部的鳞茎切下，即从根基部向上10cm处将鳞茎切下。除去鳞茎多层外皮再用自来水冲洗干净，然后用70％酒精浸泡整个鳞茎30分种，再用饱和漂白粉上清液浸泡1小时，其后用1％高锰酸钾浸泡15分种，再后用0.3％升汞浸12分钟，最后在超净工作台上用无菌水冲洗数次后，准备接种。将消毒好的鳞茎放入有滤纸的培养皿中，由滤纸将鳞茎表层水份吸干。将载玻片、刀子、镊子等工具消毒并冷却，然后将鳞茎的上半部和周边切掉，将其内部带根茎基部的侧芽切成长宽各1cm，高2cm长方形外植体，再从顶部切十字形切口，然后将外植体接种到洋葱快繁培养基1中(培养基成份见表1)。在不污染的情况下经20-40天的培养侧芽由外植体中长出，随后转移到新配制的洋葱快繁培养基1中，再经过20-30天长成丛生芽，其后每20天左右扩繁一次。将扩繁好的洋葱苗一丛一丛(每丛4-5株)转入洋葱生根培养基1中(成份见表3)。在温度20℃左右条件下，经过20-30天生根。然后将洋葱苗从培养瓶中取出，放入温水中把根部的培养基清除干净，栽入经过消毒灭菌的沙土中。栽后浇足水，放在夜15℃，昼25℃的条件下培养，经过30-40天培养洋葱苗色为深绿且长势旺盛为成活了。无论是幼苗还是鳞茎球，开花后均表现为雄性不育，由此可知雄性不育无性系已建成。将用组培法获得的洋葱雄性不育无性系的单个鳞茎球收藏，从当时选取到不育单株的同一地点取得洋葱鳞茎球，数量依不育鳞茎球而定，比例为1∶1。将不育株和可育株的鳞茎球两两种在一起，种球的栽培管理与一般洋葱采种田相同。种株抽苔期，用纱网将每对种株罩在一起，在初花时，要在每个纱罩中放入一些人工饲养苍蝇，以进行辅助授粉。种子成熟后及时采摘并按编号采收种子。然后按编号将全部采收到的不育株的种子和可育株的种子全部播种。统计来自每对种株中不育株幼苗的不育率，把不育率高的几对留下，其余拔除。把留下的成对隔离授粉，这样不断地选育，到选择到理想的不育率为止。最后获得不育率为93.5％的熊岳洋葱不育系和保持系。利用熊岳洋葱的不育系做母本，经过筛选的北京黄皮洋葱做父本即可生产出比母本和父本品种性能更优良的洋葱杂交种，产量是父本增产16％，比母本增产21％。

实施例2

北京黄皮洋葱具有较好的品质和丰产性，本实施例选用北京黄皮洋葱的雄性不育单株扩繁雄性不育无性系。用与实施例1同样的方法选取雄性不育单株。并将已确认的雄性不育单株下部的鳞茎切下，即从根基部向上15cm处将鳞茎切下。用与实施例1同样的方法对切下的鳞茎进行消毒处理和做好外植体接种到洋葱快繁培养基2中。(培养基成份见表2)

经过近20-40天的培养，侧芽由外植体中长出，随后转移到新配制的洋葱快繁培养基2中，再经过20-30天长成丛生芽，其后每20天左右扩繁一次。将扩繁好的洋葱苗每4-5株一丛转入洋葱生根培养基2中(成份见表4)。在温度25℃左右条件下，经过20-30天生根。把生根后的洋葱苗栽到沙土中。栽后浇水，放在夜15℃左右，昼25℃的条件下培养，经过30-40天培养洋葱苗色为深绿且长势旺盛，表明已移栽成活。无论是幼苗还是鳞茎球，开花后均表现为雄性不育。将用组培法获得的洋葱雄性不育无性系的单个鳞茎球与同一品种的可育鳞茎球两两种在一起，用与实施例1相同的方法得到不育率为97.5％的北京黄皮洋葱的不育系和保持系。利用北京黄皮洋葱的不育系做母本，经过筛选的北京紫皮洋葱做父本即可生产出比母本和父本品种性能更优良的洋葱杂交种，产量比父本增24％，比母本增11％。

实施例3-实施例4用实施例1的方法，分别从北京紫皮和南京黄皮中选择出雄性不育单株，然后用与实施例1相同的方法和条件对其单株进行分株培养和根系培养，建立起雄性不育无性系。然后用与实施例1相同的方法选用各自的可育株做父本，两两配对分别获得不育率95.5％的北京紫皮洋葱的不育系和保持系，不育率为94.5％的南京黄皮洋葱的不育系和保持系。分别利用北京紫皮洋葱不育系和南京黄皮洋葱不育系做母本，经过筛选的熊岳洋葱做父本，即可生产出比母本和父本品种性能更优良的洋葱杂交种，产量分别比父本增19％和22％，比母本增17％和26％。