靶向C基因的shRNA抗乙型肝炎病毒在BHK-21细胞中的复制与表达

摘要

目的研究靶向乙型肝炎病毒（HBV）C基因的shRNA（shRNA）诱导RNAi（RNAi）在BHK-21细胞中抑制HBV的复制与表达及抗病毒效果。方法根据成都军区昆明总医院传染病中心克隆测序的中国56个民族CHB患者HBV基因组（基因型B属ayw1亚型）已在GenBank登录注册:CYN/2002和CYN/2000（GenBank登录号AY517488,AY517489,等）,为了监测siRNA功能提供报告基因系统,将HBV C基因PCR产物克隆构建成报告基因表达载体pC-EGFP-N1和载体pCDNA3.1B（-）,设计并构建两个靶向同源（CYN/2002和CYN/2000）毒株HBV C基因的长24核苷酸（nt）的shRNA表达质粒（S1和S2）,随机设计的用于对照的非同源长24 nt的shRNA表达质粒S3,将其克隆到载体pU6上,构建成表达目的shRNA重组表达载体,并与pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞。首先在BHK-21细胞中使用BH-2型荧光显微镜观察和FACS.440型流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（EGFP）表达细胞数量,评估该shRNA表达质粒在转染后不同时间对C基因/EGFP融合报告基因表达的抑制作用,接着在BHK-21细胞中通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）进一步检验了shRNA抗病毒效果。结果通过BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测,发现在shRNA表达质粒和pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞24 h后,与pC-EGFP-N1或pEGFP-N1单质粒转染相比,S1或S2的共转染组、S1+S2的共转染组使EGFP的表达水平降低了90%,而对照质粒S3或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达水平,差异有统计学意义（P＜0.01）;应用RT-PCR检测C基因mRNA和EGFP基因mRNA的表达量,结果与BH-2型荧光显微镜和FACS-440型流式细胞仪检测结果相吻合,差异有统计学意义（P＜0.01）。进一步证实了RNAi抗病毒效果,抗病毒效应持续时间超过48 h。结果发现,创建的靶向C基因的shRNA能够有效特异地抗C-EGFP基因在BHK-21细胞中的复制与表达。结论靶向C基因的RNAi技术能够有效特异地抗HBV在BHK-21细胞中的复制与表达。RNAi可能成为抗重大传染病HBV/HCV安全有效的应急疫苗。