狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活疫苗的方法

摘要

本发明公开了狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活疫苗的方法。狂犬病活疫苗包含：狂犬病ERAg3m病毒。狂犬病毒ERAg3m毒株是通过反向遗传学方法将狂犬病毒ERA株进行改造获得的，安全性高，由此含有该狂犬病ERAg3m病毒可以进一步提高狂犬病活疫苗的免疫效力。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活 疫苗的方法。

背景技术

狂犬病（Rabies）又叫疯狗病或恐水症，是由狂犬病病毒（Rabies virus）引起的人兽共 患急性传染病。狂犬病主要影响中枢神经系统，人一旦发病，目前尚没有有效的临床治疗 方法，是迄今人类唯一病死率高达100%的急性传染病。全世界每年约有55000人死于狂犬 病，我国自2003年后每年狂犬病死亡人数均超过2000人，虽然我国每年投入防控狂犬病 的费用超过100亿，投入费用位居世界第一，防治效果却是全球倒数第二，仅次于印度。 狂犬病毒的传播已经严重影响到我国的公共卫生安全，已成为一个非常突出的社会问题。

我国现有的狂犬病疫苗为采用Flury株在BHK21细胞上转瓶生产的弱毒活疫苗以及灭 活疫苗。Flury弱毒活疫苗因为存在可能的毒力返强以及脑内感染致死性，现已基本停止生 产。灭活疫苗主要是采用转瓶或微载体生产病毒抗原，然后浓缩、纯化，加入佐剂制成， 由于生产病毒的滴度低，达到免疫效力要求需要浓缩的倍数高，如转瓶培养需要浓缩30-50 倍；同时，由于细胞和病毒培养时加入2～10%的牛血清，导致下游纯化难度加大，所制备 的灭活疫苗生产成本高，现有疫苗的销售价格都在20元/头份以上，导致各级政府采购成 本居高不下，难以大规模推广。国外现有的针对犬猫的狂犬病疫苗为采用肌肉注射的灭活 疫苗，质量较好，但价格昂贵。而采用口服疫苗，优势明显：一是改变传统疫苗制剂方式， 采用口服，更易于扩大免疫覆盖范围，实现大范围对宠物犬和猫的免疫；二是可避免某些 宠物，特别是大型犬和烈性犬注射免疫时可能对人造成的伤害；三是成本低，易于推广； 四是采用缓释技术，免疫保护期较常规疫苗更长。

我国犬猫的饲养数目庞大，据估计可能超过2亿只，这其中包括大量的流浪犬和农村 犬。采用肌肉注射免疫需要将犬保定，对于大型犬和烈性犬，特别容易伤害到进行免疫注 射的医务人员，加上流浪犬难以捕捉，因此采用肌肉注射某些时候难以进行。而口服疫苗 却能很好地解决这一问题，对于大型犬、烈性犬和流浪犬只需将疫苗投撒在饲料中进行饲 喂就可以起到免疫预防的作用，易于推广。

国外成功消灭狂犬病的经验是推行野生动物口服狂犬病疫苗，原因在于大多数的欧美 国家狂犬病毒的传播主要是通过野生动物如狐狸、浣熊等自然宿主传播，而我国狂犬病毒 的主要传播途径却是通过宠物犬的咬伤、舔舐以及人与宠物犬的亲密接触如亲吻等，因此 我国防控狂犬病的首要措施就是切断宠物犬对人狂犬病毒的传播，对犬实现70%以上的免 疫，包括流浪犬以及农村犬。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于 提出一种狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活疫苗的方法，该疫苗可有效用于野生动物，如 流浪犬等动物的免疫预防。

本发明是基于发明人的下列研究而完成的：发明人首先利用反向遗传学方法将狂犬病 毒ERA株进行改造，获得了一株安全性极高的基因工程毒株，利用该毒株结合微球技术和 诱饵技术研制出一种口服疫苗，该疫苗可用于野生动物，如流浪犬等动物的免疫预防。根 据本发明实施例，狂犬病毒ERAg3m毒株是通过反向遗传学方法得到，可用作口服活疫苗 生产用毒株，安全性高，免疫效力好。

