地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌制剂及制备

摘要

本发明属于饲料微生物技术领域，涉及一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质，以益生菌地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-10混合分阶段进行固态发酵制备的益生菌制剂。本发明采用混菌固态发酵，能提高产率和菌体浓度；多菌株的产酶、产酸和产营养物质能力、对基质的分解能力等要显著优于单菌发酵；可获得纯种发酵无法获得的产物，生长速度快，对底物利用率高，可多级转化，发酵后的微生物群体稳定，省工节能，简化工艺及发酵设备和易控制等诸多优点，且不易染菌；采用上述三种菌株发酵豆粕、麸皮和玉米粉，可以使豆粕和玉米粉中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于肠胃的消化吸收。

说明书

技术领域

本发明属于饲料微生物技术领域，涉及一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质，以益生菌地衣 芽孢杆菌BL-09（Bacillus licheniformis BL-09）、枯草芽孢杆菌HM-66（Bacillus subtilis  HM-66）和植物乳杆菌HM-10（Lactobacillus plantarum HM-10）固态发酵制备的益生菌制剂 及其制备方法，可广泛应用于动物微生态等方面。

背景技术

目前，益生菌制品多采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者 胶囊。采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，后处理比较困难，机器设备操作 繁琐。如何获得适合固态发酵的菌株，制备活菌数量高且活力良好的益生菌制剂将成为本行 业发展的方向。本申请采用地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-10混合 固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，采用固态发酵，其生产成本低，投资的资金较少，在下游处 理方便，污染小，设备结构简单、易操作。采用地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和 植物乳杆菌HM-10进行固态发酵，可生改善动物饲料的适口性。其蛋白质被分解成小肽和游离 氨基酸，有利于动物肠胃消化吸收。

公开号为103421713A的中国发明专利《用于饲料添加剂领域的益生菌固体发酵的植物乳 杆菌和枯草芽孢杆菌》公开了一种枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20固体发酵制备用于 饲料添加剂领域的益生菌，并公开了其应用方法。枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20混 菌发酵时，枯草芽孢杆菌最适接种量为1%，植物乳杆菌HM-20最适接种量为4%，进行混合固态 发酵豆粕，可赋予产品特有的酸香味，改善产品的色泽和口感等感官特征，还可以使豆粕中 的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于肠胃的消化吸收。所述菌种保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCC No.6733和CGMCC No.6744。 保藏日期为：2012年10月29日。

公开号为103421711A的中国发明专利《用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动 物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌》公开了枯草芽孢杆菌HM-66、干酪乳杆菌F-08、植 物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9，用于饲料添加剂益生菌固体发酵，并公开了其应用方法。 上述菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为 CGMCCNo.6733、CGMCC No.6735、CGMCC No.6744和CGMCCNo.5470。

公开号为103202391A的中国发明专利《一种有效预防及改善牛乳房炎的复合乳酸菌微生态 制剂》公开了一种复合微生态制剂，其中干酪乳杆菌HM-09质量份数为10%，植物乳杆菌HM-10 质量份数为10%，其余80%为沸石粉，同时复合微生态制剂中HM-09活菌数量≥2.5×10⁸cfu/g， HM-10活菌数量≥2.5×10⁸cfu/g；所述干酪乳杆菌和植物乳杆菌已于2012年10月29日在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，干酪乳杆菌HM-09保藏号：CGMCC No.6736； 植物乳杆菌HM-10保藏号：CGMCC No.6741。该发明对乳房炎牛具有很好的预防与改善作用， 可将乳房炎发病率降低84.7%，发病率明显下降，提高奶牛健康水平。

发明内容

本发明目的在于采用地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-10进行固 态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，提供一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领 域的益生菌制剂，并提供该益生菌制剂的制备方法，该方法制备的益生菌制剂的活菌数高， 营养物质降解率高，生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。

本发明是通过下述技术方案实现的。

一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的益生菌制剂，所述益生菌 制剂的制备方法为固态发酵，步骤包括地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆 菌HM-10的培养及其固态发酵培养。所述地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆 菌HM-10种子培养基质量百分比组成为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2。

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为： 豆粕、麸皮、玉米粉=10:9-10:0.5-1，水份含量控制在60-70%。

所述的地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66种子培养条件，放置于摇床上，转速为 150r/min，温度为37℃，培养24h；植物乳杆菌HM-10种子培养条件，37℃静置培养24h。

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆 菌HM-66种子液，接种量相同，各为3.0-5.0%（v/w），控制发酵温度30-37℃,湿度70-80%， 混菌培养12-24h，再添加植物乳杆菌HM-10种子液，接种量为1.0-3.0%（v/w），其他条件不 变，再发酵12-24h，共计发酵总时间为24-48h。添加植物乳杆菌HM-10后，混合发酵初期， pH呈下降趋势，pH最小值为5.0-6.0，在发酵的后期，pH呈上升趋势，发酵48h后，其pH为 6.5-7.5。

