地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌制剂及制备

摘要

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合益生菌制剂的制备及其制备方法，属于饲料微生物技术领域。所述益生菌剂以豆粕、麸皮、玉米粉为基质，利用地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌进行固态发酵而成。本发明的制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单，可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术；采用混菌固态发酵，利用菌株间的互利共栖协同作用，能提高产率和菌体浓度所得发酵产品的活菌数较高，有利于豆粕和玉米粉中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于肠胃的消化吸收。本发明产品在饲料中添加使用时，此类产品用于奶牛饲喂时能有效提高饲料的利用效率13-25%。

说明书

技术领域

本发明属于饲料微生物技术领域，涉及一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质，以益生菌地衣芽孢杆菌BL-09（Bacillus licheniformis BL-09）、枯草芽孢杆菌HM-66（Bacillus subtilis HM-66）和干酪乳杆菌HM-09（Lactobacillus casei HM-09）为菌种的固态发酵技术，此技术可广泛应用于动物微生态等方面。 

背景技术

目前，益生菌制品多采用益生菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余则采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，后处理比较困难，机器设备操作繁琐。因此本申请采用地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和干酪乳杆菌HM-09混合固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，采用固态发酵，其生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作。采用地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和干酪乳杆菌HM-09进行固态发酵，可生改善动物饲料的适口性。其蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，有利于动物肠胃消化吸收。 

中国发明专利200810175856.7公开了一株具有益生功效的干酪乳杆菌(LACTOBACILLUS CASEI ZHANG)的高密度发酵技术,包括增殖培养基和发酵工艺条件优化控制,和该菌株的高活力冻干菌粉的制备技术。通过本发明可以得到1011CFU/ML以上活菌数的干酪乳杆菌的冻干菌粉,能够直接应用于该菌株益生菌发酵剂和益生菌制剂的制备和应用。 

名称为一种干酪乳杆菌及其在固态发酵中的应用中国发明专利，申请号为200710118485.4，该发明公开了一种干酪乳杆菌及其在固态发酵中的应用。所述干酪乳杆菌(LACTOBACILLUS CASEI ZHANG)是从酸马奶中分离得到的耐酸和耐胆汁酸的益生菌;该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号:CGMCC NO.1697。本发明的干酪乳杆菌(LACTOBACILLUS CASEI ZHANG)能实现在固态发酵方面的应用,特别是作为发酵剂在乳制品、健康食品、微生物饲料以及动物保健制品中的应用;本发明的干酪乳杆菌菌体存活率提高的方法,是一种优化固态培养基的方法,能得到较高的菌体密度和菌体存活率;本发明的干酪乳杆菌固态发酵活菌数是液体MRS发酵活菌数的二十倍以上。 

名称为用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的发明专利，申请号为01310321977.9，该发明公开用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌HM-66、干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9均为益生菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCCNo.6733、CGMCCNo.6735、CGMCCNo.6744和CGMCCNo.5470，枯草芽孢杆菌HM-66、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20的保藏日期为2012年10月29日，动物双歧杆菌V9的保藏日期为2011年11月18日。本发明还公开了其应用方法。 

用于饲料添加剂益生菌固体发酵的动物双歧杆菌和枯草芽孢杆菌的中国发明专利，申请号为201310321979.8，发明涉及一种可生产出具有特殊酸香味的发酵型豆粕、且含高活菌数以及高蛋白质降解率的可用于食品和饲料添加剂领域的益生菌固体发酵。用于固体发酵的枯草芽孢杆菌HM-66和动物双歧杆菌V9均为益生菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCCNo.6733和CGMCCNo.5470。 

用于饲料添加剂领域的益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌审中的中国发明专利，申请号为201310322177.9，公开了一种污染小、易操作、有利于肠胃消化吸收的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20均为益生菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCCNo.6733和CGMCCNo.6744。 