为此在本发明的一个方面，本发明提出了一种狂犬病活疫苗，包含：狂犬病ERAg3m 病毒。由此可以进一步提高狂犬病活疫苗的免疫原性。

根据本发明的实施例，所述狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m病毒的浓度为1× 10^9.0TCID₅₀/ml。由此可以进一步提高狂犬病活疫苗的免疫原性。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备狂犬病口服活疫苗的方法，该方法包括 如下步骤：

1）利用BHK21细胞对狂犬病ERAg3m病毒进行全悬浮培养，以便获得狂犬病ERAg3m 病毒溶液；

2）将所述狂犬病ERAg3m病毒溶液与壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液进行混合，以便 制备得到壳聚糖纳米微球；以及

3）将所述壳聚糖纳米微球进行诱饵包裹，以便制备得到所述狂犬病口服活疫苗。

由此可以有效制备得到狂犬病口服活疫苗，该狂犬病口服活疫苗食用方便，免疫原性 强，将狂犬病口服活疫苗制备成微球的形式可以有效保持狂犬病ERAg3m病毒的免疫原性， 以便进一步提高狂犬病口服活疫苗免疫性。

另外，根据本发明上述实施例的制备狂犬病口服活疫苗的方法还可以具有如下附加的 技术特征：

根据本发明的实施例，在步骤2）中，将所述狂犬病ERAg3m病毒溶液加入到壳聚糖 醋酸溶液中；再将壳聚糖和狂犬病ERAg3m病毒混合溶液加入到三聚磷酸钠水溶液中，混 合均匀并离心处理，以便获得含有疫苗抗原的纳米微球。由此可以进一步提高制备壳聚糖 纳米微球效果。

根据本发明的实施例，所述全悬浮培养是在37摄氏度的温度下培养36小时而完成的。 由此可以进一步提高狂犬病ERAg3m病毒繁殖效率，以便进一步提高制备狂犬病口服活疫 苗的效率。

根据本发明的实施例，所述狂犬病ERAg3m病毒溶液的浓度高于1×10^8.0TCID₅₀/ml。 由此可以进一步提高狂犬病口服活疫苗的免疫原性。

根据本发明的实施例，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为0.1%-10%w/v，所述壳聚糖 溶液的溶剂是浓度为1%的醋酸；所述三聚磷酸钠溶液的浓度为0.1%-5%w/v，由此可以进 一步提高制备壳聚糖纳米微球的效率和质量。

根据本发明的实施例，所述离心处理是在4摄氏度、15000～18000rpm的条件下离心30 分钟而完成的。由此可以进一步提高制备壳聚糖纳米微球的效率和质量。

根据本发明的实施例，将所述壳聚糖纳米微球进行诱饵包裹之前，进一步包括：向所 述壳聚糖纳米微球中加入MEM溶液，以便使得所述壳聚糖纳米微球中所述狂犬病ERAg3m 病毒的浓度为1×10^9.0TCID₅₀/ml。由此可以进一步提高壳聚糖纳米微球中的狂犬病ERAg3m 病毒的浓度，以便进一步提高狂犬病口服活疫苗的免疫原性。

根据本发明的实施例，所述诱饵包裹进一步包括：将所述壳聚糖纳米微球加入到融化 的蜡中进行第一诱饵包裹并晾干，以便得到第一壳聚糖纳米微球包裹物；将所述封蜡的壳 聚糖纳米微球加入到猪油与蜡的混合液体中进行第二诱饵包裹并晾干，以便得到第二壳聚 糖纳米微球包裹物；以及将所述第二壳聚糖纳米微球包裹物加入到猪肉聚合物中进行混匀 并定型，以便制备得到所述狂犬病口服活疫苗。由此可以进一步提高狂犬病口服活疫苗的 易食性和使用率。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和 容易理解，其中：

图1是根据本发明的另一个实施例的制备狂犬病口服疫苗的方法中制备狂犬病 ERAg3m病毒的克隆方法示意图。

图2是根据本发明的一个实施例制备狂犬病口服活疫苗的方法的流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种狂犬病活疫苗，根据本发明的实施例，该 狂犬活疫苗包含：狂犬病ERAg3m病毒。根据本发明的具体实施例，狂犬病毒ERAg3m毒 株是通过反向遗传学方法将狂犬病毒ERA株进行改造获得的，安全性高，由此含有该狂犬 病ERAg3m病毒可以进一步提高狂犬病活疫苗的免疫效力。

