一种肌酸激酶同功酶纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种肌酸激酶同功酶（CK-MB）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：肌酸激酶同功酶校准品；偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液；生物素标记的肌酸激酶同功酶抗体；肌酸激酶同功酶抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；肌酸激酶同功酶质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比灵敏度高、可测定浓度范围宽、试剂有效期长、操作简单、检测自动化程度高等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种肌酸激酶同功酶 （CK-MB）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

肌酸磷酸激酶(Creatine Kinase,CK)大量存在于心肌、骨骼肌和脑等组织，是一个与 细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。天然的CK分子是一个 紧密的球状结构，是由两个亚基（M型亚基和B型亚基）组成的二聚体。CK有三种主 要的同工酶，即CK-MM，CK-MB，CK-BB。其中CK-BB主要存在于大脑、前列腺、肠、 肺；骨骼肌中存在大量的CK-MM和少量的CK-MB；而心肌组织虽以CK-MM为主，但 CK-MB所占比例远较其他组织高。

由于心肌是唯一含CK-MB较多的器官，因此与其它几种可能反映心肌损伤的酶相 比，CK-MB的测定最宜作为心肌损伤的定量观察指标。CK-MB诊断透壁型心肌梗死的 敏感性和特异性均极高，在起病4h后增高。16-24h后达高峰，3-4d恢复正常。

CK-MB在急性心肌梗死（AMI）后仍保存在高水平，则意味着心肌坏死还继续进行； 若恢复正常后再次升高，提示原梗死部位扩展或有新的梗死出现，由于半衰期短，CK-MB 和亚型在监测再发损伤中比肌钙蛋白更为敏感，因为肌钙蛋白可在血中保持高值数天； 其增高的程度能较准确地反映梗死的范围；其高峰出现时间是否提前有助于判断溶栓治 疗是否成功一。若单独进行检测，CK-MB是很理想的标志物；与心肌肌钙蛋白进行联合 检测，更有助于提高AMI的诊断阳性率。

目前，临床领域应用的CK-MB检测方法主要有电泳、免疫抑制法、酶联免疫测定法 和化学发光免疫测定法等。

电泳法和免疫抑制法均会受到溶血和巨CK的干扰，免疫抑制法还会受到CK-BB的 干扰，限制了这两种检测方法的应用。

酶联免疫测定法具备其操作简单、试剂有效期长无污染、高于胶体金的敏感性、特 异性好、结果可用仪器测定等特点得以推广，但由于敏感性相对较低，所用标记酶与底 物可定量测定范围窄，及仪器测定范围窄等缺点，限制了其在微量免疫定量测定中的应 用。

化学发光免疫测定其研究起步于80年代初，快速发展应用于90年代，为当今最为 敏感的微量免疫测定法。目前主要采用发光板方法，板间差异大，测值重复性较差。

发明内容

本发明要解决的问题是提供肌酸激酶同功酶的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制 备方法，避免了测值重复性差，酶联免疫法灵敏度低，检测范围窄等缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：肌酸激酶同功酶（CK-MB）纳米 磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：肌酸激酶同功酶校准品；偶联有链霉亲和 素的纳米磁微粒悬浮液；生物素标记的肌酸激酶同功酶抗体；肌酸激酶同功酶抗体酶结 合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL； 肌酸激酶同功酶质控品，质控品包括浓度12ng/mL的低值质控品和300ng/mL的高值质 控品；化学发光液A液和B液，A液为5mmol/L，pH8.6的Tris-HCl缓冲液，且该缓 冲液中含有终浓度0.7g/L鲁米诺和终浓度0.165g/L对碘酚；B液为0.675g/L过氧化脲； 20倍浓缩洗液；反应管。

进一步，所述的纳米磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒 径10-50nm。

进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）肌酸激酶同功酶校准品的配制：

将肌酸激酶同功酶抗原用校准品稀释液（含1%BSA的磷酸盐缓冲液）配制成校准 品浓储液，以企业标准品进行定标，将浓储液用校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0， 3，15，50，200，800ng/mL；