用于饲料添加剂领域的益生菌固体发酵的干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌审中的中国发明专利，申请号为201310322953.5。公开了一种污染小、易操作、有利于肠胃消化吸收的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌HM-66)和干酪乳杆菌F-08均为益生菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCCNo.6733和CGMCCNo.6735。 

名称为一种有效预防及改善牛乳房炎的复合乳酸菌微生态制剂中国专利，申请号为201310094615.0，该专利公开一种预防及改善牛乳房炎的复合微生态制剂，复合微生态制剂中干酪乳杆菌HM-09(L.casei HM-09)质量份数为10%，植物乳杆菌HM-10（L.plantarum HM-10）质量份数为10%，其余80%为沸石粉，同时复合微生态制剂中L.casei HM-09活菌数量≥2.5×108cfu/g，L.plantarum HM-10活菌数量≥2.5× 108cfu/g；所述干酪乳杆菌和植物乳杆菌已于2012年10月29日在地址为北京市大屯路，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，干酪乳杆菌HM-09(L.casei HM-09)保藏号：CGMCC No.6736；植物乳杆菌HM-10（L.plantarum HM-10）保藏号：CGMCC No.6741。 

发明内容

本发明目的在于采用地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和干酪乳杆菌HM-09进行固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，提供一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术，此方法发酵产品的活菌数高，豆粕蛋白质的降解率高。此制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。 

本发明是通过下述技术方案实现的。 

一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术，包括地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和干酪乳杆菌HM-09的培养及其固态发酵培养，得到益生菌的固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉产品。 

所述地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和干酪乳杆菌HM-09种子培养基为：蛋白胨1-2%，葡萄糖2-4%，加水至100%，pH7.0-7.2。 

所述的地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66种子培养条件，放置于摇床上，转速为150-180r/min，温度为30-37℃，培养20-24h；干酪乳杆菌HM-09种子培养条件，30-37℃静置培养20-24h。 

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆菌HM-66种子液，接种量各为2-8%(v/w)，控制发酵温度30-38℃,湿度40-65%，混菌培养12-18h；再添加干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为1-8%(v/w)，其他条件不变，再发酵12-36h。发酵结束后干燥获得。 

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的组成和质量比例比例为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1。水份含量控制在40-75%。 

地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和干酪乳杆菌HM-09混菌发酵，在发酵结束后，游离氨基态氮含量达到1109.1umol/g，较发酵前提高约11倍，地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆菌HM-66芽孢率较单独发酵分别提高2.1倍和1.5倍。 

枯草芽孢杆菌HM-66和干酪乳杆菌HM-09于2012年10月29日保藏，保藏号分别为CGMCC No.6733和CGMCC No.6736。菌保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心。 

地衣芽孢杆菌BL-09分类名称分别为(Bacillus licheniformis)BL-09、地衣芽孢杆菌BL-09于2011年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101；保藏号为CGMCC No.5686。 

地衣芽孢杆菌BL-09分离自内蒙古自治区呼和浩特市地区健康牛肠道样品中芽孢杆菌，属于兼性厌氧的、革兰氏阳性芽孢杆菌；菌体呈棒杆状，偶尔见长杆状，芽孢中生，呈椭圆形；最适生长温度为37±1℃，最适生长pH为7.0-7.4，固态发酵烘干产物常温储存6个月，芽孢损失率低于5%；营养琼脂平板培养12h左右，菌落不规则、边缘不光滑，菌落中央具有明显的凸起峰，培养至24-36h，菌落褶皱明显且褶皱内物质呈液体状，接种环挑取具有拉丝情况，镜检芽孢基本脱落，经过伯杰氏细菌手册（第9版）生理生化试验及细菌、菌落形态确定为地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌BL-09。体外实验证实，该菌株具有良好的耐高温、耐酸、耐胆盐等生化特性地衣芽孢杆菌BL-09还具有高产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶类及氨基酸、维生素、抗菌物质等多种生理活性物质，发酵后的固态培养基粘度很大，拉丝严重，培养器皿底部可见少量液体物质，证明其固态发酵中的保湿能力相对较强。 

