一种三苯胺类双光子荧光探针化合物及其制备方法和应用

摘要

本发明属于有机非线性光学材料领域，特别涉及一种三苯胺类双光子荧光探针化合物及其制备方法和应用，其制备方法为，氮气保护下，在4-氯甲基吡啶-2,6-二甲酸二甲酯、三苯基膦中注入无水苯，升温、回流、冷却，抽滤、洗涤，得到氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯，并溶于甲醇中；将三（4-甲酰苯基）胺与无水甲醇混合搅拌，加入氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯的甲醇溶液、甲醇钠的甲醇溶液，0℃-5℃下搅拌1-2小时，常温下搅拌3-4小时，柱层析分离。所述探针化合物的双光子吸收截面显著增强，水溶性好，并具有较高的反应活性和很强的配位能力，可应用在银离子检测和pH检测中。

说明书

技术领域

本发明属于有机非线性光学材料领域，特别涉及一种三苯胺类双光子荧光探针化合物及其制备方法和应用。

背景技术

1990年,美国康奈尔大学Denk等提出将双光子激发现象应用到共焦激光扫描显微镜中,开辟了双光子荧光显微和成像这个崭新的领域。双光子荧光显微成像兼具诸如近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸收系数及降低组织自发荧光干扰等特点而显著地优于单光子荧光显微成像，为生命科学提供了更为锐利的工具。为了使双光子荧光显微镜获得最大范围的应用，开发有效的双光子荧光探针十分重要。

一个优良的双光子荧光探针应该具备以下优点：在近红外区域拥有大的双光子吸收截面；水溶性好；拥有能灵敏响应生物底物的受体。利用双光子荧光探针，可研究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等，这对生命奥秘的揭示、临床诊断以及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。

铅锌矿开采、冶炼、化工、照相器材、电影工业、医药工业等部门排放的工业废水中含有银及其络合物。银离子具有抑菌消毒消炎的特性，也被广泛运用于生产、生活、医药等方面，例如银离子洗衣机、银离子冰箱等等。但是，正因为如此广泛的应用，增加了其对环境的污染。虽然金属银被认为是安全金属，但银离子或者银盐被人体吸收后会在皮肤、眼睛及粘膜沉着，产生病变，危害人体健康。因此，建立简便、高效的银离子检测方法已成为现代分析检测研究的热点之一。

化学反应的进行或完成，细胞和细胞器的许多重要生理过程等都与pH值密切相关。一些有机化合物的荧光或吸光性质随pH值的变化可用来指示目标介质中酸碱性的改变，荧光法测定pH值具有灵敏度高、分析仪器的几何设计更加灵活等特点。此外，利用各种荧光参数(如荧光强度、荧光寿命等)的变化来测定pH值，不仅便于荧光显微学研究，而且可实时检测细胞内pH值的动态分布和区域变化，引起了人们的关注。

吡啶-2,6-二甲酸二甲酯具有强的吸电子能力和配位能力，我们报道了以吡啶-2,6-二甲酸二甲酯为吸电子基，三苯胺为供电子基的有机双光子吸收材料，4,4’-双(2,6-二甲氧基羰基-吡啶-4-(E)-乙烯基)三苯胺（Haibo Xiao,Chong Mei,Yaochuan Wang，et al.Materials Chemistry and Physics.2011,130,897-902；肖海波，梅翀，张晓瑛，CN102702090A）。该生色团的最大特点是：具有强配位能力，可以和金属离子形成九配位的高稳定性配合物；具有较好的水溶性，能够用于细胞的双光子荧光成像；具有较高的反应活性，易于与生物分子偶联。

发明内容

本发明的目的是提供一种三苯胺类双光子荧光探针化合物，该化合物的双光子吸收截面显著增强，为1358GM，水溶性非常好，并具有较高的反应活性和很强的配位能力。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述三苯胺类双光子荧光探针化合物的方法。

本发明涉及三苯胺类双光子荧光探针化合物在银离子检测中的应用。

本发明也涉及三苯胺类双光子荧光探针化合物在pH检测中的应用。

本发明还涉及三苯胺类双光子荧光探针化合物在制备有机双光子吸收材料中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种三苯胺类双光子荧光探针化合物，其特征在于，结构式如式（I）所示：

一种上述三苯胺类双光子荧光探针化合物的制备方法，其步骤包括：

（1）、氮气保护下，在4-氯甲基吡啶-2,6-二甲酸二甲酯、三苯基膦中注入无水苯，升温至70℃-90℃，回流14-18小时，冷却至室温，抽滤、洗涤，得到氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯；

