区分华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法

摘要

区分华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法，涉及一种利用PCR-RFLP的技术鉴别华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的分子方法，该方法使用相同引物进行PCR扩增，华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴均可以扩增出长度约为1200bp的核糖体转录区间隔子序列（ITS）。该PCR产物使用限制性内切酶 Xho I进行酶切，电泳图出现两条条带的为华支睾吸虫囊蚴，有一条条带的为东方次睾吸虫囊蚴。因此可根据PCR产物酶切后有无条带的变化实现准确快速鉴别。本发明鉴别方法简单，效率和准确率较高；本方法鉴别快速仅需1个工作日即可；同时成本较低。

说明书

技术领域

    本发明涉及一种利用PCR-RFLP的技术鉴别华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的分子方法，特别是涉及一种区分华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法。

背景技术

华支睾吸虫病是一种非常重要的人兽共患寄生虫病，呈水系流域分布。华支睾吸虫在发育过程中需要两个中间宿主，第一中间宿主为淡水螺，第二中间宿主是淡水鱼虾，国内已证实的淡水鱼宿主约有140种，以鲤科鱼类为主。华支睾吸虫成虫寄生于犬猫和人的肝胆管引起华支睾吸虫病。华支睾吸虫病主要引起胆管炎、胆囊炎、胆管肝炎和肝硬化等，甚至可并发人的胆管上皮癌，极少数患者可致侏儒症，是当前我国最严重的食源性人兽共患寄生虫病之一，严重影响人体健康。根据调查，全国约有1249万人感染华支睾吸虫，该病是2006-2015年全国重点防治寄生虫病规划中的病种之一；而东方次睾吸虫和华支睾吸虫的生活史相似，但东方次睾吸虫主要感染禽类，仅实验条件下有感染人的报道。人类主要通过生食或半生食含有这两种吸虫囊蚴的淡水鱼感染吸虫，东方次睾吸虫的流行区域往往与华支睾吸虫的流行区域重叠，因此建立一种快速简便的鉴别这两种囊蚴的方法在公共卫生方面具有重要意义。

目前鉴别华支睾吸虫和东方次睾吸虫囊蚴的方法主要有显微镜观察和动物感染实验等传统方法。显微镜观察需要操作人员具有丰富的形态学鉴别经验，而且在实际操作中可容易引起误判。而动物感染实验则有周期长、操作麻烦等缺点，不适合基层或现场快速检测。因此急需一种操作简单可以快速完成的鉴别方法。DNA多态性已成为人们用于研究动物群体遗传学的最有效的工具，不仅能够准确地反映DNA水平的变化，全面、精确地分析种群的遗传变异，而且还可以进行种群亲缘关系分析和计算种群间的遗传距离等。核糖体转录区间隔子序列（ITS）既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，在种间的变异率比在种内的低，具有种的特异性，种内高度保守，在不同种间又有不同程度的变异，是鉴别种间遗传变异的理想分子标记。而且位于ITS 两侧的编码区便于设计通用引物。因此，本研究拟应用核糖体序列分析来源于不同宿主和地域的华支睾吸虫和东方次睾吸虫囊蚴的多态性，并依据核糖体序列多态性分析的结果建立适用于鉴别华支睾吸虫和东方次睾吸虫的PCR-RFLP方法。

目前国内外尚无有关利用PCR-RFLP方法区分华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种区分华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法，该方法利用XhoI限制性内切酶进行两种吸虫囊蚴的核糖体酶切鉴别，可准确区分两种形态相似的吸虫囊蚴，鉴别方法简单，效率和准确率较高。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

区分华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法，所述方法包括以下步骤：

（1）提取华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴核糖体基因组DNA；

（2）用上游引物P1和下游引物P2同时对华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴进行PCR扩增，得到相应的 ITS 序列片段；上游引物P1和下游引物P2的序列分别为：

上游引物P1：5’-GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA -3’；

下游引物P2：5’-TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT -3’；

（3）取PCR扩增产物经Xho I酶切后进行RFLP分析，可被酶切的为华支睾吸虫囊蚴，不可被酶切的为东方次睾吸虫囊蚴。

所述的区分华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法，所述步骤（2）两种囊蚴PCR扩增产物经胶回收为1200bp。

所述的区分华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法，所述步骤（3）中的RFLP分析具体为：XhoI酶切位点位于华支睾吸虫囊蚴核糖体序列的470位，华支睾吸虫囊蚴可被Xho I酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段为两段，大小为470bp和653bp；东方次睾吸虫囊蚴的核糖体序列中没有Xho I酶切位点，东方次睾吸虫囊蚴经Xho I酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。

本发明的优点与效果是：

1.本发明利用XhoI限制性内切酶进行两种吸虫囊蚴的核糖体酶切鉴别，可准确区分两种形态相似的吸虫囊蚴。

2.本发明通过对不同地区、不同寄主的华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴酶切分析，表明同种之间不同个体可保持很高的稳定性。

