组织再生材料的制作方法和组织再生材料

摘要

本发明提供一种组织再生材料的制作方法和组织再生材料。本发明的制作方法，使多孔质体(11)的底面与保持板(1)的表面接触，所述保持板是对于水的接触角为5~90°的树脂板或玻璃板，所述多孔质体由细胞密度为5×10

说明书

技术领域

本发明涉及向多孔质的支撑体(多孔质体)导入细胞悬液来进行接 种的组织再生材料的制作方法和组织再生材料。

背景技术

组织工程领域中正使用在具有连通的多孔质结构的支撑体即多孔 质体中接种有细胞的组织再生材料。重要的是，在多孔质体中，直至 中心部以三维连通的方式存在用于培养细胞的小孔。

实际上，难以使细胞、培养液、培养液中混合有细胞的溶液(以下 有时称为“细胞悬液”)完全渗透到多孔质体的小孔中，仅仅向多孔质 体中滴加细胞悬液或者将多孔质体浸渍到细胞悬液中，细胞悬液也不 会进入到多孔质体的中心部。

对此，专利文献1中，例如如权利要求8中记载的那样，提出了一 种通过使多孔质体沉入细胞悬液中并置于减压或真空下而使细胞悬液 渗透到多孔质体中的方法。

专利文献2、3中公开了通过使多孔质体中预先含有水并同时将该 水与细胞悬液交替而将细胞悬液导入多孔质体中的方法。

专利文献4中，为了使形成在多孔质体中的孔较大而使细胞悬液容 易进入并且即使为这样较大的孔也能使细胞悬液保留在多孔质体内， 公开了一种向细胞悬液中添加胶原、明胶等增稠成分的方法。由此， 认为能够在多孔质体中导入细胞悬液并使其保留在多孔质体中。

专利文献1：日本特表2006-508717号公报

专利文献2：日本特开2007-181459号公报

专利文献3：日本特开2009-195682号公报

专利文献4：日本特开2003-038635号公报

但是，对于专利文献1记载的技术而言，即使利用负压，实际上也 难以使细胞悬液渗透到整个多孔质体中，因此，需要利用激光等形成 使细胞悬液渗透的路径。另外，利用负压而使压力发生较大变化对于 细胞而言未必是理想的状态。

对于专利文献2、3公开的技术而言，虽然能够在整个多孔质体中 接种细胞，但是，一部分细胞悬液会流出，因此，存在导入的细胞的 数量不准确的缺点。

特别是对于专利文献1~3记载的技术而言，存在如下问题：多孔质 体的小孔较小，从而使以水作为主要成分的细胞悬液无法充分地渗透 至多孔质体的中心部。因此，如果使用具有较大孔(孔径 180μm~3500μm、平均孔径350μm~2000μm)的小孔结构的多孔质体，则 能够使细胞悬液容易地渗透至中心。但是，在这种较大孔径的情况下， 细胞悬液容易从多孔质体中通过，从而使细胞悬液难以保留在多孔质 体内。

对此，根据专利文献4记载的技术，虽然能够使细胞悬液容易渗透 至多孔质体的中心，但是，增稠成分会残留在多孔质体中，因此，存 在难以更换新的培养液的问题。

发明内容

因此，本发明的课题在于提供一种组织再生材料的制作方法，其 能够稳定且不浪费地向具有较大的孔(孔径180μm~3500μm、平均孔径 350μm~2000μm)、即不易使细胞悬液保留在多孔质体内的小孔的多孔 质体中导入细胞悬液从而接种细胞。此外，本发明提供组织再生材料。

以下，对本发明进行说明。在此，为了便于理解，将附图中所附 的参考标号用括号括起而一并进行记载，但本发明并不限定于此。

第一发明为一种组织再生材料的制作方法，其中，使多孔质体(11) 的底面与保持板(1)的表面接触，所述保持板（1）是对于水的接触角为 15~90°的树脂板或玻璃板，所述多孔质体（11）由细胞密度为5×10⁶~1 ×10⁸个细胞/ml的细胞悬液(12)充满，厚度为2~100mm，具有孔径为 180~3500μm、平均孔径为350~2000μm的连通的小孔结构，气孔率为 60~95%，压缩强度为0.05~lMPa，并且由生物体吸收性高分子材料构成； 然后，在从重力方向观察时保持板在多孔质体的上侧并且保持板的重 量不施加于多孔质体的状态下在气体中静止来接种细胞。