耐酸试验： 

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，180r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于pH分别为2.0、3.0及4.0的缓冲溶液中，37℃培养1～3h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐酸性。 

耐热试验： 

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，180r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，获得的菌体用适量无菌生理盐水稀释后于80℃水浴加热处理10min以获得芽孢，再分别于80℃、90℃和100℃下分别处理5～30min，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢 杆菌BL-09具有良好的耐热性。 

耐胆盐试验： 

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，180r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于含胆盐浓度分别为0.03%、0.10%、0.30%的生理盐水中，37℃培养1～6h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐淡盐性。 

有益效果： 

本发明中采用地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和干酪乳杆菌HM-09混合分阶段进行固态发酵豆粕。本发明采用固态发酵生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作；采用干酪乳杆菌HM-09进行混合发酵，可以产生乳酸及乙酸等酸味小分子物质，这些小分子物质赋予产品特有的酸香味、色泽和口感等感官特征的改善和多样化，发酵产品提高动物适口性；在混菌固态发酵中，菌株间的互利共栖协同作用，能提高产率和菌体浓度；多菌株的产酶、产酸和产营养物质能力、对基质的分解能力等要显著优于单菌发酵；混菌固态发酵还具有获得纯种发酵无法获得的产物，生长速度快，对底物利用率高，可多级转化，发酵后的微生物群体稳定，省工节能，简化工艺及发酵设备和易控制等诸多优点，且不易染菌；采用地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66发酵豆粕、麸皮和玉米粉，可以使豆粕和玉米粉中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于肠胃的消化吸收。 

在作用机理方面，枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的芽孢能够在进入宿主肠道后能够迅速萌发、繁殖，消耗肠内氧气，抑制有害需要菌的生长，而保护、促进益生菌的 生长，以维护肠道微生态平衡。干酪乳杆菌能定殖于宿主肠道中并能利用乳糖产生乳酸，有效的缓解亚洲人的乳糖不耐受症状。产生的乳酸能调节肠道pH，杀死不耐酸性病原菌，且产生的过氧化氢、细菌素等，对其他病原或腐败微生物具有显著的抑制作用，而对益生菌无影响，从而维持肠道菌群平衡；能够诱导免疫球蛋白A的分泌，提高宿主的免疫功能，可通过对白介素的调节而缓解结肠炎的症状；干酪乳杆菌发酵乳产生的寡肽和小肽对血管紧张素具有抑制作用，进而起到降血压作用；经常服用干酪乳杆菌活菌制剂，能降低血液中的胆固醇。本发明获得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和干酪乳杆菌复合益生菌制剂兼具有以上功能，具有良好的应用发展前景。使本发明产品中在饲料中添加使用时，此类产品用于奶牛饲喂时能有效提高饲料的利用效率13-25%。本发明产品在饲料中的添加量为20-50克/kg。 

本发明产品使用后奶牛的受胎率提高了12%以上，经计算能提高奶牛的年产奶量210公斤以上。 

具体实施方式

下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。 

1.菌体的种子液制备 

地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和干酪乳杆菌HM-09从冻藏的甘油管中接到装有液体种子的培养基中，地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66种子培养条件，放置于摇床上，转速为150r/min，温度为37℃，培养24h；干酪乳杆菌HM-09种子培养条件，37℃静置培养24h。 

其中液体种子培养基（g/L）为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2。 

2.固态发酵 

固态发酵培养基上首先接种地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆菌HM-66种子液，接种量各为5%(v/w)，控制发酵温度35℃,湿度55%，混菌培养12h；再添加干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为4%(v/w)，其他条件不变，再发酵24h。发酵结束经流化床干燥方法获得干燥的培养物。 