当先利用地衣芽孢杆菌BL-09与枯草芽孢杆菌HM-66混菌发酵12h后，再与植物乳杆菌 HM-10混菌发酵36h，共发酵48h后，游离氨基态氮含量可达到1136.5umol/g，较发酵前提高 约12倍，地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆菌HM-66芽孢率较单独发酵分别提高2.4倍和1.8倍。

所述益生菌制剂的制备方法为：发酵结束后经流化床干燥获得干燥的培养物。

本发明产品添加于饲料中，用于动物饲喂时，能有效提高饲料的利用效率12-30%。用于 奶牛饲喂时，奶牛的受胎率提高了12%，经计算能提高奶牛的年产奶量200-300公斤以上。本 发明产品在饲料中的添加量为20-100克/吨。

地衣芽孢杆菌BL-09于2011年12月31日保藏，保藏编号为CGMCC No.5686，保藏地址：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心。枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-10于2012年10月29日保 藏，保藏编号分别为CGMCC No.6733和CGMCC No.6741。保藏地址：北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

地衣芽孢杆菌BL-09分类名称为Bacillus licheniformis BL-09，分离自内蒙古自治区 呼和浩特市地区健康牛肠道样品中芽孢杆菌，属于兼性厌氧的、革兰氏阳性芽孢杆菌；菌体 呈棒杆状，偶尔见长杆状，芽孢中生，呈椭圆形；最适生长温度为37±1℃，最适生长pH 为7.0-7.4，固态发酵烘干产物常温储存6个月，芽孢损失率低于5%；营养琼脂平板培养12 h左右，菌落不规则、边缘不光滑，菌落中央具有明显的凸起峰，培养至24-36h，菌落褶皱 明显且褶皱内物质呈液体状，接种环挑取具有拉丝情况，镜检芽孢基本脱落，经过伯杰氏细 菌手册（第9版）生理生化试验及细菌、菌落形态确定为地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆 菌BL-09。体外实验证实，该菌株具有良好的耐高温、耐酸、耐胆盐等生化特性地衣芽孢杆 菌BL-09还具有高产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶类及氨基酸、维生素、抗菌物质等多 种生理活性物质，发酵后的固态培养基粘度很大，拉丝严重，培养器皿底部可见少量液体物 质，证明其固态发酵中的保湿能力相对较强。

耐酸试验：

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，150r/min培养24h，于4℃、4000r/min 离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于pH分别为2.0、3.0及 4.0的缓冲溶液中，37℃培养1-3h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有 良好的耐酸性。

耐热试验：

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，150r/min培养24h，于4℃、4000r/min 离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，获得的菌体用适量无菌生理盐 水稀释后于80℃水浴加热处理10min以获得芽孢，再分别于80℃、90℃和100℃下分 别处理5-30min，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐热性。

耐胆盐试验：

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，180r/min培养24h，于4℃、4000r/min 离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于含胆盐浓度分别为0.03%、 0.10%、0.30%的生理盐水中，37℃培养1-6h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌 BL-09具有良好的耐胆盐性。

有益效果

本发明中采用地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-10混合分阶段进 行固态发酵豆粕。本发明采用固态发酵生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污 染小，设备结构简单、易操作；采用植物乳杆菌HM-10进行混合发酵，可以产生乳酸及乙酸等 酸味小分子物质，这些小分子物质赋予产品特有的酸香味、色泽和口感等感官特征的改善和 多样化，发酵产品提高动物适口性；在混菌固态发酵中，菌株间的互利共栖协同作用，能提 高产率和菌体浓度；多菌株的产酶、产酸和产营养物质能力、对基质的分解能力等要显著优 于单菌发酵；混菌固态发酵还具有获得纯种发酵无法获得的产物，生长速度快，对底物利用 率高，可多级转化，发酵后的微生物群体稳定，省工节能，简化工艺及发酵设备和易控制等 诸多优点，且不易染菌；采用地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66发酵豆粕、麸皮和玉 米粉，可以使豆粕和玉米粉中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于肠胃的消化吸收。

在作用机理方面，枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的芽孢能够在宿主体内芽孢进入宿主肠道 后能够迅速萌发、繁殖，消耗肠内氧气，抑制有害需要菌的生长，而保护、促进益生菌的生 长，以维护肠道微生态平衡。植物乳杆菌能定殖于宿主肠道中并能利用乳糖产生乳酸，有效 的缓解亚洲人的乳糖不耐受症状。产生的乳酸能调节肠道pH，杀死不耐酸性病原菌，且产生 的过氧化氢、细菌素等，对其他病原或腐败微生物具有显著的抑制作用，而对益生菌无影响， 从而维持肠道菌群平衡；能够诱导免疫球蛋白A的分泌，提高宿主的免疫功能，可通过对白介 素的调节而缓解结肠炎的症状；植物乳杆菌发酵乳产生的寡肽和小肽对血管紧张素具有抑制 作用，进而起到降血压作用；经常服用植物乳杆菌活菌制剂，能降低血液中的胆固醇。本专 利获得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌复合益生菌制剂兼具有以上功能，具有 良好的应用发展前景。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述 实例来限定本发明的保护范围。