3.本发明鉴别方法简单，效率和准确率较高；本方法鉴别快速仅需1个工作日即可；同时成本较低。

附图说明

图1  两种吸虫囊蚴分别进行ITS基因PCR反应得到约1200bp电泳图；

图2  两种吸虫囊蚴经Xho I内切酶酶切分析结果图。

具体实施方式

下面结合附图所示实施例，对本发明作进一步详述。

本发明利用吸虫囊蚴（华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴）核糖体区域基因序列的位点差异区别华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法。该方法能有效区分华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴，为区分两种囊蚴提供技术保证。根据华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴核糖体序列的基因特征，设计出一组引物能同时对华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴进行阳性扩增，根据华支睾吸虫囊蚴扩增PCR产物中有特异性的XhoI酶切位点，而东方次睾吸虫囊蚴扩增PCR产物中没有XhoI酶切位点来建立一种对华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴进行快速检测得PCR-RLFP方法。

区别华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法，包括步骤：

1提取华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴核糖体基因组DNA；

2用引物P1和P2同时对华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴进行PCR扩增，得到相应的核糖体基因片段；

3取PCR产物经XhoI酶切后进行RFLP分析。

其中，PCR需满足如下要求：

（1）该PCR产物需选择华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴核糖体序列中保守区域进行设计，便能以一个PCR反应对华支睾吸虫囊蚴DNA和东方次睾吸虫囊蚴DNA进行阳性扩增；

（2）该PCR产物需选择华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴核糖体基因组中保守区域进行设计时必须跨过华支睾吸虫囊蚴基因中的470位的XhoI酶切位点，以便对胶回收产物能够进行限制性片段长度多态性分析。

根据以上要求，步骤（2）的扩增引物P1和我P2的序列为：

上游引物P1：5’-GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA -3’； 

下游引物P2：5’-TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT -3’；

其中，步骤2的PCR扩增产物经胶回收小大约为1200bp。

其中，步骤3的XhoI酶切位点位于华支睾吸虫囊蚴核糖体基因组序列的470位，东方次睾吸虫囊蚴核糖体基因组序列中没有XhoI酶切位点，东方次睾吸虫囊蚴经XhoI酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。

实施例1：

图1  两种吸虫囊蚴分别进行ITS基因PCR反应得到约1200bp电泳图；

其中：左1、2、3为肇东东方次睾吸虫囊蚴（麦穗），左4、5、6为肇东东方次睾吸虫囊蚴（柳根）；右1、2、3为肇东华支睾吸虫囊蚴（麦穗），右4、5、6为肇东华支睾吸虫囊蚴（柳根）。

图2  两种吸虫囊蚴经XhoI内切酶酶切分析结果图；

其中：左1、2、3为肇东东方次睾吸虫囊蚴（麦穗），左4、5、6为肇东东方次睾吸虫囊蚴（柳根）；右1、2、3为肇东华支睾吸虫囊蚴（麦穗），右4、5、6为肇东华支睾吸虫囊蚴（柳根）。

样本来源：华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴均采自于黑龙江省肇东、齐齐哈尔等地淡水鱼体内。均由黑龙江八一农垦大学动物科技学院寄生虫实验室分离鉴别和保存。

引物设计与合成：

根据华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴的核糖体的ITS序列设计引物P1和P2，其中引物P1和P2序列为：上游引物：5’-GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA -3’，下游引物5’-TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT -3’。

PCR扩增：

以常规方法提取华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴核糖体基因组DNA。用所设计的引物P1和P2进行PCR扩增，扩增片段大小约为1200bp。扩增体系为25uL，其中10×Ex Taq buffer 2.5μL，dNTP Mixture（2.5mmol each）2μL，上、下游引物（25mM）各0.5μL，模板DNA 1μL，Ex Taq（5U/μL）0.2μL，加水至25μL。94℃预变性 5min，94℃变性 1min，55℃退火 1min ，72℃延伸 1.5min，共35个循环，72℃延伸 10min，4℃保存。

RFLP分析：

PCR反应结束后，将华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴PCR产物分别经胶回收试剂盒纯化后进行Xho I酶切。酶切体系为20uL，其中Xho I 1μL，PCR产物15μL，Buffer Tango 2μL，补充去离子水至终提及20uL。混匀后，经37℃水浴3小时，进行琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴类型。Xho I酶切位点位于华支睾吸虫囊蚴核糖体基因组序列的470位，华支睾吸虫囊蚴可被Xho I 酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段，大小为470bp和653bp；而东方次睾吸虫囊蚴核糖体基因组序列中没有Xho I酶切位点，东方次睾吸虫囊蚴经Xho I酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。

准确性分析：

为了验证结果的准确性，选取了华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴多个不同地点的宿主进行重复试验，验证结果都一致。

临床应用：

PCR-RFLP方法结果准确、操作简便，同时对实验设备要求也较低，只需单个囊蚴提取基因组DNA，当天就可以出结果，实现对华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴快速准确的鉴别。本发明利用PCR-RFLP方法可以快速、准确地区分华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴。