胰岛素样生长因子-1与血小板源生长因子-AA以及肿瘤生长因子β1基因克隆及其在腺病毒载体中的表达

摘要

目的从正常的人体成骨细胞中克隆IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1三因子的编码蛋白基因,构建上述因子基因的高效表达重组腺病毒,旨在为基因治疗研究提供有效的工具.方法培养正常人体成骨细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR方法获得IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1的编码基因.将这些片段克隆到高效表达腺病毒载体Adeno-X,并经过HEK293细胞的包装,获得成熟的重组腺病毒.Western 印迹法检测上述三因子的表达.利用成熟重组腺病毒感染成骨细胞,检测细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性的改变.结果重组T载体、重组腺病毒DNA和成熟的重组腺病毒体中均可得到IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1基因的PCR片段.Western印迹检测到上述3种因子蛋白质的表达.当携带上述3种因子的重组腺病毒感染成骨细胞后,细胞增殖明显增强,ALP活性明显提高.结论本实验构建的IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1因子的高效表达重组腺病毒可以在人体细胞中表达出具有生物活性的蛋白质,获得了较好的基因工具.