（2）、将步骤（1）中的氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯溶于甲醇中，备用；

（3）、在氮气保护下，将三（4-甲酰苯基）胺与无水甲醇混合搅拌，加入步骤（2）中制得的氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯的甲醇溶液、甲醇钠的甲醇溶液，0℃-5℃下搅拌1-2小时，常温下搅拌3-4小时，柱层析分离即可。

所述步骤（1）中，4-氯甲基吡啶-2,6-二甲酸二甲酯、三苯基膦和无水苯的用量比为1mmol:1-3mmol：2-6mL。

所述步骤（2）中，氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯与甲醇的用量比为0.02-0.06mol/L。

所述步骤（3）中，三（4-甲酰苯基）胺、氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯与无水甲醇的用量比为1mmol：0.8-1.5mmol：20-30mL。

所述步骤（3）中，氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯与甲醇钠的摩尔比为1：0.8-1.5。

所述步骤（3）中，氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯的甲醇溶液和甲醇钠的甲醇溶液的体积比为1-3:1。

本发明的要点为：以2,6-二甲基吡啶为原料，通过氧化，酯化，羟甲基化，氯取代，加成得到氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯，再与三(4-甲酰苯基)胺通过wittig反应得到化合物（I），合成路线为：

本发明的有益效果是：

1、所述化合物I的双光子吸收截面显著增强，为1358GM；水溶性也得到了进一步提高，并具有较高的反应活性和很强的配位能力。

2、所述化合物I能用作双光子Ag⁺探针，检测Ag⁺选择性好、灵敏度高。仪器检测极限浓度为10^-7mol/L，肉眼检测极限浓度为10^-5mol/L。可用于检测分析含银离子的生物样品，能够实现深层次、高分辨、无损伤探测。

3、所述化合物I能用作酸性环境下的双光子pH探针，可用于生物活细胞及组织中的酸性囊泡等的探测及成像观察，不会发生荧光漂白与目标失踪问题。

4、所述化合物I的制备方法简单、易操作、产率高。

附图说明

图1是实施例1中制得的化合物I的¹H NMR。

图2是实施例1中制得的化合物I的¹³C NMR。

图3是实施例1中制得的化合物I的溶液对不同金属离子的单光子吸收光谱响应图，化合物I的浓度为1×10^-5mol/L,金属离子浓度为1×10^-5mol/L。

图4是实施例1中制得的化合物I的溶液对不同金属离子作用后的对比照片。

图5是实施例1中制得的化合物I的溶液对不同浓度银离子的单光子吸收光谱响应图，化合物I的浓度为1×10^-5mol/L。

图6是实施例1中制得的化合物I的溶液对不同浓度银离子的单光子荧光光谱响应图，化合物I的浓度为1×10^-5mol/L。

图7是实施例1中制得的化合物I在不同pH下的单光子吸收光谱图，化合物I的浓度为2×10^-5mol/L。

图8是实施例1中制得的化合物I在酸性环境中不同pH下的单光子荧光光谱图，化合物I的浓度为1×10^-5mol/L。

图9是实施例1中制得的化合物I在碱性环境中不同pH下的单光子荧光光谱图，化合物I的浓度为1×10^-5mol/L。

图10是实施例1中制得的化合物I在二氯甲烷中的双光子吸收测试Z-扫描图。

图11是实施例1中制得的化合物I在二氯甲烷中的双光子荧光测试图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

1、氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯的合成

(1)吡啶-2,6-二甲酸的合成

将500mL蒸馏水、12mL（92mmol）2,6-二甲基吡啶放在1000mL圆底烧瓶中，磁力搅拌下，缓慢加入80g（506mmol）高锰酸钾，插上回流冷凝管。110℃-115℃下回流3.5h。停止反应，冷却至室温，抽滤、除去黑色固体。收集无色滤液，减压除去五分之四滤液。不断搅拌下，缓慢倒入约20mL体积浓度为70%的硫酸，析出大量白色粗品，冷却，抽滤，得吡啶-2,6-二甲酸。

(2)吡啶-2,6-二甲酸二甲酯的合成

将33.5g（200mmol）吡啶-2,6-二甲酸，120mL（1.66mol）二氯亚砜投于500mL圆底烧瓶中，连接回流冷凝管，并插上装有无水CaCl₂的干燥管。120℃-125℃下回流12h。冷却至室温，改为蒸馏装置，蒸出二氯亚砜，得到深红色混合物。室温下倒入150mL（3.7mol）甲醇，连接回流冷凝管，回流反应2.5h，直至反应液颜色褪去。冷却至室温，改为蒸馏装置，蒸出多余未反应的甲醇约100mL。冷却、抽滤、得到淡粉色粗品，甲醇洗涤三次后得到吡啶-2,6-二甲酸二甲酯。

