蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导PC12细胞凋亡以及半胱氨酸蛋白水解酶3活化的实验研究

摘要

目的探讨蛋白酶体功能缺陷是否能诱导多巴胺能细胞发生凋亡及其可能的作用机理.方法应用高选择性的蛋白酶体抑制剂lactacystin(0、1 μmol/L、5 μmol/l或10 μmol/L)处理大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞株24 h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力的改变.10 μmol/L lactacystin作用24 h后,Hoechst荧光染色观察凋亡细胞的核形态学改变,流式细胞仪测定细胞凋亡百分率.用Western印迹法检测10 μmol/L lactacystin作用0、24或48 h时PC12细胞内半胱氨酸蛋白水解酶3活化片段的动态变化.结果 5 μmol/L 或10 μmol/L lactacystin作用24 h后,PC12细胞的活力(87%±6%和26%±6%)显著低于对照组( P <0.05).Hoechst荧光染色显示10 μmol/L lactacystin作用24 h后部分细胞呈现凋亡细胞核形态学改变;流式细胞仪证实31.4%±4.0%的PC12细胞发生了凋亡,与对照组(7.5%±0.8%)比较差异有统计学意义( P <0.01).Western印迹法显示对照组细胞内仅有极少量的半胱氨酸蛋白水解酶3活化片段表达;10 μmol/L lactacystin作用48 h的PC12细胞内半胱氨酸蛋白水解酶3活化片段的表达明显较多.结论蛋白酶体抑制剂lactacystin能诱导多巴胺能细胞PC12发生凋亡,半胱氨酸蛋白水解酶3蛋白酶的激活可能参与lactacystin诱导的PC12细胞凋亡过程;蛋白酶体的功能缺陷在帕金森病发病机制中可能发挥重要作用.