企业标准品制备方法：用含1%BSA的磷酸盐缓冲液将CK-MB抗原按照1:10、1:10²、 1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷的比例进行稀释，使用罗氏公司CK-MB定量检测试剂 盒（货号：11821598，规格100人份）测定，根据测定结果，建立稀释比例与测定浓度 的曲线。按照曲线方程分别计算出浓度为3，15，50，200，800ng/mL的稀释比例，按此 比例配制企业标准品，使用罗氏产品进行多次测定，确定企业标准品浓度。配制的企业 标准品以0.5mL/管分装，用冷冻干燥机冻干，-20℃保存。

（2）肌酸激酶同功酶质控品的配制：

用校准品稀释液将上述浓储液稀释至12ng/mL和300ng/mL，12ng/mL为低值质控， 300ng/mL为高质质控；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和 FeCl₂·4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气环境下加0.5M氨 水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后， 用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联

采用分散聚合法进行偶联，具体制备方法如下：取上述制备的纳米磁微粒超声分散 在10%PEG8000溶液中，得磁流体溶液，向磁流体溶液中按体积比1：10加入无水乙醇， 搅拌30min后，移入带有搅拌器，冷凝管，氮气入口的三颈瓶中，加入交联剂N,N’-亚甲 基双丙烯酰胺；在氮气的保护下，升温至60±1℃，恒温搅拌30min，之后依次加入过氧 化苯甲酰，用量为磁流体用量的3%，搅拌速度约为500rpm，苯乙烯体积同磁流体溶液， 丙烯酸体积为磁流体溶液的1/4，保持氮气气流，其余条件保持不变,反应8-10h，所得 产物静置，用蒸馏水反复洗涤，再用盐酸调节pH=1，浸泡24h，静置；再用蒸馏水反复 洗涤，除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h， 得到表面联有羧基的纳米磁微粒；

C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备，配制1L，方法如下：

取100mL0.1M2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液，加入10mg表面联有羧基的纳米磁微 粒，室温搅拌40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mL碳二亚胺（EDC） 溶液，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L 即可；

（4）生物素标记的肌酸激酶同功酶抗体的制备

取0.6mg肌酸激酶同功酶抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后 的抗体加入32ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终浓度为5-10%，缓慢 振荡，避光反应2.5h；在上述溶液中加入250uL1M氯化铵溶液，常温避光反应30-60min； 用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析24h，期间换液2-4次；

（5）肌酸激酶同功酶抗体酶结合物的制备

采用改良高碘酸钠氧化法将肌酸激酶同功酶抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用 酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4000，并加入10%酶稳定剂，储存于2～8℃；

改良过碘酸钠氧化法步骤包括：

A：HRP活化

1）配置10mg/mL HRP溶液；

2）配置12.8mg/mL过碘酸钠NaIO₄溶液；

3）将上述1）和2）配制溶液按体积比1：1混匀，4℃避光反应30min；

4）配置浓度为20uL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3）以相同体积混合，常温避 光反应20min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）。

B、CK-MB单克隆抗体标记

1）将待标记原料装入透析袋中，用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；

2）将标记原料与活化的HRP按质量比1:2进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液 于4℃透析24h（期间换液2-3次）；

3）配置浓度为2mg/mL的NaBH₄水溶液，按1mgHRP加80uL配制好的NaBH₄水 溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；

4）将上述步骤3）完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油， -20℃保存。

酶稀释液中包括10mL/L2M NaOH，15g/L NaCl，10g/LBSA，5g/L葡聚糖T-2000 （Dextran T-2000），1.05g/L聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），2.5mL/L硫酸庆大 霉素，1mL/L胭脂红（胭脂红为粉末固体，配制成浓度40mg/mL以后使用），2g/L Tween-20 （购自Sigma公司），1mL/L ProClin300（购自Sigma公司）；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L  Tween-20和2%Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避 光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃，每种试剂各一瓶；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精 密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