第二发明为一种组织再生材料(10)，其中，在多孔质体(11)中以5 ×10⁶~1×10⁸个细胞/ml的浓度接种有细胞(13)，所述多孔质体的厚度为 2~100mm，具有孔径为180~3500μm、平均孔径为350~2000μm的连通的 小孔结构，气孔率为60~95%，压缩强度为0.05~1MPa，并且由生物体 吸收性高分子材料构成。

第三发明为如第二发明所述的组织再生材料(10)，其中，多孔质体 (11)的气孔率为80~90%。

第四发明为如第二发明或第三发明所述的组织再生材料(10)，其 中，多孔质体(11)的平均孔径为540~1200μm。

第五发明为如第二发明至第四发明中任一项所述的组织再生材料 (10)，其中，多孔质体(11)中将会相接触地配置到保持板(1)上的表面即 底面的面积为0.5~200cm²。

发明效果

根据本发明，能够向具有较大的孔、即不易使细胞悬液保留在其 内侧的小孔的多孔质体中导入细胞悬液，并且能够稳定且不浪费地在 该多孔质体中接种细胞。

附图说明

图1是对组织再生材料的制作方法S10的步骤进行说明的图。

图2是对组织再生材料的制作方法S10的步骤进行说明的另一图。

图3是表示多孔质体的另一实施方式例的图。

图4是对组织再生材料的制作方法S20的步骤进行说明的图。

图5是对组织再生材料的制作方法S20的步骤进行说明的另一图。

标号说明

1保持板

2预载置板

10组织再生材料

11多孔质体

12细胞悬液

具体实施方式

通过接下来进行说明的具体实施方式来明确本发明的上述作用和 优势。以下，基于附图所示的实施方式对本发明进行说明。但是，本 发明并不限定于这些实施方式。

图1、图2是对一个实施方式的组织再生材料的制作方法S10(以下 有时记为“制作方法S10”)进行说明的图。图1、图2是表示制作方法 S10的步骤中的情形的图。在此，组织再生材料10是指接种有细胞的多 孔质体11。

制作方法S10具有载置步骤S11、细胞悬液导入步骤S12和翻转步骤 S13。

如图1(a)所示，载置步骤S11为在保持板1上载置多孔质体11的步 骤。

在此，保持板1优选为对于水的接触角为15°~90°的树脂板或玻璃 板。对于这种保持板1而言，可以通过将以往作为对细胞进行静置培养 的容器使用的培养皿、烧瓶、多孔板等中使用的玻璃材料或聚苯乙烯、 聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等树脂材料加工成板状后使用。这些 材料的疏水性高，因此，优选根据需要预先通过电晕、γ射线、氩射线 等的等离子体处理等化学方法对要使多孔质体11接触的表面导入极性 基团来提高亲水性，从而使对于水的接触角达到15°~90°。另外，可以 在所要接触的表面上形成陶瓷被膜。优选所要接触的表面是平滑的， 但也可以设置有高度为数百微米的凹槽或条状突起等。

多孔质体11由生物体吸收性高分子材料形成，并且厚度(在载置于 保持板1上的状态下的上下方向的尺寸)为2mm~100mm，优选为 2.1mm~70mm。多孔质体11具有孔径为180μm~3500μm、平均孔径为 350μm~2000μm的连通的小孔结构，气孔率为60%~95%。另外，以多孔 质体11的压缩强度达到0.05MPa~1MPa的方式构成。需要说明的是，本 发明中的多孔质体的孔的孔径是指在不考虑小于10μm这样的仅使液体 通过的微小气孔的情况下在整个多孔质体中10μm以上的气孔的80%以 上为孔径180μm~3500μm。需要说明的是，在此，“气孔率”为由相同 体积的多孔质体的重量相对于所使用的生物体吸收性高分子材料的原 料块的重量计算得到的值。

