双重实时荧光逆转录聚合酶链反应检测尿液DD3/PSA mRNA比值及其应用

摘要

目的建立双重实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测尿液 DD3/PSA mRNA比值,评价其初步应用。方法分别在前列腺特异性抗原（PSA）基因外显子1和2、差异显示编码3（DD3）基因外显子1和3之间设计一对引物和一条探针,PSA 和 DD3基因的 TaqMan-MGB 探针5′分别标记 HEX 和 FAM 荧光素,建立双重实时荧光 RT-PCR 检测尿液 DD3/PSA mRNA 比值的方法,并对方法学进行评价。对34例前列腺癌（Pca）、44例良性前列腺增生（BPH）患者前列腺按摩后尿液中的DD3/PSA mRNA 比值进行检测,评价其临床应用价值。结果扩增产物经测序证明为 PSA 和 DD3特异性片段。以 LNCaP 细胞 cDNA 作模板,PSA mRNA 和 DD3 mRNA 最低检测限分别为0.6细胞/反应和60细胞/反应。DD3/PSA mRNA 比值批内、批间变异系数分别为3.8%～4.7%和4.1%～4.9%。PCa 组尿液 DD3/PSA mRNA 比值明显高于 BPH 组（P＜0.01）。尿液 DD3/PSA mRNA 比值诊断 PCa 的 ROC 曲线下面积（AUC）为0.746（95%CI:0.630～0.862）,当截断值为0.254时其敏感度和特异度分别为64.7%和77.3%,其阳性率与临床和病理分级均无关。结论成功建立了双重实时荧光 RT-PCR 检测尿液 DD3/PSA mRNA 比值的分子生物学诊断方法。该方法对 PCa 诊断具有较高特异度和敏感度,且节省操作时间、降低实验成本,有望成为 PCa 早期诊断的有效方法。