HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因的改造

摘要

本发明提供了一种改造后的CRF01_AE env基因。所述的改造后的CRF01_AE env基因增加了GC含量，破坏其中AU含量较高的内部抑制性序列（INS），使其更适合于在真核细胞中表达。可以不依赖于调节蛋白Rev及其应答元件在真核细胞中高效表达，与改造前相比，表达量明显提高。选择改造后的mod.AE env基因为疫苗基因，构建重组HIV-1疫苗有可能提高疫苗的免疫原性。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域。本发明涉及具有中国代表性HIV-1 CRF01_AE亚型毒株env区共有序列的获得及改造以提高其表达水平。 

背景技术

人类免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus type one,HIV-1）是获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency disease,AIDS)的主要病原体。联合国艾滋病规划署最新的报告估计，世界范围内的HIV感染者约3400万，其中妇女儿童约占55%，多达1840万，每年将近200万的感染者死于ADIS相关的疾病。尽管在过去十年里，广泛的宣传教育、行为干预和治疗干预在一定程度上降低了HIV的感染率和死亡率，但是新发感染人数仍以每年超过200万的数字居高不下。截至2011年底，我国境内的艾滋病病毒感染者和艾滋病病人约78万人，当年新发感染人数约4.8万人，艾滋病相关疾病死亡人数约2.8万¹。这些数据表明，尽管HIV新发感染率一直在下降，但是HIV感染者总数仍在增加，艾滋病疫情形式依然严峻，有效的预防和治疗性艾滋病疫苗的研究刻不容缓。艾滋病疫苗作为生物医学干预的主要手段，将在控制HIV感染和AIDS流行中起到重要的作用。 

CRF01_AE是最早被证实的HIV-1流行重组型，1993年首次发现于非洲²，但大部分的CRF01_AE分布在南亚和东南亚；柬埔寨、泰国和越南等国CRF01_AE占95%以上³；我国的CRF01_AE约占15%，在部分地区CRF01_AE是主要亚型。我国首次检测到该病毒株是在1994年于泰国从事性工作的云南籍妇女体内⁴，1996年首次发现广西静脉吸毒和异性传播途径中存在CRF01_AE病毒株流行⁵。随后CRF01_AE流行的范围逐渐扩大，全国大部分地区都有报道，2010年的分子流行病学调查显示，北京市CRF01_AE占所有亚型的40.4%，是北京市HIV-1的最主要流行株，成为男同人群中的主要亚型；即使在B’亚型占主要地位的河南省也检出了CRF01_AE。CRF01_AE亚型毒株已成为继B’亚型毒株之后的我国的主要流行亚型，因此设计针对于我国CRF01_AE亚型毒株分子生物学特征的疫苗迫在眉睫。 

发明内容

本研究从北京市确证CRF01_AE亚型HIV-1感染者血液标本中克隆到42株含有完整开放性阅读框（ORF）的env基因，通过生物软件比对获得其一致性共有序列。HIV-1的Gag、Pol、env等蛋白转录产物编码区存在很多抑制性序列(INS)，使得这些转录产物只有与病毒的调控蛋白Rev结合以后才能有效地被转运至胞浆中翻译蛋白⁶。本研究利用同义密码子替换去除这些序列，从而使得上述蛋白不依赖于Rev蛋白的表达。我们按照哺乳动物优势密码子的使用原则，在不改变氨基酸序列的前提下，对该共有序列env基因进行了密码子改造，增 加了GC含量，破坏其中AU含量较高的内部抑制性序列（INS），使其更适合于在真核细胞中表达。在293T细胞中的瞬时表达结果显示，改造后的基因可以在Rev缺陷的系统中有效表达。说明通过密码子改造获得了可以在哺乳动物细胞中高表达的CRF01_AE亚型env基因，而且该基因的表达不依赖于Rev蛋白及其应答元件。选择改造后的mod.AEenv基因为疫苗基因，构建重组HIV-1疫苗有可能提高疫苗的免疫原性。 