在此，气孔率小于60%时，细胞培养的效率降低，而超过95%时， 多孔质体的强度降低。因此，气孔率进一步优选为80%~90%。另外， 孔径小于180μm时，难以使细胞自由通过，从而无法将细胞充分地接种 到多孔质体的内部。另一方面，孔径大于3500μm时，多孔质体的强度 降低。

另外，平均孔径优选为540μm~1200μm。

关于上述压缩强度，压缩强度低于0.05MPa时，多孔质体会因添加 细胞悬液时的表面张力、培养细胞时受到的来自细胞悬液的细胞的伸 展应力而产生收缩。另一方面，制作超过1MPa的多孔质体在技术上来 说较困难。需要说明的是，在此，“压缩强度”是指将直径10mm×高 度2mm的圆柱形试验体以1mm/分钟的十字头速度压缩时的压缩断裂强 度。

关于多孔质体的厚度，由于是以使细胞悬液充分地渗透至多孔质 体的中心部作为目的，因此，使用厚度小于2mm的多孔质体的必要性 较小。另一方面，超过100mm时，难以导入细胞或者难以进行长时间 培养。

对于上述多孔质体的形状而言，如图1、图2所示基本上为立方体， 此外也优选半圆形或穹顶形，但只要能够如后所述经过翻转步骤S13后 在从重力方向观察时上述保持板1在上侧并且保持板1的重量不施加于 多孔质体的状态下在气体中静止来接种细胞则没有特别限定。例如如 图3所示可以为圆板状。

优选为此时的多孔质体的底面积(与保持板1相接触的表面的面积) 相对于厚度具有充分大小的面积的形状。具体而言，在多孔质体的体 积1cm³~50000cm³的范围内，底面积优选为0.5cm²~200cm²。小于0.5cm²或超过200cm²时，难以在悬挂于保持板上的状态下进行接种。需要说 明的是，可以在多孔质体的生物体吸收性高分子材料内分散粉末状磷 酸钙，例如羟基磷灰石或β-三磷酸钙。

构成多孔质体的材料为生物体吸收性高分子材料，只要能够在体 内维持其形态一定时间则可以没有特别限定地使用。可以例示例如选 自以往使用的聚乙醇酸、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚-ε-己内酯、 乳酸-ε-己内酯共聚物、聚氨基酸、聚原酸酯以及它们的共聚物中的至 少一种。其中，从被美国食品药品监督管理局(FDA)批准为对人体无害 的高分子及其实际效果的方面出发，最优选聚乙醇酸、聚乳酸、乳酸- 乙醇酸共聚物。生物体吸收性高分子材料的重均分子量优选为 5000~2000000，更优选为10000~500000。

多孔质体的制作方法没有特别限定，可以列举例如下述制作方法： 在将生物体吸收性高分子材料溶解于有机溶剂中而成的溶液中，大致 均匀地混合不溶于该有机溶剂、并且能够用不溶解生物体吸收性高分 子材料的液体溶解的、粒径为100μm~2000μm的粒状物质，并对其进行 冷冻。然后，进行干燥而除去有机溶剂，由此制作含有粒状物质的、 具有孔径为5μm~50μm的小孔结构的多孔质生物体吸收性高分子。然 后，将该多孔质生物体吸收性高分子用磨机等粉碎后，利用不溶解生 物体吸收性高分子的液体溶解粒状物质而除去，然后，过筛而得到平 均粒径为100μm~3000μm的生物体吸收性颗粒状多孔物质，将上述生物 体吸收性颗粒状多孔物质装入到预定形状的容器内，进行加压加热。

接下来对制作方法S10进行说明。通过载置步骤S11，形成保持板1 的表面上载置有多孔质体11的状态，接着，在细胞悬液导入步骤S12中， 如图1(b)所示，通过例如滴加或注入等方法向多孔质体11中导入细胞悬 液12。由此，如图2(a)所示，形成细胞悬液12渗透到多孔质体11内并且 多孔质体11由细胞悬液12完全充满的状态。此时，相对于多孔质体11 的体积，细胞悬液12的量过多时，存在后述的翻转步骤S13难以进行或 者培养的效率降低的趋势，因此，优选导入可浸透整个多孔质体11且 不从多孔质体11中过量漏出的量的细胞悬液。