本发明的原理是，采用双抗体夹心法测定血清或血浆中的CK-MB，在亲和素-纳米 磁微粒悬浮液中加入生物素-CK-MB抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形 成磁微粒-亲和素-生物素-CK-MB抗体复合物，加入样本和酶，通过抗原抗体反应，形成 磁微粒-亲和素-生物素-CK-MB抗体-CK-MB抗原-CK-MB抗体-HRP复合物，用磁场将 复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP 催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的 光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值RLU。样本的RLU与样本CK-MB浓度呈正相 关。样本中的CK-MB浓度依据由校准品CK-MB浓度和对应的RLU建立的Log（X）-Log （Y）数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的CK-MB含量。

本专利发明的肌酸激酶同功酶纳米磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒，具有以下优 点：

（1）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于0.3ng/mL。

（2）特异性良好，本产品对肌酸磷酸激酶同工酶MM（500ng/mL）、肌酸磷酸激酶 同工酶BB（500mg/mL）未出现交叉反应。

（3）精密性良好，批内不精密度不高于5%，批间不精密度不高于10%。

（4）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用 价值。

（5）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2～8℃可存放1年。

附图说明

图1是本发明的试剂盒测定肌酸激酶同功酶与罗氏测定肌酸激酶同功酶的测定结果 比较图，其中纵坐标为本试剂盒测得的肌酸激酶同功酶值，横坐标为罗氏试剂盒测定肌 酸激酶同功酶值，两种方法相关系数r=0.9525，直线方程y=0.9963x+0.1829。

具体实施方式

实施例1：制备肌酸激酶同功酶纳米磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒

（1）肌酸激酶同功酶校准品的配制：

将肌酸激酶同功酶抗原（购自Fitzgerald公司）用校准品稀释液（含1%BSA的磷酸 盐缓冲液）配制成校准品浓储液，以企业标准品进行定标，将浓储液用校准品稀释液稀 释至工作浓度，分别为0，3，15，50，200，800ng/mL；

（2）肌酸激酶同功酶质控品的配制：

用校准品稀释液将上述浓储液稀释至12ng/mL和300ng/mL，12ng/mL为低值质控， 300ng/mL为高质质控；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和 FeCl₂·4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气环境下加0.5M氨 水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后， 用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联

采用分散聚合法进行偶联，具体制备方法如下：取上述制备的纳米磁微粒超声分散 在10%PEG8000溶液中，得磁流体溶液，向磁流体溶液中按体积比1：10加入无水乙醇， 搅拌30min后，移入带有搅拌器，冷凝管，氮气入口的三颈瓶中，加入交联剂N,N’-亚甲 基双丙烯酰胺；在氮气的保护下，升温至60±1℃，恒温搅拌30min，之后依次加入过氧 化苯甲酰，用量为磁流体用量的3%，搅拌速度约为500rpm，苯乙烯体积同磁流体溶液， 丙烯酸体积为磁流体溶液的1/4，保持氮气气流,其余条件保持不变,反应8-10h，所得 产物静置，用蒸馏水反复洗涤，再用盐酸调节pH=1，浸泡24h，静置；再用蒸馏水反复 洗涤，除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h， 得到表面联有羧基的纳米磁微粒；

C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备，配制1L，方法如下：

取100mL0.1M MES缓冲液，加入10mg表面联有羧基的纳米磁微粒，室温搅拌 40min，之后加入3.5mg链霉亲和素（购自Sigma公司），然后加入8mg/mLEDC溶液， 2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的肌酸激酶同功酶抗体的制备

取0.6mg肌酸激酶同功酶抗体（购自Fitzgerald公司），用硼酸盐缓冲液在2～8℃下 透析1～3h；将透析后的抗体加入32ug生物素（购自Sigma公司），同时加入二甲基亚 砜，使二甲基亚砜最终质量浓度为5-10%，缓慢振荡，避光反应2.5h；在上述溶液中加 入250uL1M氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析 24h，期间换液2-4次；

（5）肌酸激酶同功酶抗体酶结合物的制备

采用改良高碘酸钠氧化法将肌酸激酶同功酶抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用 酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4000，并加入10%酶稳定剂，储存于2～8℃；