固态发酵培养基为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:8:0.5。水分含量40%，115℃高压灭菌25min。 

3.测定活菌数 

一般采用平板计数法，操作步骤为：称取制备好的豆粕发酵制品10g，置于90ml 的无菌生理盐水中，放置到摇床上震荡30min，摇匀后用移液枪取1ml的菌液加进另一个9ml的无菌生理盐水中，进行稀释，按照国标方法，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适的稀释度1ml打进平板，倒入培养基混匀，依次做三个平行，置于培养箱中在37℃静置培养48h。 

4.pH值的测定 

称取10g发酵后的产品，放入三角瓶中，加入90ml的蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌30min，静置10min后用精密pH计测定其pH值。 

5.氨基态氮含量的测定方法 

取10g发酵后的产品，用匀浆器破碎，之后与90ml的蒸馏水混合，在4℃冰箱放置1天。样品离心7000r/min，离心15min。上清液0.8ml置于试管中，然后加3.2ml蒸馏水、2.0ml显色剂，混匀，放入沸水浴中加热15min，同时作空白对照。然后冷水冷却，加入5.0ml40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯，以空白管调零于570nm处测定A值。 

以下是对以豆粕为基质的益生菌发酵产品的生产方法的一些参数的确定，以及一些培养条件的优化。 

实施例1： 

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆菌HM-66种子液，接种量各为3%(v/w)，控制发酵温度35℃,湿度60%，混菌培养12h；再添加干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为5%(v/w)，其他条件不变，再发酵12h，共计发酵总时间为24h。发酵结束经流化床干燥方法获得干燥的培养物。 

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的组成和质量比例比例为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%。 

测得干酪乳杆菌HM-66活菌数为4.05×10⁹cfu/g，HM-09枯草芽孢杆菌HM-66活菌数为1.05×10¹⁰cfu/g，地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.29×10¹⁰cfu/g，发酵结束后，游离氨基态氮含量达到1038.7umol/g。 

实施例2: 

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆菌HM-66种子液，接种量各为3%(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度40%，混菌培养15h；再添加干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为5%(v/w)，其他条件不变，再发酵16h，发酵结束经流化床干燥方法获得干燥的培养物。 

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的组成和 质量比例比例为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:8:1，水份含量控制在70%。 

测得干酪乳杆菌HM-09活菌数为4.09×10⁹cfu/g，枯草芽孢杆菌HM-66活菌数为0.95×10¹⁰cfu/g，地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.18×10¹⁰cfu/g，发酵结束后，游离氨基态氮含量达到1019.9umol/g。 

实施例3: 

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆菌HM-66种子液，接种量各为5%(v/w)，控制发酵温度30℃,湿度65%，混菌培养18h；再添加干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为5%(v/w)，其他条件不变，再发酵18h，发酵结束经流化床干燥方法获得干燥的培养物。 

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的组成和质量比例比例为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:9:0.8，水份含量控制在70%。 

测得干酪乳杆菌HM-09活菌数为4.10×10⁹cfu/g，枯草芽孢杆菌HM-66活菌数为0.81×¹⁰10cfu/g，地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.05×¹⁰10cfu/g，，发酵结束后，游离氨基态氮含量达到1074.5umol/g。 

实施例4 

当地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和干酪乳杆菌HM-09接种量分别为3.0％(v/w)、3.0％(v/w)和1.0％(v/w)，且先利用地衣芽孢杆菌BL-09与枯草芽孢杆菌HM-66混菌发酵12h后，再与干酪乳杆菌HM-09混菌发酵36h，培养温度37±1℃，共计培养时间48h，其活菌数较高，测得干酪乳杆菌HM-09活菌数为4.55×10⁹cfu/g，枯草芽孢杆菌HM-66活菌数为1.35×10¹⁰cfu/g，地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.55×10¹⁰cfu/g，且此时游离氨基态氮的含量最高，达到1109.1umol/g。