根据本发明的具体实施例，上述狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m病毒的含量并不受特 别限制，根据本发明的具体示例，狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m病毒的浓度可以为1× 10^9.0TCID₅₀/ml。由此可以进一步提高狂犬病活疫苗的免疫效力。

根据本发明的具体实施例，上述狂犬病活疫苗表达编码狂犬病ERAg3m病毒的糖蛋白， 并且狂犬病ERAg3m病毒糖蛋白具有下列突变：信号肽第2位的氨基酸缺失；信号肽的第 3位的氨基酸缺失；第333位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸；缺失psi假基因区；所述糖蛋 白的G基因插入M基因之前。

根据本发明的具体实施例，上述狂犬病ERAg3m病毒突变糖蛋白具有SEQ ID NO：1 所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：1氨基酸序列为：

MQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCP

NNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFK RKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKESLVIISPSVAD LDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKR ASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPDQ L

VNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAY TIFNKTLMEADAHYKSVETWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLI PEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPDVHNQVSGVD LGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGK IISSWESHKSGGETRL。

根据本发明的具体实施例，上述突变株的基因组中包含SEQ ID NO：2所示核苷酸序 列。SEQ ID NO：2核苷酸序列为：

根据本发明的具体实施例，制备前面所述狂犬病活疫苗中包含的狂犬病ERAg3m病毒 的方法，包括：

（1）利用表达载体对宿主细胞进行转染；

（2）对步骤（1）中所得到的经过转染的宿主细胞进行培养；

（3）对步骤（2）中所得到的培养物进行过滤，以便获得狂犬病ERAg3m病毒。

根据本发明的具体实施例，制备狂犬病ERAg3m病毒的方法具体包括下列步骤：首先 利用表达载体对宿主细胞进行转染。根据本发明的具体示例，其中，表达载体携带第一核 酸分子，第一核酸分子编码突变糖蛋白，并且突变糖蛋白具有下列突变：信号肽第2位的 氨基酸缺失；信号肽的第3位的氨基酸缺失；第333位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸；缺 失psi假基因区；糖蛋白的G基因插入M基因之前。

根据本发明的具体实施例，第一核酸分子编码的突变糖蛋白具有前面SEQ ID NO：1 所示的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，第一核酸分子具有前面SEQ ID NO：2所 示的核苷酸序列。

根据本发明的另一个实施例，第一核酸分子的5’端连接有编码锤头状核酶的核酸分子， 第一核酸分子的3’端连接有编码丁型肝炎核酶的核酸分子。由此可以促进全长病毒RNA的 恢复。

在本发明的一些实施例中，在利用表达载体对宿主细胞进行转染中，可以将表达载体 与辅助载体对宿主细胞进行共转染。根据本发明的具体实施例，辅助载体可以包括:第一载 体，第二载体，第三载体以及第四载体。其中，第一载体携带N基因序列；第二载体携带 P基因序列；第三载体携带L基因序列；以及第四载体携带编码T7RNA聚合酶的核酸分子。

在本发明的一些实施例中，表达载体和第一至第四载体均为pBlue质粒。

在本发明的一些实施例中，用于转染的宿主细胞可以为BHK-21细胞。

在本发明的一些实施例中，用于制备狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株的方法可以具体 包括：将BHK-21细胞于10%的新生牛血清的MEM完全培养基中培养至6孔板90%汇合 度时；用4ug/孔的表达载体和第一载体、第二载体、第三载体以及第四载体脂质体2000法 对所述BHK-21细胞进行共转染；将经过所述共转染后的BHK-21细胞置于5%的CO₂培养 箱中并于37℃的温度下培养4-6小时后弃掉上清液；补加5%的所述新生牛血清的MEM完 全培养基，并置于5%的CO₂培养箱中于37℃的温度下培养72小时，将细胞冻融3次，离 心收集上清液并采用0.22um的滤膜进行过滤，以便获得所述狂犬病病毒ERA减毒疫苗突 变株。根据本发明的具体实施例，上述表达载体为pBlueERA；第一载体为pBlueN(2ug/孔)， 第二载体为pBlue P(1ug/孔)，第三载体为pBlueL(1ug/孔)，第四载体为pT7(2ug/孔)。