(3)4-羟甲基吡啶-2,6-二甲酸二甲酯的合成

将5g（25.5mmol）吡啶-2,6-二甲酸二甲酯、38mL（399mmol）甲醇和30mL体积浓度为30%的硫酸投入250mL三颈烧瓶中，冰水浴下搅拌。缓慢向反应液中滴入20.4mL(200mmol)30%双氧水，含13.9g（50mmol）七水合硫酸亚铁水溶液20mL，30min滴加完毕。控制温度在20℃-25℃间，反应1h。停止反应，用无水碳酸钾调节溶液pH值约为6-7，抽滤，除去固体。乙酸乙酯萃取滤液五次（150mL×5），收集合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，加入适量300-400目柱层析硅胶，柱层析分离（乙酸乙酯：石油醚=1:2），得到4-羟甲基吡啶-2,6-二甲酸二甲酯。

(4)4-氯甲基吡啶-2,6-二甲酸二甲酯的生成

将2.2g（10.0mmoL）4-羟甲基-2,6-二甲酸二甲酯-吡啶加入50mL圆底烧瓶中，氮气保护下，注入30mL三氯甲烷，冰水浴下搅拌。用2mL注射器缓慢注入1.2mL（15.0mmol）氯化亚砜，15min滴加完毕。0-5℃下反应20min，室温搅拌30min，减压旋去溶剂，用15mL乙酸乙酯重结晶，得到4-羟甲基吡啶-2,6-二甲酸二甲酯。

(5)氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯的合成

将1.22g（5.0mmol）4-氯甲基吡啶-2,6-二甲酸二甲酯，1.64g（6.25mmol）三苯基膦投于50mL圆底烧瓶中，连接回流冷凝管，氮气保护下，快速注入15mL无水苯，升温至80℃，持续回流16h。冷却至室温，析出大量白色粗品，抽滤得固体，用少量乙酸乙酯洗涤4次，得到氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯。

2、化合物I的合成

将65.87mg（0.2mmol）三（4-甲酰苯基）胺投于50mL干燥的圆底烧瓶内，氮气保护下，加入10mL无水甲醇，冰水浴下0℃搅拌。同时用5mL注射器缓慢注入含101mg（0.2mmol）氯化-4-亚甲基三苯基膦基-吡啶-2,6-二甲酸二甲酯的甲醇溶液(5mL)和含11mg(0.2mmol)甲醇钠的甲醇溶液(2.5mL)。冰水浴下搅拌1h，常温下搅拌3h。过短柱（二氯甲烷：甲醇=1:50,体积比），除去金属离子；溶剂旋干，加入300-400目硅胶，柱层析（乙酸乙酯：石油醚=1:2），得到化合物I。

经过检测，本发明制备的化合物I的¹H NMR、¹³C NMR、IR数据如下：

¹H NMR(400MHz，CDCl3)：9.91(s，1H，CHO)，8.40(s，4H，py-H)，7.80(d，2H，J=8.684)，7.57(d，4H，J=8.56)，7.51(d，2H，J=16.312，CH=CH)7.22(m，6H，Ph-H)，7.08(d，2H，J=16.206，CH=CH)，4.07(s，12H，CH3），具体如图1所示；

¹³C NMR(400MHz，CDCl3，δ)：190.723，165.593，152.413，148.981，147.881，147.250，134.923，132.242，131.631，131.059，129.034，125.924，125.058，123.977，122.190，53.552，具体如图2所示；

IR(KBr)：2957.97，1727.56，1642.19，1586.26，1559.77，1506.79，1412.59，1356.66，1150.61，985.77，820.93cm^-1

实施例2

化合物I对银离子的选择性

使用实施例1合成的探针化合物I，用吸收光谱的方法评价对银离子的选择性。将化合物I溶于二甲亚砜：蒸馏水＝5：95（体积比）的混合溶剂中，配制成含化合物I浓度为1×10^-5mol/L的混合液，分别加入不同的金属离子，使金属离子的浓度为1×10^-5mol/L，测试其单光子吸收光谱，具体结果如图3所示，从图3中可以看到，化合物I对银离子具有很高的选择性（金属离子为Ag⁺、Na⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺），当化合物I的溶液中加入银离子后，溶液在305nm附近的吸光度明显提高；而化合物I的溶液中加入其它金属离子后，吸光度几乎没有变化。

