锌指蛋白ZBTB20敲低的血管平滑肌细胞稳转株的构建及鉴定

摘要

目的构建并鉴定锌指蛋白ZBTB20敲低的血管平滑肌细胞稳转株。方法本实验时间为2022-04-18至2022-11-29。设计合成针对ZBTB20基因的短发夹RNA(shRNA),构建ZBTB20干扰慢病毒载体——pHBLVZBTB20 shRNA,包装ZBTB20干扰慢病毒。将人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)接种于6 cm培养皿中,分别加入含8μg/ml polybrene和0.5 ml ZBTB20干扰慢病毒上清液的无血清培养液3 ml(实验组)和含8μg/ml polybrene和0.5 ml含无意义干扰序列的慢病毒的无血清培养液3 ml(阴性对照组)进行转染,48 h后加入嘌呤霉素(优化剂量为1.5μg/ml)以筛选转染成功的HPASMCs。采用荧光定量PCR检测两组ZBTB20 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测两组ZBTB20,采用免疫组化试验检测两组ZBTB20表达情况,并进行细胞增殖实验和细胞迁移实验。结果实验组ZBTB20 mRNA相对表达量、ZBTB20均低于阴性对照组(P<0.05)。免疫组化试验结果显示,ZBTB20在阴性对照组的细胞核内高度表达,而在实验组的细胞核内无明显表达,表明ZBTB20敲低的血管平滑肌细胞稳转株构建成功。感染后第2~5天,实验组细胞计数少于对照组,OD值低于阴性对照组(P<0.05)。感染后48 h,实验组划痕愈合面积百分比低于阴性对照组(P<0.05)。结论本实验成功构建了锌指蛋白ZBTB20敲低的血管平滑肌细胞稳转株,且ZBTB20敲低后HPASMCs的增殖和迁移能力明显受到抑制。