根据本发明的具体实施例，狂犬病ERAg3m病毒从ATCC获得。ERAg3m感染BHK-21 细胞，在补充5%新生牛血清的MEM培养基中生长。上清离心20000g，1小时。收集沉 淀用RNA病毒核酸提取试剂盒提取ERA基因组，凝胶电泳检测基因组完整性。反转录试 剂盒生成ERAg3m基因组cDNA。根据Genebank中ERAg3m序列，设计引物，将全长序 列分4段合成。

1F：GTCACTGGTAACTGGTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACGCTTAACAACCAGATCAAAG （KpnⅠ/Ham）（SEQ ID NO：3）

1R：CTGCAGGTTTTTTTCATG（PstⅠ）（SEQ ID NO：4）

2F：CCCGGGAGGCAACACC（SamⅠ）（SEQ ID NO：5）

2R：ACTAGTTAATAGTTTTTTTCAC（SpeⅠ）（SEQ ID NO：6）

3F：CTGCAGAACATCCCTCAAAAGACTCAAGGAAAGATGCAGGCTCTC（PstⅠ） （SEQ ID NO：7）

3R：CCCGGGGTTTTTTTTCAAAAAGAACCCCCC（SamⅠ）（SEQ ID NO：8）

4F：ACTAGTCATTAGATCAGAAG（SpeⅠ）（SEQ ID NO：9）

4R:GCGGCCGCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATG CCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACGCTTAACAAATAA ACAACA(NotⅠ/HdvRz)（SEQ ID NO：10）

G蛋白突变引物

5F：GCTCATACAAGTCGAAACTTGGAATGAGATCCT（SEQ ID NO：11）

5R：AGGATCTCATTCCAAGTTTCGACTGACTTGTAGTGAGC（SEQ ID NO：12）

利用上述引物，通过一系列PCR反应，扩增覆盖基因组的4个片段，利用片段间重叠 的酶切位点，在载体pBluescriptⅡ(+)上连接装配成突变的ERAg3mcDNA克隆，在cDNA 两端分别连接锤头状核酶（Ham）和丁型肝炎核酶（HdvRz），测序正确的质粒则为 pBlueERA。具体克隆过程见下图1。

根据本发明的具体实施例，以pBlueERAg3m为模板，设计引物，分别扩增N、P、L 基因序列，并分别克隆至pBluescriptⅡ(+)载体T7启动子下游，测序正确后，得到pBlueN， pBlue P，pBlueL。

提取大肠杆菌BL21（DE3）基因组，PCR扩增T7RNA聚合酶基因并将其克隆于 pcDNA3.1(+)质粒CMV/T7启动子下游，测序正确后，得到pT7。

根据本发明的具体实施例，上述利用反向遗传学技术以狂犬病毒cDNA为对象进行基 因突变、敲除和位置置换，恢复的突变株比现有疫苗株更安全、更有效、更廉价。

根据本发明的另一方面，本发明提出了一种制备狂犬病口服活疫苗的方法。该方法包 括：1）利用BHK21细胞对狂犬病ERAg3m病毒进行全悬浮培养，以便获得狂犬病ERAg3m 病毒溶液；2）将所述狂犬病ERAg3m病毒溶液与壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液进行混合， 以便制备得到壳聚糖纳米微球；以及3）将所述壳聚糖纳米微球进行诱饵包裹，以便制备 得到所述狂犬病口服活疫苗。

由此利用上述方法将狂犬病ERAg3m病毒制备成可以口服食用的微球的形成，以便进 一步提高狂犬病ERAg3m病毒的免疫原性。

世界卫生组织认为：对犬进行口服接种，无论是单独使用或与注射接种相结合，都提 供了一种可使犬接种率大大提高的新方法，尤其是各处游荡、无人监管的犬只。由于对犬 进行注射接种，是世界许多不同地区犬狂犬病控制中的主要难题之一，所以WHO在非洲、 拉丁美洲和亚洲的一些国家开展了犬群和犬免疫率的研究。认识到注射免疫方式在消灭犬 狂犬病方面的局限性，WHO加强了对犬口服免疫的研究，以及此种接种方式所需的更安 全有效的疫苗和诱饵的开发。本研究将病毒全悬浮培养和微球口服技术结合，显著降低了 最终口服疫苗的成本，同时又增强了免疫效果，兼具使用方便、安全、易于推广等优点， 极具市场潜力。

