人巨细胞病毒cDNA文库的构建、鉴定及pp65阳性克隆筛选

摘要

为进一步进行人巨细胞病毒(HCMV)后基因组功能的研究,以及为疫苗分子和早期诊断试剂的研制提供有效工具,从HCMV AD169株感染96h的HF细胞中提取HCMV的mRNA,逆转录合成cDNA片段,重组入λgt11 EcoR I酶切位点之间,包装蛋白包装,构建HCMV AD169株基因组cDNA表达文库.结果表明,初始HCMV cDNA文库容量为3.6×106,重组率为96%;HCMV鼠多克隆抗血清筛选出168个HCMV阳性克隆;地高辛标记pp65特异性寡核苷酸探针原位噬斑杂交筛选出34个pp65阳性克隆,再经PCR扩增,筛选出2个pp65阳性克隆;pp65 PCR扩增产物进一步被Southern blotting证实;3'端测序比较,同源性为98%.为进一步克隆、表达该基因及其产物功能研究奠定基础.