酶稀释液中包括10mL/L2M NaOH，15g/L NaCl，10g/LBSA，5g/L Dextran T-2000 （购自Sigma公司），1.05g/L Triton X-100（购自Sigma公司），2.5mL/L硫酸庆大霉素， 1mL/L胭脂红（胭脂红为粉末固体，配制成浓度40mg/mL以后使用），2g/L Tween-20 （购自Sigma公司），1mL/L ProClin300（购自Sigma公司）；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L  Tween-20和2%Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避 光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃，每种试剂各一瓶；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精 密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

实施例2：本发明试剂盒的检查

（1）物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。

（2）准确性：试剂盒校准品与国家标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟 合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行（t检验，|t|<2.447）；以肌酸激酶同功酶企 业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平 均值应在0.90～1.10范围内。

（3）剂量-反应曲线的线性：用双对数数学模型拟合，剂量-反应曲线在5-500ng/mL浓度 范围内相关系数r绝对值不低于0.9900。

（4）分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于0.3ng/mL。

（5）精密度：10孔平行测定高值和低值质控品，计算测定结果的平均浓度（）与标 准差（SD），批内不精密度使用3批产品进行3次试验， 计算测定结果的平均浓度（）与标准差（SD），批间不精密度结果应符合批内不精密度（CV%）应不高于5%；批间不精密度（CV%）应不高于10%。

（6）质控品的测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Log(Y)数学模 型拟合，质控品测值应在允许范围内，低值质控品测值在12ng/mL，高值质控品测值在 300ng/mL。

（7）特异性：

交叉反应符合下表要求：

（8.）稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述各项要求。

实施例3：本发明试剂盒的使用方法

（1）将待检试剂盒在室温（18～25℃）下平衡30分钟。

（2）配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓 缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃，待结晶溶解后再进行稀释。

（3）配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。

（4）将反应管编号，向试管中依次加入20uL校准品或血清标本、50uL磁性颗粒-链霉 亲和素悬浮液、50uL生物素-肌酸激酶同功酶抗体结合物、100uL肌酸激酶同功酶抗体酶 结合物，37℃下振荡反应30min，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上清液， 加入500uL洗液，充分混匀后，于磁分离器上分离，倒出洗液，重复3次，在各管中加 入化学发光底物液100uL，充分混匀，暗置5min，在管式化学发光仪上测定各管的发光 值（RLU），以校准品浓度的Log值为横坐标，以发光值的Log为纵坐标，绘制标准曲线， 根据血清标本的发光值即可计算出肌酸激酶同功酶的浓度。

实施例4：本试剂盒的方法学评价结果

检测范围：范围为5-500ng/mL，对于浓度大于500ng/mL的标本应先进行稀释后再进行 测定。

灵敏度：0.3ng/mL。

精密度：小于5%。

准确性：回收率的平均值在0.90～1.10范围内。

特异性：肌酸磷酸激酶同工酶BB、肌酸磷酸激酶同工酶MM交叉反应系数小于1%。

质控品测值：低值质控品QcL和高值质控品QcH的测值均在允许范围内，低值质控品测 值在12ng/mL，高值质控品测值在300ng/mL。

稳定性：将试剂盒中各试剂组分于37℃下放置7d，稳定性良好。

实施例5：本试剂盒的临床对比实验

本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数232例，先以肌 酸激酶同功酶罗氏检测试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定， 结果表明，直线方程为y=0.9963x+0.1829，相关系数r=0.9525。可见本方法制备的试 剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验（检 验水准α=0.05），P<0.001，两种方法测定的肌酸激酶同功酶值的相关密切程度是显著 性的，可见两种方法测定的肌酸激酶同功酶值密切相关，说明试剂盒的诊断能力较强， 可推广临床应用。

为了确定本试剂盒的临床参考值，对400份正常人血清、血浆样本采用本试剂盒进 行了检测，结果表明本试剂盒的参考值（参考范围）为0-7.0ng/mL。