胰岛素样生长因子1受体α亚单位基因重组真核表达质粒的构建

摘要

目的 构建编码胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)α亚单位基因的重组真核表达质粒.方法 根据GenBank中人IGF-1Rα亚单位基因编码序列设计并合成引物,用TRIzol一步法从Graves病患者甲状腺组织中提取总RNA,逆转录成cDNA并将其作为模板,PCR扩增获得IGF-1Rα亚单位编码基因片段.胶回收纯化后再与pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO载体通过拓扑克隆连接,用热休克法将重组质粒转入大肠杆菌,在含有氨苄青霉素培养基中筛选阳性克隆.用碱裂解法提取IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO真核表达质粒,并对其进行PCR、限制性内切酶(HindⅢ、BamHⅠ、ScaⅠ)消化、DNA测序分析等鉴定.结果 Graves病患者甲状腺组织中总RNA OD260/OD280为1.8～2.0,纯度较好且结构完整.经逆转录、PCR扩增出2679 bp的目的基因片段.挑取3个阳性克隆菌落提取质粒,PCR均扩增出目的片段;单酶切、双酶切后均得到相应长度的酶切产物,证明重组质粒中含有IGF-1Rα单位基因序列.经进一步测序、序列比对分析,重组质粒中的IGF-1Rα序列与NCBI公布序列完全一致,与载体接口连接无误,IGF-1Rα亚单位基因翻译读码框架正确.结论 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重组真核表达质粒构建并鉴定成功.