本研究采用了可应用于人体的质粒载体pVR⁷（由吉林大学孔维教授馈赠），该载体采用卡那霉素抗性代替一般载体常采用的氨苄抗性筛选标记在大肠杆菌中筛选阳性克隆，并且不含有任何真核筛选标记，保证了其在人体内的安全性。在该质粒中插入目的基因mod.AE env，构建了重组DNA疫苗，命名为pVR-mod.AE env。Western Blot结果显示pVR-mod.AE env在Rev缺陷的哺乳动物细胞中可有效表达改造后env基因。 

参考文献： 

1．2012China AIDS Response Progress Report. 

2．Murphy E,Korber B and Georges-Courbot MC,et al.:Diversity of V3 region sequences of human immunodeficiency viruses type 1 from the central African Republic.AIDS Res Hum Retroviruses 1993;9:997-1006. 

3．Hemelaar J,Gouws E,Ghys PD and Osmanov S:Global and regional distribution of HIV-1genetic subtypes and recombinants in 2004.Aids 2006;20:W13-W23. 

4．Cheng H,Zhang J,Capizzi J,Young NL and Mastro TD:HIV-1 subtype E in Yunnan,China.Lancet 1994;344:953-954. 

5．Chen J,Young NL and Subbarao S,et al.:HIV type 1 subtypes in Guangxi Province,China,1996.AIDS Res Hum Retroviruses1999;15:81-84. 

6．Cullen BR:Mechanism of action of regulatory proteins encoded by complex retroviruses.Microbiol Rev 1992;56:375-394 

7.Ma HX,Yu XH,Jiang CL,Wu YG,Kong Wei:Construction of Eukaryotic Expression Vector and Screening of Cell Strain for Stable Expression of HIV-1Subtype B/C Env.Chin J Biologicals 2006;19(4):365–367 

附图说明

图1为中国HIV-1CRF01_AE感染者env基因氨基酸序列比对结果及其共有序列。 

图2为改造前后env基因序列比对结果，可以看出优化改造后的mod.AE env的GC含量远远高于改造前wt.AE env,从而破坏了AU含量较高的内部抑制性序列。 

图3为pVR-mod.AE env质粒酶切（Sal I/Bgl II）图谱，结果显示成功将mod.AE env克隆到pVR载体上。 

图4为pVR-mod.AE env和pVR-wt.AE env表达差异的Western Blot检测结果，结果显示构建的重组pVR质粒成功的表达了mod.AE env基因，且表达量远远高于pVR-wt.AE env。 