导入的细胞悬液的细胞密度为5×10⁶个细胞/ml~1×10⁸个细胞 /ml。另外，被培养的细胞可以自由地使用各种细胞。可以使用例如： 表皮细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经细胞、神经胶质 细胞、星形胶质细胞、上皮细胞、乳房表皮细胞、胰岛细胞、内皮细 胞、间质细胞、真皮成纤维细胞、间皮细胞、造骨细胞、平滑肌细胞、 横纹肌细胞、韧带成纤维细胞、跟腱成纤维细胞和软骨细胞、骨髓细 胞、成骨细胞、牙胚细胞、牙周膜细胞、牙髓细胞、成体干细胞或ES 细胞等。

接着，通过翻转步骤S13，从图2(a)所示的状态翻转至保持板1在上 且含有细胞悬液12的多孔质体11在下而形成图2(b)所示的状态。即，在 从重力方向观察时保持板1在多孔质体11的上侧并且保持板1的重量不 施加于多孔质体11的状态下在气体中静止。在该状态下维持静止，使 导入的细胞贴附到多孔质体11的孔的内壁上而完成接种，从而形成组 织再生材料10。为了使细胞贴附到多孔质体上而在气体中静止的时间 根据多孔质体的材质、细胞的种类而不同，一般为20分钟~300分钟。

根据如上所述的制作方法S10，由于多孔质体11具有较大的孔，因 此能够使细胞悬液适度地渗透至多孔质体11的内部。而且，通过如上 所述在从重力方向观察时保持板1在多孔质体11的上侧并且保持板1的 重量不施加于多孔质体11的状态下在气体中静止，能够最终以细胞悬 液12不从多孔质体11中漏出的方式保持细胞悬液。于是，能够稳定且 不浪费地导入细胞悬液12而将细胞接种到多孔质体中。之后，接种有 细胞的多孔质体即组织再生材料10可以通过现有的方法来进行细胞培 养。

另外，为了实现上述制作方法，优选使用如上所述的接种有细胞 悬液的多孔质体。由此，能够制成可实现上述效果的组织再生材料。

图4、图5是对另一实施方式的组织再生材料的制作方法S20(以下 有时记为“制作方法S20”)进行说明的图。图4、图5是表示制作方法 S20的步骤中的情形的图。需要说明的是，本实施方式中，对与上述实 施方式中已说明的部分共通的部分标记相同标号并省略说明。

制作方法S20具有预载置步骤S21、细胞悬液导入步骤S22、夹持步 骤S23和保持步骤S24。

预载置步骤S21为在拒水性高的板状构件即预载置板2上载置多孔 质体11的步骤。预载置板2优选为对于水的接触角大于90°的树脂板或玻 璃板。

细胞悬液导入步骤S22与上述细胞悬液导入步骤S12一样，向多孔 质体11导入细胞悬液12。由此，如图4(b)所示，形成细胞悬液12渗透而 充满整个多孔质体11的状态。

如图5(a)所示，夹持步骤S23为以将由细胞悬液充满的多孔质体11 夹在保持板1与预载置板2之间的方式使多孔质体11与保持板1的表面 相接触的步骤。

如图5(b)所示，保持步骤S24为将与多孔质体11相接触的保持板1 向上提起而使多孔质体11保持在保持板1侧并从预载置板2上脱离的步 骤。由此，多孔质体11与上述实施方式同样地在从重力方向观察时保 持板1在多孔质体11的上侧并且保持板1的重量不施加于多孔质体11的 状态下在气体中静止。在该状态下维持静止，使导入的细胞贴附到多 孔质体11的内壁上而完成接种，从而形成组织再生材料10。

在此，预载置板2由具有拒水性的板构成，保持板1由具有亲水性 的板构成，因此，能够适当进行由细胞悬液充满的多孔质体的如上所 述的保持、脱离。

实施例

以下，通过实施例对本发明更具体地进行说明，但本发明并不受 这些实施例的限定。

<移植细胞的准备>

移植细胞A：从人髂骨骨髓液中提取的间质干细胞

将从人髂骨骨髓液中提取的细胞用10%FBS、DMEM培养基混悬， 然后，以有核细胞数为1×10⁵个细胞/10cm直径的培养皿进行接种。在 37℃下、在5%二氧化碳存在下进行培养。在第3天更换培养基，并除去 非贴壁细胞(造血系细胞)。之后，每3天更换一次培养基。从第5天开始 以3ng/m1向培养基中添加bFGF。10天左右增殖至大致铺满的程度。将 上述培养皿用胰蛋白酶(0.05%)＋EDTA(0.2mM)孵育5分钟，分离出细 胞。用Coulter计数仪(Z1シングル，库尔特公司制造)计测细胞数，以5000 个细胞/cm²的密度接种细胞。重复该操作，使用从达到大致铺满(コン フルエント)的程度的第二代传代培养皿中得到的第三代细胞。

