人基质金属蛋白酶9－PEX 基因慢病毒载体的构建

摘要

目的：构建人基质金属蛋白酶9（MMP－9）－PEX基因慢病毒载体。方法经RT－PCR、基因重组等技术构建包含MMP－9－PEX、MMP－9信号肽的慢病毒表达载体pBPLV－sPEX9，利用慢病毒四质粒包装系统、脂质体法共转染293FT细胞，包装出重组慢病毒。根据表达载体pBPLV携带signal－PEX9基因与否，分为空载体组和PEX组。慢病毒感染293FT细胞后，荧光显微镜下观察两组慢病毒载体绿色荧光蛋白（GFP）发光情况、Western blotting法验证MMP－9－PEX在293FT细胞上清中的表达。结果构建的pcDNA3．1－sPEX9重组质粒（669 bp）测序鉴定结果与GenBank序列完全一致，说明质粒构建成功。 sPEX9片段与pBPLV连接重组质粒双酶切，凝胶电泳可见约1284 bp的酶切片段，与预期理论值相符，说明慢病毒表达载体pBPLV－sPEX9构建成功。空载体组和PEX组转染293FT细胞72 h，均可见较强绿色荧光，并有大量合胞体出现，说明包装慢病毒成功；多次传代培养后，仍可见很强绿色荧光，提示MMP－9－PEX基因已稳定整合入293FT细胞基因组内。 PEX组293FT细胞上清液检测到28 kD蛋白条带，与预计PEX分泌型蛋白分子量符合，空载体组未发现相应条带。结论本研究成功构建了携带人MMP－9－PEX基因的慢病毒，并将MMP－9－PEX基因高效导入了靶细胞，使之成功分泌出PEX蛋白。