梨果黑斑病菌AaCaMK基因克隆、生物信息学分析及其在侵染结构分化中的表达分析

摘要

[背景]钙/钙调素依赖型蛋白激酶(Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase,CaMK)是真核生物细胞钙信号途径中钙调素下游的一类重要靶蛋白,对病原物生长、胁迫响应及致病性等具有重要的调控作用.[目的]对梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata) AaCaMK基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在侵染结构分化过程中的基因表达情况进行分析,为进一步研究梨果黑斑病菌钙离子信号途径中AaCaMK对A.alternata侵染结构分化调控的分子机制提供一定的理论依据.[方法]采用同源克隆法从A.alternata JT-03中克隆得到3个AaCaMK基因;通过TMHMM、ProtScale、SOPMA等软件对AaCaMK基因进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析AaCaMK在梨果黑斑病菌侵染结构分化过程中的表达情况.[结果]克隆得到片段分别为1212、1200、2349 bp的AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3基因;生物信息学分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3均含有典型的蛋白激酶超家族催化结构域(PKC_Like Superfamily),并且AaCaMK1和AaCaMK2共同含有CaMK类丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(STKc_CaMK),AaCaMK3含有LKB 1/CaMKK类丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(STKc_LKB 1_CaMKK);同源性分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3分别与玉米大斑病菌CAK1、CAK2和CAK3的相似性高达94.32％、97.49％和86.57％;RT-qPCR分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3在疏水及果蜡诱导A.alternata侵染结构分化过程中均显著上调表达(P＜0.05),而且果蜡诱导作用更显著.其中AaCaMK1和AaCaMK2在附着胞形成时期(6 h)表达量为对照的1.51倍和3.05倍,而AaCaMK3在侵染菌丝形成阶段(8 h)表达量最高,为对照的2.86倍,并且在果蜡诱导下,这3个基因在芽管伸长阶段(4 h)的上调表达量显著高于疏水界面.[结论]钙信号中AaCaMK基因在疏水及果蜡诱导A.alternata侵染结构分化过程中发挥重要的调控作用.