移植细胞B：从人颚骨骨髓液中提取的间质干细胞

将从人颚骨骨髓液中提取的细胞用10%FBS、DMEM培养基混悬， 然后，以有核细胞数为1×10⁵个细胞/10cm直径的培养皿进行接种。在 37℃下、在5%二氧化碳存在下进行培养。在第3天更换培养基，并除去 非贴壁细胞(造血系细胞)。之后，每3天更换一次培养基。从第5天开始 以3ng/m1向培养基中添加bFGF。10天左右增殖至大致铺满的程度。将 上述培养皿用胰蛋白酶(0.05%)＋EDTA(0.2mM)孵育5分钟，分离出细 胞。用Coulter计数仪(Z1シングル，库尔特公司制造)计测细胞数，以5000 个细胞/cm²的密度接种细胞。重复该操作，重复该操作，使用从达到大 致铺满(コンフルエント)的程度的第二代传代培养皿中得到的第三代 细胞。

移植细胞C：从人耳廓软骨中提取的软骨细胞

用手术刀将人耳廓软骨细细切碎，用胶原酶在37℃下处理30分钟 而得到细胞悬液，将该悬液用10%FBS、DMEM培养基混悬，然后，以 有核细胞数为1×10⁵个细胞/10cm直径的培养皿进行接种。在37℃下、 在5%二氧化碳存在下进行培养。在第3天更换培养基，并除去非贴壁成 分(细胞＋组织片)。之后，每3天更换一次培养基。从第5天开始以3ng/m1 向培养基中添加bFGF。10天左右增殖至大致铺满的程度。将上述培养 皿用胰蛋白酶(0.05%)＋EDTA(0.2mM)孵育5分钟，分离出细胞。用 Coulter计数仪(Z1シングル，库尔特公司制造)计测细胞数，以5000个细 胞/cm²的密度接种细胞。重复该操作，使用从达到大致铺满(コンフル エント)的程度的第二代传代培养皿中得到的第三代细胞。

<多孔质体的准备>

多孔质体A：聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)块

使分子量为250000的DL-乳酸/乙醇酸共聚物溶解在二烷中，然 后，与粒径约为500μm的氯化钠混合，并冷冻干燥，粉碎并脱盐，将由 此得到粉末状材料压缩加热成形，由此，制作平均孔径为540μm、气孔 率为90%、压缩强度为0.2MPa、直径为9mm且厚度为3mm的由生物体 吸收性合成高分子构成的块状多孔质体。

多孔质体B：聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)块

使分子量为250000的DL-乳酸/乙醇酸共聚物溶解在二烷中，然 后，使粒径为10μm的羟基磷灰石粉分散，与粒径约为500μm的氯化钠 混合，并冷冻干燥，粉碎并脱盐，将由此得到粉末状材料压缩加热成 形，由此，制作平均孔径为540μm、气孔率为90%、压缩强度为0.2MPa、 直径为13mm且厚度为5mm的由生物体吸收性合成高分子和磷酸钙材 料构成的块状多孔质体。

<实施例1>

使多孔质体A的圆盘状底面与玻璃板(尺寸为100mm×100mm× 2mm，相对于水的接触角为28°)的上表面接触而载置。将在软骨分化用 培养液(αMEM、葡萄糖4.5mg/ml、10^-7M地塞米松、50μg/ml的抗坏血酸 -2-磷酸、10ng/ml的TGF-β、6.25μg/ml的胰岛素、6.25μg/ml的转铁蛋白、 6.25ng/ml的硒酸、5.33μg/ml的亚油酸、1.25mg/m1的牛血清白蛋白)中 以2×10⁷个细胞/m1的密度混悬而得到的0.19m1的移植细胞A滴加到多 孔质体A中来进行导入。在将玻璃板翻转而呈倒置的状态下，在37℃、 湿度为100%、5%CO₂的条件下用30分钟使细胞贴附到材料上，由此将 细胞接种到多孔质体A上，得到组织再生材料。