具体实施方式：

1．HIV-1 CRF01_AE env基因的克隆及共有序列的获得 

对EDTA抗凝采血管采集的100份北京地区HIV-1感染者外周静脉血，采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit（Cat.No.51106），按照说明书进行前病毒DNA提取，核酸样品置于-20℃保存。通过nested-PCR方法扩增gag基因片段，用于样本HIV-1型别分析。采用TaKaRa公司生产的Ex Taq(Cat.No.DRR100A)，以Gag F2(5’ATG GGT GCG AGA GCG TCA RTA TTA A 3’，HXB2位置790～814)、Gag e2（5’TCC AAC AGC CCT TTT TCC TAG G 3’，HXB2位置2032～2011）作为外侧引物进行第一轮PCR反应，反应体系为25μl体系：10×Ex Taq Buffer 2.5μl，25mM dNTP Mixture 2μl，TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.125μl，模板2μl，引物GagF2、Gag e2各0.5μl，补加ddH₂O至25μl。反应程序：94℃5分钟，52℃1分钟，72℃2分30秒，1个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃1分30秒，30个循环，72℃10分钟。取第一轮反应产物5μl作为第二轮PCR反应模板，以306（5’GGG AAA AAA TTC GGT TAA GGC C 3’，HXB2位置836～857）、Cn-gag（5’TAG TTC CTG CTA TRT CAC TTC C 3’，HXB2位置1507～1406）为内侧引物进行巢氏PCR反应，反应体系为50μl体系：10×Ex Taq Buffer 5μl，25mM dNTP Mixture 4μl，TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.25μl，第一轮反应产物5μl，引物306、Cn-gag各0.5μl，补加ddH₂O至50μl。反应程序：94℃2分钟，50℃50秒，72℃1分30秒，1个循环，94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，35个循环，72℃10分钟。将扩增出目的片段（600bp左右）的产物切胶回收后送于北京擎科新业生物技术有限公司测序，测得的序列结果通过Mega5.0软件，使用自展法（bootstrap）构建Neighbor-Joining（NJ）进化树，与相应的参考株序列形成较稳定可靠的系统进化簇（bootstrap值>70%）,以判定该样本序列的亚型。对分型确认为CRF01_AE亚型的27份样本采用AE亚型特异性引物进行rev-env区的扩增，外侧引物env-F15’GTA GAT CCT AAC CTA GAG3’(HXB2位置5840～5857)、env-R1 5’CTA GAT CTT GAG ATA CTG CTC CTA C3’(HXB2位置8884～8908)用于第一轮PCR反应，反应条件：10×Ex Taq Buffer2.5μl，25mM dNTP Mixture2μl，TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.125μl，模板2μl，引物env-F1、env-R1各0.5μl，补加ddH₂O至25μl。反应条件为94℃5min预变性，94℃30sec，55℃30sec，72℃3min，30个循环,72℃10min。内侧引物env-F25’GCG AAT TCA TGG CAG GAA GAA GCG3’(HXB2位置5970～5985)、env-R2 5’CCG CTC GAG GAC CAC TTG CCT CCC ATG TTA TA3’(HXB2位置8791～8813)用于第二轮PCR反应，取第一轮反应产物5μl作为模板，反应条件为10×Ex Taq Buffer 5μl，25mM dNTP Mixture 4μl，TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.25μl，第一轮反应产物5μl，引物env-F2、env-R2各0.5μl，补加ddH₂O至50μl。反应条件为94℃ 5min预变性，94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 3min，35 个循环,72℃10min。PCR产物经过1%凝胶电泳分析，发现有15份样本扩增出2.8kb左右的目的条带，将特异性条带切胶回收后，采用EcoR I/Xho I对产物和载体pCDNA3.1(+)双酶切，分别回收2.8kb左右的目的基因片段和5.4kb的pCDNA3.1(+)载体片段，进行连接反应,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；通过菌落PCR的方式筛选阳性克隆，进行质粒抽提，将初步鉴定正确的重组子送于北京擎科新业生物技术有限公司测序。对测序结果进行编辑、校对后发现，其中有42个基因具有完整的开放性阅读框，采用之前描述的方式对获得的rev-env区序列进行型别分析，确定均为为CRF01_AE亚型。通过Vector NTI软件，对42条env序列进行比对，获得其共有序列(见图1)。 

2．共有序列env基因的改造、全基因合成和鉴定 

根据哺乳动物密码子的偏嗜性，在不改变氨基酸序列的前提下，以哺乳动物所偏嗜的密码子反替换共有序列中对应的氨基酸，同时在序列上游依次引入酶切位点Sal I、EcoR I以及kozak序列，下游引入酶切位点Bgl II。密码子第三位碱基的G/C含量较高为哺乳动物的特征，含有此特征的基因有可能在真核细胞中高效表达。同时通过同义替换的方式去除了编码区抑制性序列(INS)，使得Env蛋白不依赖于Rev的表达。通过全基因合成获得了改造后基因（mod.AEenv），优化序列由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，并通过SfiI酶切位点插入克隆载体pMKRQ质粒。将带有优化基因的质粒pMKRQ-mod.AEenv送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序鉴定。优化后的env序列与野生型的比对结果显示其密码子使用频率发生了很大改变，整个基因的GC含量明显增加，尤其是密码子第三位的碱基(见图2)。优化后的密码子序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

