机械-酶消化法制备大鼠膈肌单细胞悬液的最佳消化酶浓度组合筛选

摘要

目的使用不同浓度消化酶制备大鼠膈肌单细胞悬液,筛选最佳消化酶浓度组合。方法将胰蛋白酶稀释为0.125%、0.250%、0.375%、0.500%、0.625%,胶原酶Ⅰ型稀释为0.050%、0.100%、0.150%、0.200%、0.250%,胶原酶Ⅳ型稀释为0.050%、0.100%、0.150%、0.200%、0.250%,将三种消化酶按照浓度从低到高依次组合为五个浓度组,即胰蛋白酶0.125%+胶原酶Ⅰ0.050%+胶原酶Ⅳ0.050%、胰蛋白酶0.250%+胶原酶Ⅰ0.100%+胶原酶Ⅳ0.100%、胰蛋白酶0.375%+胶原酶Ⅰ0.150%+胶原酶Ⅳ0.150%、胰蛋白酶0.500%+胶原酶Ⅰ0.200%+胶原酶Ⅳ0.200%、胰蛋白酶0.625%+胶原酶Ⅰ0.250%+胶原酶Ⅳ0.250%。取SD大鼠新鲜膈肌组织,分成A、B、C、D、E组,采用机械—酶消化法制备膈肌单细胞悬液,分别加入上述五种浓度组合的消化酶进行消化;另设对照组,加入等量PBS。单细胞悬液经台盼蓝染色,观察悬液中细胞的形态,计数活细胞数、死细胞数、细胞团块数,计算细胞存活率和单细胞悬液浓度;经Anti-RatCD11b PE标记后进行流式细胞术检测,获得目标细胞比值,比较各组检测结果。结果A~E组获得的活细胞数分别为156.00×10^(5)、200.92×10^(5)、182.08×10^(5)、160.00×10^(5)、140.02×10^(5)/mL,细胞存活率分别为87.01%、90.02%、91.86%、90.75%、86.94%,单细胞悬液浓度分别为19.50×10^(5)、30.25×10^(5)、22.75×10^(5)、20.00×10^(5)、17.50×10^(5)/mL,均高于对照组(P均<0.05),其中B、C组活细胞数量和单细胞悬液浓度高于其他三组(P均<0.05)。经CD11b标记后,C组D11b阳性的中性粒细胞数、CD11b阳性细胞占活细胞的百分比均高于其他各组(P均<0.05)。结论采用机械—酶消化法制备大鼠膈肌单细胞悬液,不同消化酶浓度组合均能获得优质的单细胞悬液,其中以胰蛋白酶0.375%+胶原酶Ⅰ0.150%+胶原酶Ⅳ0.150%获得的单细胞悬液细胞存活率最高、死细胞数最少。