在上述配制成含化合物I浓度为1×10^-5mol/L的混合液中，再分别加入不同的金属离子，使其浓度为1×10^-5mol/L，在肉眼观察下评价对银离子的选择性，具体如图4所示，将所配制的溶液依次排列，从左到右排列顺序依次为：参照样、Mg²⁺、Ca²⁺、Ag⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Na⁺、Mn²⁺、Pb²⁺，肉眼观察，从图4中可以看出银离子的加入，使溶液变成桔黄色，而其它离子则没有影响。

实施例3

化合物I对不同浓度银离子的吸收响应

使用实施例1合成的探针化合物I，将化合物I溶于二甲亚砜：蒸馏水＝5：95（体积比）的混合溶剂中，配制成含化合物I浓度为1×10^-5mol/L的混合液，分别加入不同浓度的银离子，银离子的浓度变化从小到大依次为0、1×10^-7mol/L、5×10^-7mol/L、1×10^-6mol/L、2×10^-6mol/L、4×10^-6mol/L、6×10^-6mol/L、8×10^-6mol/L、1×10^-5mol/L、2×10^-5mol/L、4×10^-5mol/L、6×10^-5mol/L、8×10^-5mol/L和1×10^-4mol/L，具体如图5所示，从图中可看出，本发明的化合物I的单光子吸光度和银离子浓度成正关系。

实施例4

化合物I对不同浓度银离子的单光子荧光响应

使用实施例1合成的探针化合物I，将化合物I溶于二甲亚砜：蒸馏水＝5：95（体积比）的混合溶剂中，配制成含化合物I浓度为1×10^-5mol/L的混合液，分别加入不同浓度的银离子，银离子的浓度变化从小到大依次为为1×10^-6mol/L，2×10^-6mol/L，4×10^-6mol/L，6×10^-6mol/L，8×10^-6mol/L，1×10^-5mol/L，2×10^-5mol/L，4×10^-5mol/L，6×10^-5mol/L，8×10^-5mol/L，1×10^-4mol/L。测试条件为激发波长305nm，狭缝宽度为10/10，电压为550v，具体如图6所示，从图中可看出，银离子浓度越高，本发明的化合物I的荧光强度越低。

实施例5

化合物I单光子吸收光谱对pH值变化的响应

将实施例1合成的化合物I溶于二甲亚砜：蒸馏水＝5：95（体积比）的混合溶剂中，配制成含化合物I浓度为2×10^-5mol/L的混合液，分别用浓的HCl和NaOH溶液调节pH值，测试其在不同pH值下的吸收光谱。pH值依次为：0.98、1.23、2.23、3.45、4.71、5.05、6.32、7.12、8.24、9.78、10.77、11.98，测试结果如图7所示，从图中可以看出，pH值的变化对化合物I吸收光谱的影响是很明显的，在pH值为0.98条件下，化合物I在365nm及543nm有最大吸收，随着pH值的增大，365nm及543nm两处的最大吸收逐渐减弱，pH值为7.12时，365nm及543nm两处基本无吸收，而在425nm处出现吸收；393nm及457nm处出现等位点。

实施例6

化合物I单光子荧光光谱对pH值的响应

将化合物I溶于二甲亚砜：蒸馏水＝5：95的混合溶剂中，化合物I浓度为1×10^-5M，分别用不同浓度的HCl和NaOH溶液调节pH值，测试其在不同pH值下的荧光光谱。测试条件为：激发波长为408nm，狭缝宽度为10/10，电压为450v。测试结果如图8和图9所示，从图8可以看出，pH值变化依次为7.06、6.27、5.22、4.69、4.25、3.08、2.50、1.08，随着体系的pH不断减小，荧光强度不断降低，其最大发射峰的强度逐渐降低，荧光光谱的峰型从中性时的较明显的二重峰逐渐变为单重峰；从图9中可以看出，pH值变化依次为7.06、8.09、9.12、10.02、11.25、12.78、13.89，随着体系的pH不断增大，荧光强度不断降低，其最大发射峰的强度逐渐降低。

实施例7

化合物I的双光子吸收截面测试

将实施例1中制得的化合物I溶于二氯甲烷，使其浓度为0.01mol/L，使用800nm波长的飞秒激光器，光强为50mW，测得双光子吸收截面为1358GM，测试Z-扫描图如图10所示。

实施例8

化合物I的双光子荧光测试

将实施例1中制得的化合物I溶于二氯甲烷，使其浓度为0.01mol/L。激发波长为800nm，激发时间为0.1s。当激光强度为400mv时,测试双光子荧光谱图如图11所示。从图11可以看出化合物I在800nm飞秒脉冲激发情况下，能够在516nm处产生较强的荧光发射。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。