叶酸缺乏的小鼠胚胎干细胞ES-D3中miR-302a、Bcl2L11表达观察及其靶向关系预测和验证

摘要

目的 观察叶酸缺乏的小鼠胚胎干细胞系ES-D3中微小RNA302a(miR-302a)、Bcl2L11的表达变化,并对miR-302a与Bcl2L11的靶向关系进行预测和验证.方法 取适量ES-D3细胞,置于缺乏叶酸的培养液中培养,分别于培养0、24、48、72 h(A、B、C、D组)时收集细胞,实时荧光定量PCR法检测miR-302a、Bcl2L11 mRNA,Western blotting法检测细胞Bcl2L11蛋白(BimEL、BimL及BimS蛋白).生物信息学软件预测Bcl2L11与miR-302a的靶向结合位点.以小鼠3T3细胞基因组DNA为模板,设计3'UTR扩增引物,PCR扩增基因的3 'UTR序列,将其克隆到pmiR-RB-REPORT双荧光素酶报告载体中,构建Bcl2L11-3 'UTR野生载体;设计突变引物将靶标序列突变,构建突变载体,miRNA-302a mimics及Negative Control分别与Bcl2L113'UTR双报告基因野生载体及突变载体共转染,分别为1组(Bcl2L113 'UTR野生型载体+Negative Control)、2组(Bcl2L113'UTR野生型载体+miR-302a mimics)、3组(Bcl2L113 'UTR突变型载体+Negative Control)、4组(Bcl2L113'UTR突变型载体+miR-302a mimics),转染后测算各组报告基因hRluc的相对荧光值,验证miR-302a与Bcl2L11是否存在相互作用.结果 A、B、C、D组细胞miR-302a相对表达量分别为1.00±0.20、0.65±0.32、0.50±0.22、0.43±0.24,与A组比较,D组miR-302a相对表达量下降(P＜0.05);A、B、C、D组细胞Bcl2L11 mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、1.22±0.19、1.82±0.37、3.49±0.45,与A组比较,D组Bcl2L11 mRNA相对表达量升高(P＜0.05);A、B、C、D组细胞BimEL相对表达量分别为0.86±0.02、0.87±0.03、0.92±0.02、1.10±0.06,与A组比较,C、D组BimEL相对表达量升高(P＜0.05);A、B、C、D组细胞BimL相对表达量分别为0、0.09±0.02、0.16±0.04、0.26±0.03,与A组比较,B、C、D组BimL相对表达量升高(P＜0.05);A、B、C、D组细胞BimS相对表达量分别为0、0、0.11 ±0.04、0.18 ±0.04,与A组比较,C、D组BimS相对表达量升高(P＜0.05).miR-302a和Bcl2L11存在相互作用.1、2、3、4组报告基因hRluc的相对荧光值分别为1.00±0.07、0.64±0.02、1.00±0.03、0.95±0.06,与其他组比较,2组相对荧光值降低(P＜0.05).结论 叶酸缺乏的ES-D3细胞中miR-302a表达下调、Bcl2L11 mRNA及蛋白表达上调.miR-302a与Bcl2L11基因有较强的相互作用,胚胎干细胞凋亡过程中Bcl2L11为miR-302a的靶基因.