地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-10，分类名称分别为Bacillus  licheniformis BL-09、Bacillus subtilis HM-66和Lactobacillus plantarum HM-10。 地衣芽孢杆菌BL-09于2011年12月31日保藏，保藏号为CGMCC No.5686；枯草芽孢杆菌HM-66 和植物乳杆菌HM-10于2012年10月29日保藏，保藏号分别为CGMCC No.6733和CGMCC No.6741。 3株菌保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心。

1.测定活菌数

一般采用平板计数法，操作步骤为：称取制备好的豆粕发酵制品10g，置于90ml的无菌生 理盐水中，放置到摇床上震荡30min，摇匀后用移液枪取1ml的菌液加进另一个9ml的无菌生理 盐水中，进行稀释，按照国标方法，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适 的稀释度1ml打进平板，倒入培养基混匀，依次做三个平行，置于培养箱中在37℃静置培养48h。

2.pH值的测定

称取10g发酵后的产品，放入三角瓶中，加入90ml的蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌30min，静 置10min后用精密pH计测定其pH值。

3.氨基态氮含量的测定方法

取10g发酵后的产品，用匀浆器破碎，之后与90ml的蒸馏水混合，在4℃冰箱放置1天。样 品离心7000r/min，离心15min。上清液0.8ml置于试管中，然后加3.2ml蒸馏水、2.0ml显色剂， 混匀，放入沸水浴中加热15min，同时作空白对照。然后冷水冷却，加入5.0ml40%乙醇溶液 混匀，放置15min后用1cm比色杯，以空白管调零于570nm处测定A值。

实施例1：

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌制备的益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养 及其固态发酵培养。

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆 菌HM-66种子液，接种量各为3.0%(v/w)，控制发酵温度35℃,湿度75%，混菌培养12h；再添 加植物乳杆菌HM-10种子液，接种量为1.0%(v/w)，其他条件不变，再发酵12h，共计发酵总 时间为24h。发酵结束经流化床干燥方法获得干燥的培养物。

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为：豆 粕、麸皮、玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%。

测得植物乳杆菌HM-10活菌数为3.00×10⁹cfu/g，枯草芽孢杆菌HM-66活菌数为1.01×10¹⁰cfu/g，地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.15×10¹⁰cfu/g，发酵结束后，游离氨基态氮含量达到 958.1umol/g。

实施例2:

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌制备的益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养 及其固态发酵培养。

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆 菌HM-66种子液，接种量各为3.0%(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度75%，混菌培养12h；再添 加植物乳杆菌HM-10种子液，接种量为1.0%(v/w)，其他条件不变，再发酵24h，发酵结束经 流化床干燥方法获得干燥的培养物。

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为：豆 粕、麸皮、玉米粉=10:9:1，水份含量控制在60%。

测得植物乳杆菌HM-10活菌数为3.16×10⁹cfu/g，枯草芽孢杆菌HM-66活菌数为1.16×10¹⁰cfu/g，地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.33×10¹⁰cfu/g，发酵结束后，游离氨基态氮含量达到 1073.1umol/g。

实施例3:

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌制备的益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养 及其固态发酵培养。

所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上首先接种地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆 菌HM-66种子液，接种量各为5.0%(v/w)，控制发酵温度30℃,湿度75%，混菌培养24h；再添 加植物乳杆菌HM-10种子液，接种量为3.0%(v/w)，其他条件不变，再发酵24h，发酵结束经 流化床干燥方法获得干燥的培养物。

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为：豆 粕、麸皮、玉米粉=10:9:0.8，水份含量控制在70%。

测得植物乳杆菌HM-10活菌数为2.85×10⁹cfu/g，枯草芽孢杆菌HM-66活菌数为1.06×10¹⁰ cfu/g，地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.10×10¹⁰cfu/g，发酵结束后，游离氨基态氮含量达到 1006.0umol/g。

实施例4

当地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-10接种量分别为3.0%(v/w)、 3.0%(v/w)和1.0%(v/w)，固态发酵培养基上首先接种地衣芽孢杆菌BL-09和枯草芽孢杆菌 HM-66种子液，先利用地衣芽孢杆菌BL-09与枯草芽孢杆菌HM-66混菌发酵12h后，再与植物乳 杆菌HM-10混菌发酵36h，培养温度37±1℃，湿度75%，共计培养时间48h，发酵结束经流化 床干燥方法获得干燥的培养物,其活菌数较高，测得植物乳杆菌HM-10活菌数为3.45×10⁹cfu/g，枯草芽孢杆菌HM-66活菌数为1.43×10¹⁰cfu/g，地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.65× 10¹⁰cfu/g，且此时游离氨基态氮的含量最高，达到1136.5umol/g。

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为：豆 粕、麸皮、玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%。