然后，装入到充满软骨分化用培养液的50ml离心管中，在37℃下 每3天更换一次培养基来培养4周，制作了软骨组织再生用细胞移植体。

<实施例2>

使多孔质体B的圆盘状底面与等离子体处理聚苯乙烯板(尺寸为 50mm×50mm×2mm，相对于水的接触角为71°)的上表面接触而载置。 将在骨分化用培养液(αMEM、葡萄糖4.5mg/ml、10%的FBS、10^-7M地 塞米松、50μg/ml的抗坏血酸-2-磷酸、10mM的β-甘油磷酸)中以5×10⁷个细胞/m1的密度混悬而得到的0.67ml的移植细胞B滴加到多孔质体B 中来进行导入。在将等离子体处理聚苯乙烯板翻转而呈倒置的状态下， 在37℃、湿度为100%、5%CO₂的条件下用100分钟使细胞贴附到材料上， 由此将细胞接种到多孔质体B上，得到组织再生材料。

然后，装入到充满骨分化用培养液的50ml离心管中，在37℃下每3 天更换一次培养基来培养2周，制作了骨组织再生用细胞移植体。

<实施例3>

使多孔质体B的圆盘状底面与等离子体处理丙烯酸板(尺寸为 50mm×50mm×2mm，相对于水的接触角为58°)的上表面接触而载置。 将在软骨分化用培养液(αMEM、葡萄糖4.5mg/ml、10^-7M地塞米松、 50μg/ml的抗坏血酸-2-磷酸、10ng/ml的TGF-β、6.25μg/ml的胰岛素、 6.25μg/ml的转铁蛋白、6.25ng/ml的硒酸、5.33μg/ml的亚油酸、 1.25mg/m1的牛血清白蛋白)中以2×10⁷个细胞/m1的密度混悬而得到的 0.67ml的移植细胞C滴加到多孔质体B中来进行导入。在将等离子体处 理丙烯酸板翻转而呈倒置的状态下，在37℃、湿度为100%、5%CO₂的 条件下用30分钟使细胞贴附到材料上，由此将细胞接种到多孔质体B 上，得到组织再生材料。

然后，装入到充满软骨分化用培养液的50ml离心管中，在37℃下 每3天更换一次培养基来培养4周，制作了软骨组织再生用细胞移植体。

<实施例4>

将多孔质体A放置到拒水处理后的玻璃板(尺寸为50mm×50mm× 2mm，相对于水的接触角为114°)上。将在骨分化用培养液(αMEM、葡 萄糖4.5mg/ml、10%的FBS、10^-7M地塞米松、50μg/ml的抗坏血酸-2-磷 酸、10mM的β甘油磷酸)中以5×10⁷个细胞/m1的密度混悬而得到的 0.19ml的移植细胞B滴加到多孔质体A中来进行导入。自放置有多孔质 体A的玻璃板的上方平稳地放下等离子体处理聚苯乙烯板(尺寸为 50mm×50mm×2mm，相对于水的接触角为71°)，从而以轻轻地夹持的 方式使多孔质体A与等离子体处理聚苯乙烯板面接触。将接触后的等离 子体处理聚苯乙烯板慢慢向上提拉，使多孔质体A保持在等离子体处理 聚苯乙烯板侧并从玻璃板上脱离。使多孔质体A在从重力方向观察时等 离子体处理聚苯乙烯板为上侧并且等离子体处理聚苯乙烯板的重量不 施加于多孔质体A的状态下在气体中静止，并在倒置的状态下在37℃、 湿度为100%、5%CO₂的条件下用100分钟使细胞贴附到材料上，由此将 细胞接种到多孔质体A上，得到组织再生材料。

然后，装入到充满骨分化用培养液的50ml离心管中，在37℃下 每3天更换一次培养基来培养2周，制作了骨组织再生用细胞移植体。