下面参考图2详细描述根据本发明实施例的制备狂犬病口服活疫苗的方法。

S100：制备狂犬病ERAg3m病毒溶液

在一些实施例中，利用BHK21细胞对狂犬病ERAg3m病毒进行全悬浮培养，以便获 得狂犬病ERAg3m病毒溶液。由此可以进一步提高狂犬病ERAg3m病毒的繁殖速率和存活 质量。

根据本发明的具体示例，狂犬病ERAg3m病毒的培养可以采用新生牛血清，由此可以 进一步提高培养效率，采用的新生牛血清的浓度并不受特别限制，例如可以为8%。由此可 以更好地培养该狂犬病ERAg3m病毒。根据本发明的具体实施例，病毒的培养过程中的其 他工艺参数并不受特别限制，例如培养的温度可以控制为37℃，但并不仅限于37摄氏度， 只要是病毒生长的最佳温度即可；培养时间可以为36小时，但不限于36小时，只要能够 培养得到足够数量的狂犬病ERAg3m病毒即可；培养转速可以为100r/m，但也不仅限于 100r/m，只要能有效将细胞悬浮即可。

根据本发明的具体实施例，收集采用上述方法制备得到的狂犬病ERAg3m病毒并制备 狂犬病ERAg3m病毒溶液。根据本发明的具体示例，制备的狂犬病ERAg3m病毒溶液的浓 度并不受特别限制，例如病毒液的浓度可以为1×10^8.0TCID₅₀/ml。

S200：制备壳聚糖纳米微球

在一些实施例中，将狂犬病ERAg3m病毒溶液与壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液进行混 合，以便制备得到壳聚糖纳米微球。

根据本发明的具体实施例，上述制备壳聚糖纳米微球的步骤可以进一步包括：将所述 狂犬病ERAg3m病毒溶液加入到壳聚糖醋酸溶液中；再将壳聚糖和狂犬病ERAg3m病毒混 合溶液加入到三聚磷酸钠水溶液中，混合均匀并离心处理，以便获得含有疫苗抗原的纳米 微球。由此可以制备得到包含狂犬病ERAg3m病毒的壳聚糖纳米微球，以便进一步制备得 到狂犬病口服活疫苗。由此可以有效制备得到包含狂犬病ERAg3m病毒的聚糖纳米微球。 以便进一步将狂犬病ERAg3m病毒制备成可以口服的活疫苗，以便扩展狂犬病ERAg3m病 毒用途。

根据本发明的具体实施例，向狂犬病ERAg3m病毒溶液中加入的壳聚糖醋酸溶液的浓 度并不受特别限制，根据本发明的具体示例，壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖的浓度可以为 0.1%-10%w/v。根据本发明的另一个具体示例，采用的壳聚糖醋酸溶液的溶剂是浓度为1% 的醋酸，由此可以最大程度地增加壳聚糖的溶解性。

根据本发明的具体实施例，加入的三聚磷酸钠水溶液的浓度也并不受特别限制，例如 可以为0.1%-5%w/v。由于壳聚糖是带有阳离子的大分子聚合物，与带有阴离子的三聚磷酸 钠作用可形成纳米级聚电解质复合物，因此可以进一步提高制备微球的成型率。

根据本发明的具体实施例，上述将配制壳聚糖溶液、狂犬病ERAg3m病毒溶液和三聚 磷酸钠水溶液的混合物进行离心处理的条件并不受特别限制，例如可以在4摄氏度、 15000～18000rpm的条件下离心30分钟，由此可以进一步将病毒进行完全浓缩，便于控制 有效病毒抗原的浓度。