3.含mod.AE env基因的DNA疫苗pVR-mod.AE env的构建及鉴定 

本研究采用了可应用于人体的质粒载体pVR⁷，由吉林大学孔维教授馈赠。该载体采用卡那霉素抗性基因代替一般载体常采用的氨苄抗性筛选标记基因，在大肠杆菌DH5α中筛选阳性克隆，并且不含有任何真核筛选标记，保证了其在人体内的安全性，以便所构建的DNA疫苗最终应用于临床试验。采用Sal I和Bgl II对pMKRQ-mod.AE env以及pVR载体双酶切，对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，分别回收前者2.85kb的mod.AE env基因片段和后者4.9kb的pVR载体片段，进行连接反应,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，命名为pVR-mod.AE env，对阳性质粒以Sal I和Bgl II双酶切鉴定，可见大小为2.85kb及4.9kb两条片段(见图3泳道2)，并送北京擎科新业生物技术有限公司做测序鉴定。 

4、基因优化前后表达差异的研究 

设计引物wt.env F(5′CGC GTC GAC ATG AGA GTG AGG GGG ATA CAG3′)和wt.env R （5′GGC AGA TCT TTA TAG TAA AGC CCT TTC3′），分别在上述上、下游引物中引入Sal I和Bgl II的酶切位点，以pcDNA3.1(+)-CNAE01 rev-env质粒（CNAE01env序列见图1）为模板，采用Invitrogen公司生产的PlatinumTaq DNA Polymerase High Fidelity（Cat.No.11304-011）扩增目的基因wt.env。反应体系为：10×High Fidelity PCR Buffer 5μl，10mM dNTP mixture 1μl，50mM MgSO₄ 2μl，引物wt.env F、R各1μl，PlatinumTaq High Fidelity 0.2μl，模板质粒按1:100稀释后加入2μl，补加ddH₂O至50μl。反应条件为94℃2min预变性，94℃ 30sec，55℃ 30sec，68℃ 3min，35个循环,68℃ 10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收反应产物中2.6kb左右的特异性条带，用Sal Ⅰ/BglII双酶切回收产物和质粒载体pVR，分别回收2.6kb的wt.env基因片段和4.9kb的pVR载体酶切片段，进行连接反应，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，命名为pVR-wt.AEenv。通过Western Blot方法检测env基因优化前后的表达差异。将293T细胞接种于6孔板，6×10⁵/孔，待细胞汇合度达到80%时，按照Promega公司产品说明书，用FuGENE HD转染试剂将重组质粒pVR-mod.AE env和pVR-wt.AE env按相同条件转染293T细胞，72小时后收集细胞，每孔加入100μl三去污剂裂解缓冲液（具体配制方法参见分子克隆实验指南第二版第872页），冰上作用30min后，离心收集上清，吸取上清与5×SDS凝胶加样缓冲液以4：1比例混合，沸水浴10min使蛋白变性，按顺序加样于SDS聚丙烯酰胺凝胶（积层胶为5％，分离胶为10％），恒压100V进行SDS-PAGE蛋白电泳。电泳结束后，通过石墨电转仪将凝胶中蛋白转移至PVDF膜，将PVDF膜置于含5％脱脂奶的PBS中室温封闭2h，弃封闭液，加入1:1000稀释的2G12抗体，同时加入1：500稀释的GAPDH鼠单抗作为对照，室温孵育2h，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次，每次15min，然后加入1：1000稀释的HRP标记的山羊抗人IgG和山羊抗鼠IgG，室温孵育1h，以PBST洗涤3次，每次15min，最后加入DAB显色。结果如图4所示，pVR-mod.AE env转染的293细胞可见明显的160KD大小的蛋白条带（泳道2），pVR-wt.AE env转染的293细胞（泳道3）及293对照细胞（泳道1）都未见明显蛋白条带。表明野生型env基因在缺失Rev蛋白的环境中不能有效表达，对其进行密码子优化后获得的改造后env基因在缺失Rev的环境中能高水平表达，说明我们对AE env基因的改造是成功的。以之为基础构建的DNA疫苗能高水平表达外源基因，因而可以作为疫苗应用。