pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体的构建及体外表达

摘要

目的 构建毕氏酵母表达载体pPIC9K/Ang-1,并进行体外表达研究.方法 从PGEM-T/Ang-1载体中切取目的 片段Ang-1,利用定向克隆到毕氏酵母表达载体pPIC9K中,测序正确后, pPIC9K/Ang-1载体经SalⅠ酶切线形化,以电转化法导入GS115毕氏酵母菌株中,经YPD平板G418抗性筛选后获得Ang-1表达阳性菌株;用SDS-PAGE测定其分子量,用Western Blotting检测发酵上清中Ang-1的抗原性和表达量.结果 成功切取1.5 kb的Ang-1片段,成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,Blast序列分析与GenBank中AY121504一致.酶切线性化的质粒成功转入GS115毕氏酵母中,诱导表达后SDS-PAGE显示重组人Ang-1分子量约66 kD,Western Blotting证实为人Ang-1.结论 成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,成功获得稳定分泌Ang-1重组蛋白的基因工程菌株.