S300：诱饵包裹

在一些实施例中，将上述制备得到的壳聚糖纳米微球进行诱饵包裹，以便制备得到狂 犬病口服活疫苗。由此可以提高狂犬病口服活疫苗。

根据本发明的具体实施例，诱饵包裹可以进一步包括：将壳聚糖纳米微球加入到融化 的蜡中进行第一诱饵包裹并晾干，以便得到第一壳聚糖纳米微球包裹物；将封蜡的壳聚糖 纳米微球加入到猪油与蜡的混合液体中进行第二诱饵包裹并晾干，以便得到第二壳聚糖纳 米微球包裹物；以及将第二壳聚糖纳米微球包裹物加入到猪肉聚合物中进行混匀并定型， 以便制备得到狂犬病口服活疫苗。由此可以得到经过诱饵包裹的壳聚糖纳米微球，以便进 一步提高狂犬病口服活疫苗的吸引性，以便吸引靶动物主动食用该狂犬病口服活疫苗。

根据本发明的具体实施例，上述方法中采用的引诱剂并不仅限于猪油，只要能够有效 吸引靶动物诱食疫苗即可，通过实验研究，猪油对靶动物的吸引性明显高于其他引诱剂， 进一步地能提高口服疫苗的使用率。另外，根据本发明具体实施例，所用石蜡的目的主要 是疫苗定型，用于吸引靶动物。

根据本发明的具体实施例，将壳聚糖纳米微球进行诱饵包裹之前，还可以进一步包括： 向壳聚糖纳米微球中加入MEM溶液，以便使得壳聚糖纳米微球中的狂犬病ERAg3m病毒 的浓度为1×10^9.0TCID₅₀/ml。由此可以提高狂犬病ERAg3m病毒的浓度，以便进一步提高 狂犬病口服活疫苗的免疫活性。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性 的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1狂犬病毒抗原的制备

（1）BHK-21细胞悬浮驯化

选择BHK-21细胞克隆株生长良好的单层贴壁细胞，经0.01%胰酶一0.01%EDTA消化 液消化后，悬浮成终浓度为2×10⁵/mL～5×10⁵/mL的细胞液，接种量视罐体大小及培养液 的多少来确定。悬浮营养液成分包括：88%的MEM，8%的新生牛血清，1%L一谷氨酰胺 和抗生素等，然后用(7.2%)NaHCO₂调pH值至7.4左右，接种5L生物反应器，37℃，100 rpm搅拌培养。按照此方法联系传60代，观察细胞形态并计数。

（2）抗原制备

选取经BHK-21细胞适应的狂犬病ERAg3m毒株13代，LD₅₀为10^-7.0/ml，接种55-60 代悬浮细胞，接种后悬浮起始浓度为2×10^5.0个/ml，100转/min，37℃溶解氧为45%条件 下培养，每隔8小时取样，测定细胞活性，96-120小时分批式收获病毒液冻存，测定TCID₅₀和LD₅₀。

实施例2微球的制备

将1g壳聚糖溶解于1%的醋酸溶液中，在200r/min的搅拌速度下再将狂犬病毒抗原加 入到该壳聚糖溶液中，使其狂犬病毒抗原终浓度为1×10^8.0TCID₅₀/ml，然后缓慢加入三聚 磷酸钠水溶液，混合均匀，在4摄氏度、15000-18000rpm的条件下进行离心并收集沉淀物， 双蒸水洗沉淀物后进行冷冻干燥，以便得到壳聚糖纳米微球，其中，壳聚糖与三聚磷酸钠 的质量比为（3:1）～（8:1）。

实施例3狂犬病毒微球口服活疫苗的应用

将狂犬病毒微球口服活疫苗接种60日龄无狂犬病毒抗体的流浪犬10只，同时设灭活 疫苗接种对照犬10只，空白对照犬10只；免疫接种后21日后，采用狂犬病毒街毒致死剂 量攻击上述分别接种狂犬病毒微球口服活疫苗和灭活疫苗的犬以及空白对照犬。具体结果 见表1。

表1狂犬病疫苗攻毒保护结果

组别 免疫只数 攻毒死亡只数 攻毒保护率 口服活疫苗接种组 10 1 90% 灭活疫苗接种组 10 2 80% 空白组 10 10 0%

结论：口服活疫苗犬90%保护，灭活疫苗犬80%保护，空白对照犬全部死亡，无保护。 由此狂犬病毒微球口服活疫苗的攻毒保护率显著高于灭活疫苗的攻毒保护率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定 指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况 下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。